Summary
Nous présentons une méthode d’étude de la rediffusion des cellules tumorales à partir de métastases pulmonaires impliquant un protocole chirurgical de photoconversion sélective des métastases pulmonaires, suivi de l’identification des cellules tumorales redisséminées dans les organes tertiaires.
Abstract
Les métastases, c’est-à-dire la propagation systémique du cancer, sont la principale cause de décès liés au cancer. Bien que les métastases soient généralement considérées comme un processus unidirectionnel dans lequel les cellules de la tumeur primaire disséminent et ensemencent les métastases, les cellules tumorales des métastases existantes peuvent également se dissémineret donner naissance à de nouvelles lésions dans les sites tertiaires dans un processus connu sous le nom de « métastases à partir de métastases » ou « ensemencement de métastases à métastases ». L’ensemencement de métastase à métastase peut augmenter la charge métastatique et diminuer la qualité de vie et la survie du patient. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les processus à l’origine de ce phénomène afin d’affiner les stratégies de traitement des patients atteints d’un cancer métastatique.
On sait peu de choses sur l’ensemencement de métastases à métastases, en partie à cause des limites logistiques et technologiques. Les études sur l’ensemencement de métastases à métastases reposent principalement sur des méthodes de séquençage, ce qui peut ne pas être pratique pour les chercheurs qui étudient le moment exact des événements d’ensemencement de métastase à métastase ou ce qui les favorise ou les prévient. Cela met en évidence le manque de méthodologies qui facilitent l’étude de l’ensemencement de métastase à métastase. Pour y remédier, nous avons développé - et décrivons ici - un protocole chirurgical murin pour la photoconversion sélective des métastases pulmonaires, permettant un marquage spécifique et un suivi du devenir des cellules tumorales qui se rediffusent du poumon vers les sites tertiaires. À notre connaissance, il s’agit de la seule méthode d’étude de la rediffusion des cellules tumorales et de l’ensemencement de métastases à métastases à partir des poumons qui ne nécessite pas d’analyse génomique.
Introduction
Les métastases sont la principale cause de décès liés au cancer1. Le cancer métastatique survient lorsque les cellules de la tumeur primitive se dispersent dans tout le corps et prolifèrent en tumeurs cliniquement détectables dans des organes distants 2,3.
Bien que les métastases soient généralement considérées comme un processus unidirectionnel dans lequel les cellules tumorales se disséminent à partir de la tumeur primaire et colonisent des organes distants4, l’augmentation des preuves cliniques et expérimentales suggère qu’un processus multidirectionnel plus complexe est en jeu. Il a été démontré que les cellules tumorales circulantes peuvent réensemencer la tumeur primaire (si elle est encore en place)5,6,7,8,9, et que les cellules tumorales des foyers métastatiques existants peuvent se déplacer vers les sites tertiaires et donner lieu à de nouvelles lésions 10,11,12,13. En effet, les résultats d’analyses génomiques récentes suggèrent que certaines lésions métastatiques ne proviennent pas de la tumeur primitive, mais d’autres métastases, un phénomène connu sous le nom de « métastases à partir de métastases » ou « ensemencement de métastases à métastases »14,15,16. L’ensemencement de métastase à métastase peut perpétuer le processus pathologique même après l’ablation de la tumeur primitive, augmentant ainsi la charge métastatique et diminuant la qualité de vie et la survie du patient. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les processus qui sous-tendent l’ensemencement de métastases à métastases afin d’affiner les stratégies de traitement pour les patients atteints d’une maladie métastatique.
Malgré les implications cliniques potentiellement graves, on sait peu de choses sur l’ensemencement de métastase à métastase, en partie en raison de limitations logistiques et technologiques. Les études humaines sont limitées par la rareté des échantillons cliniques. La résection clinique et la biopsie des lésions métastatiques sont rares, tout comme la biopsie d’organes apparemment sains, où des cellules tumorales disséminées peuvent se cacher. Cela signifie que les études humaines ne sont généralement possibles qu’à l’aide d’échantillons d’autopsie d’individus dont les tumeurs primaires sont toujours en place ou ont déjà été réséquées mais sont toujours disponibles pour les chercheurs. Lorsque de tels échantillons sont disponibles, des analyses de lignées de la progression du cancer doivent être effectuées à l’aide de méthodes de séquençage14. Cependant, le séquençage en masse des tumeurs primaires et des métastases appariées n’a pas la sensibilité nécessaire pour un traçage complet de la lignée. Par exemple, le séquençage en vrac d’une lésion peut révéler un sous-clone qui est indétectable dans l’une de ses lésions correspondantes. Dans ce cas, il serait impossible de déterminer l’origine de ce sous-clone. Il peut avoir été présent dans la tumeur primitive ou une autre métastase à une fréquence inférieure à la limite de détection, ou il peut être apparu après la colonisation initiale de la lésion métastatique dans laquelle il a été trouvé. Le séquençage unicellulaire offre une sensibilité accrue, mais son coût élevé limite l’application à grande échelle de cette technique. La nature rétrospective de ces études signifie également qu’elles fournissent un aperçu limité des événements métastatiques transitoires et du paysage de la maladie à différents moments.
Dans les modèles animaux, les avancées technologiques récentes permettent aujourd’hui une cartographie phylogénétique prospective avec une haute résolution spatiale et temporelle 17,18,19,20. Ces techniques utilisent l’édition du génome CRISPR/Cas9 pour concevoir des cellules avec un code-barres évolutif - des mutations héréditaires qui s’accumulent au fil du temps. Lors du séquençage, la lignée de chaque cellule peut être retracée sur la base du profil mutationnel de son code-barres 17,18,19,20. En effet, une telle technologie est déjà utilisée pour cartographier l’ensemencement de métastases à métastases. Dans un article récent, Zhang et al. ont démontré que les cellules cancéreuses du sein et de la prostate dans les métastases osseuses se rediffusent de l’os pour ensemencer des métastases secondaires dans plusieurs organes21.
Bien que ces nouvelles méthodes aient un grand potentiel pour générer des cartes phylogénétiques détaillées et à haute résolution de la progression du cancer, elles sont très peu pratiques pour ceux qui étudient le moment exact des événements d’ensemencement de métastases à métastases et ce qui les favorise ou les prévient. Il est essentiel de combler ces lacunes dans les connaissances pour affiner notre compréhension et notre traitement du cancer métastatique, mais il y a un manque notable de technologies pour faciliter de telles études. Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment développé - et présentons ici - une nouvelle technique qui nous permet de marquer spécifiquement les cellules tumorales par photoconversion dans un site métastatique (le poumon) et de les réidentifier ensuite dans les organes tertiaires. À l’aide de cette technique, nous avons récemment montré que les cellules cancéreuses du sein se rediffusent à partir des métastases pulmonaires et ensemencent les organes tertiaires13. Cette technique peut également être utilisée pour déterminer le moment des événements de rediffusion dans une fenêtre étroite et quantifier les cellules tumorales redisséminées, facilitant ainsi l’étude de l’organotropisme des cellules redisséminées et de ce qui favorise/empêche la rediffusion.
Alors que la photoconversion et les systèmes cre/lox localement inductibles qui remplacent définitivement une protéine fluorescente par une autre ont déjà été utilisés pour marquer et suivre les cellules tumorales11,22,23, à notre connaissance, aucune approche de marquage spatio-temporel des cellules tumorales n’a été optimisée pour cibler le poumon - l’un des sites de métastases les plus courants chez les hommes et les femmes diagnostiqués avec l’un des 14 cancers les plus courants24. N’importe quel type de cellule cancéreuse et n’importe quel protocole pour la génération de métastases pulmonaires peuvent être utilisés avec notre procédure, ce qui la rend largement utile pour les chercheurs sur les métastases. Toutes les cellules cancéreuses utilisées pour générer des métastases pulmonaires devraient exprimer une protéine photoconvertible ou photocommutable, et les chercheurs peuvent choisir la protéine à utiliser en fonction de leurs besoins et de leurs ressources spécifiques. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules cancéreuses du sein 6DT1 qui exprimaient de manière stable la protéine fluorescente photoconvertible vert-rouge Dendra2 (cellules 6DT1-Dendra2)25 marquées à l’histone H2B. Nous avons injecté 5,0 × 104 cellules 6DT1-Dendra2 dans le quatrième coussinet adipeux mammaire de souris femelles Rag2-/-. Les tumeurs primaires étaient palpables entre 12 et 16 jours après l’injection et n’ont pas été réséquées pendant toute la durée de l’expérience. Des métastases pulmonaires spontanées se sont développées entre 19 et 26 jours après l’injection de cellules tumorales. Les chirurgies de photoconversion ont été réalisées entre 26 et 29 jours après l’injection de cellules tumorales. Les souris ont été sacrifiées 72 h après la chirurgie en raison de la charge des métastases pulmonaires.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément aux lignes directrices et aux règlements pour l’utilisation des animaux vertébrés, y compris l’approbation préalable du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Albert Einstein College of Medicine.
Avant la chirurgie, des métastases pulmonaires doivent être générées chez la souris à l’aide de cellules cancéreuses qui expriment une protéine photoconvertible/photocommutable ; Plusieurs protocoles pour la génération de métastases pulmonaires ont été publiés 26,27,28.
1. Préparation à la chirurgie
- Préparez des zones de travail distinctes pour la préparation de la souris (épilation et intubation), la chirurgie et la récupération.
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave.
REMARQUE : Comme une technique d’embouts uniquement est utilisée pour cette chirurgie, un stérilisateur à billes chaudes peut être utilisé pour restériliser les instruments pour les procédures ultérieures. - Allumez la plate-forme chirurgicale chauffée et laissez-la atteindre et se stabiliser à 37-40 °C.
- Induire l’anesthésie avec de l’isoflurane à 5 %, puis réduire l’isoflurane à 3 %. Effectuez des tests de pincement des orteils périodiquement tout au long de la procédure pour évaluer l’adéquation de l’anesthésie.
- Placez la souris anesthésiée en position de décubitus latéral droit. Retirez les poils de la partie supérieure gauche de la poitrine ou du côté du corps (voir Figure 1A) en appliquant une crème dépilatoire sur la zone. Humidifiez un morceau de gaze ou d’essuie-tout avec de l’eau et essuyez les poils et la crème dépilatoire. Répétez l’opération autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que tous les poils soient retirés du champ chirurgical.
REMARQUE : Ne laissez pas la crème dépilatoire sur la souris pendant plus de 20 s, car cela peut endommager la peau. - Faites un double nœud ~3 mm au-dessus de la base d’un cathéter de 22 G avec une suture en soie 2-0. Laissez des queues de 2 pouces de long.
- Intuber la souris avec ce cathéter comme décrit précédemment 29,30. Pour confirmer la réussite de l’intubation, fixez une poire de gonflage à l’extrémité du cathéter et pressez doucement.
REMARQUE : Les souris qui ont été intubées avec succès connaîtront une élévation thoracique bilatérale avec compression du bulbe. - Fixez fermement la suture de soie 2-0 autour du museau de la souris avec un double nœud pour maintenir le cathéter d’intubation en place.
2. Chirurgie pour exposer le poumon
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de la chirurgie (Figure 1), y compris la photoconversion, dans une hotte ou une armoire à flux laminaire pour éviter la contamination du champ chirurgical.
- Lavez-vous les mains avec du savon antiseptique et enfilez de nouveaux gants stériles.
REMARQUE : Comme une technique d’embouts uniquement est utilisée pour cette chirurgie, des gants non stériles peuvent également être utilisés. Il est recommandé d’utiliser des gants non stériles désinfectants avec un désinfectant à base d’alcool. - Préparer une dose de 0,1 mg/kg de buprénorphine (0,03 mg/mL) et l’injecter par voie sous-cutanée pour l’analgésie.
REMARQUE : L’analgésie multimodale, y compris les analgésiques locaux et les anti-inflammatoires non stéroïdiens, doit être utilisée en conjonction avec la buprénorphine si elle ne devrait pas interférer avec la biologie d’intérêt. - Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux de la souris pour prévenir les lésions cornéennes.
- Placez la souris en position de décubitus latéral droit sur la plate-forme chirurgicale chauffée.
- Connectez le ventilateur au cathéter d’intubation. Prenez soin de maintenir le cathéter stable, car même de légers mouvements peuvent perturber la mise en place du cathéter et entraîner une mauvaise ventilation.
- Observez une montée et une descente bilatérales de la poitrine stables, contrôlées par un ventilateur.
- Fixez les membres à la plate-forme chirurgicale avec du ruban adhésif. Stabilisez le champ chirurgical en plaçant un autre morceau de ruban adhésif le long du dos de la souris et en fixant la peau dorsale et la fourrure à la plate-forme chirurgicale (Figure 1A).
- Ouvrez les instruments chirurgicaux stérilisés.
- Appliquez une solution de chlorhexidine sur la peau de la souris pour stériliser le site chirurgical.
- Identifiez la zone située à ~7 mm à gauche du sternum et à ~7 mm au-dessus du bord sous-costal. Soulevez la peau sur cette zone avec une pince et faites une incision circulaire de ~10 mm à l’aide de ciseaux de micro-dissection bien aiguisés, en prenant soin de ne couper que la peau.
- Retirez les tissus mous au-dessus de la cage thoracique (Figure 1B). Cautériser les principaux vaisseaux aux deux extrémités à l’aide d’un stylo de cautérisation.
REMARQUE : En plus d’exciser tous les tissus mous sous-jacents à l’incision circulaire de 10 mm dans la peau, l’élimination de certains tissus mous non musculaires supplémentaires du périmètre facilite les étapes futures de la procédure. - D’une main, utilisez une pince pour surélever la6 e ou la 7e côte. De l’autre main, utilisez une seule lame des ciseaux de micro-dissection émoussés - inclinée parallèlement à la paroi thoracique, bord arrondi vers le bas - et percez soigneusement le 6e ou 7e muscle intercostal pour entrer dans la cavité thoracique (Figure 1C). Faites pivoter doucement les ciseaux au besoin et coupez pour faire une incision de ~10 mm dans l’espace intercostal, en prenant soin d’éviter de toucher le tissu pulmonaire et de couper les côtes.
- Évacuez délicatement l’air comprimé vers l’incision intercostale pour augmenter l’espace entre le poumon et la paroi thoracique. Évacuez d’abord l’air au niveau du poignet ou de la main pour trouver la force d’écoulement appropriée et dégagez la buse de tout débris, puis par courtes rafales à l’incision pour éviter les lésions pulmonaires.
- D’une main, utilisez une pince pour surélever la6 e ou la 7e côte. De l’autre main, maintenez l’écarteur fermé et insérez-le dans l’incision intercostale. Orientez les lames de l’écarteur de manière à ce qu’elles soient parallèles à la paroi thoracique, en prenant soin d’éviter de toucher le poumon lui-même (Figure 1D).
- Une fois l’écarteur en place, relâchez lentement la poignée, ce qui permet à l’écarteur de s’ouvrir et d’exposer le poumon (Figure 1E). La figure 2A montre des images représentatives des métastases pulmonaires exposées avant la photoconversion, y compris ce à quoi elles ressemblent à l’œil nu, et dans les canaux fluorescents FITC (vert, non photoconverti) et TRITC (rouge, photoconverti) lors de l’utilisation d’un éclairage à grand champ.
3. Photoconversion des métastases pulmonaires
REMARQUE : Les détails et les variantes des étapes suivantes se trouvent dans la discussion.
- Appliquez délicatement 2 à 3 gouttes de PBS stérile chauffé à 37 °C sur le tissu pulmonaire exposé pour éviter qu’il ne se dessèche.
- Placez un morceau de papier d’aluminium stérile avec une petite découpe sur la souris. Placez la découpe directement sur le tissu pulmonaire exposé et dimensionnez-la pour n’exposer que la partie ouverte du thorax et quelques millimètres de tissus mous et de peau environnants afin d’assurer la photoconversion du poumon exposé uniquement.
- Placez une boîte avec une découpe sur la souris et du papier d’aluminium. Assurez-vous que la découpe se trouve directement au-dessus du poumon exposé.
- Placez la lampe de photoconversion directement sur la découpe de la boîte (Figure 1F).
- Allumez la lampe de photoconversion et laissez 6 min d’éclairage continu des tissus pulmonaires exposés.
REMARQUE : Surveillez les signes vitaux de la souris à l’aide des programmes de surveillance physiologique du ventilateur. - Après la photoconversion, éteignez la lampe et retirez la lampe, la boîte et le masque en papier d’aluminium de la souris.
4. Procédure pour fermer la paroi thoracique
- Répétez l’étape 2.13 pour séparer le poumon de la paroi thoracique.
- Saisissez délicatement la poignée de l’enrouleur et pressez-la pour fermer les lames.
- Manœuvrez l’écarteur fermé hors de l’espace intercostal, en prenant soin d’éviter de toucher le tissu pulmonaire.
- À l’aide de la suture en soie 5-0, fermez l’incision intercostale avec un simple motif de suture continu qui intègre la côte des deux côtés de l’incision (Figure 1G). Tirez sur la suture pour vous assurer que les bords de la plaie sont appositionnels et rétablir l’intégrité de la paroi thoracique (Figure 1H). Veillez à ne pas trop serrer la suture car cela pourrait déchirer les muscles intercostaux.
- Fixez la suture en nouant les deux extrémités de la suture ensemble 4x. Coupez les queues de suture le plus près possible du nœud.
- Fermez la peau avec des agrafes chirurgicales.
- Retirez l’excès d’air de la cavité thoracique à l’aide d’une seringue à insuline de 1 ml munie d’une aiguille de 28 G. Localisez le processus xiphoïde tactilement et insérez l’aiguille juste en dessous, en avançant vers l’épaule gauche pour entrer dans la cavité thoracique par le diaphragme. Tirez sur la seringue à ~1 mL ; Retirez l’aiguille de la souris et évacuez l’air de la seringue. Répétez ce processus 3 à 4 fois.
REMARQUE : Veillez à ne pas percer les organes internes. De plus, il est important d’utiliser une seringue de 1 ml et de répéter la procédure 3 à 4 fois plutôt que d’utiliser une seringue de plus grand volume et d’essayer d’éliminer tout l’air en une seule fois. L’utilisation d’une seringue de plus grand volume peut entraîner un vide trop important dans la cavité thoracique et entraîner une distension et des lésions des tissus pulmonaires. - Éteignez l’isoflurane.
- Continuez la ventilation avec 100% d’oxygène jusqu’à ce que la souris montre des signes de réveil.
- Une fois que la souris montre des signes de réveil, débranchez le cathéter d’intubation du ventilateur, coupez la suture autour du museau et extubez la souris.
- Retirez la souris et transférez-la dans une cage propre placée à ~2 pieds sous une lampe chauffante. Surveillez jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Si la souris montre des signes de difficulté respiratoire ou de manque de mobilité, anesthésiez-la avec de l’isoflurane à 5 % pendant 5 min, assurez-vous d’une anesthésie adéquate en observant une perte de réflexes lors du pincement des orteils et euthanasiez-la par luxation cervicale.
- Une fois que la souris se réveille complètement de l’anesthésie et commence à bouger, préparez une autre dose de 0,1 mg / kg de buprénorphine et injectez-la par voie sous-cutanée pour l’analgésie postopératoire.
- Après la chirurgie, assurez-vous que les souris sont logées individuellement. Fournir des antibiotiques dans l’eau potable (enrofloxacine, concentration finale 0,4 mg/mL).
- Dans les 3 jours suivant la chirurgie, vérifiez la souris deux fois par jour pour détecter des signes de détresse. Pour la gestion de la douleur, administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine (0,03 mg/mL) par voie sous-cutanée toutes les 4 à 6 heures. Euthanasiez la souris si elle présente des signes d’infection, d’immobilité ou de difficulté respiratoire. Après le troisième jour, les souris peuvent être contrôlées une fois par jour.
5. Traitement des échantillons et détection des cellules photoconverties à l’aide du nettoyage des tissus
- Entre 3 et 5 jours (ou la durée souhaitée) après la chirurgie de photoconversion, anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 5 %, réduire l’isoflurane de 5 % à 2,5 % après l’induction, assurer une anesthésie adéquate en observant une perte de réflexes lors du pincement de l’orteil et effectuer une perfusion transcardique terminale avec 10 mL de PBS à température ambiante, suivie de 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % refroidi à 4 °C comme décrit précédemment31.
- Prélever les organes d’intérêt et les dégager optiquement comme décrit précédemment31.
- Imagez les tissus nettoyés à l’aide d’un microscope à feuille de lumière comme décrit précédemment31. Vous pouvez également placer les tissus dégagés dans une boîte à fond en verre et les imager dans les canaux FITC et TRITC pour visualiser les cellules vertes (non photoconverties) et rouges (photoconverties) à l’aide d’un microscope confocal, d’un disque rotatif ou d’un microscope multiphotonique.
6. Traitement des échantillons et détection des cellules photoconverties par désagrégation tissulaire
- Anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 5 % pendant 5 minutes, assurer une anesthésie adéquate en observant une perte de réflexes lors du pincement des orteils, et sacrifier par luxation cervicale 3 à 5 jours après la photoconversion.
- Prélever et digérer les organes d’intérêt comme décrit précédemment13.
- Plaquez les tissus digérés et placez-les dans un incubateur pour qu’ils adhèrent pendant la nuit comme décrit précédemment13.
- Le lendemain, imagez les cellules plaquées dans les canaux FITC et TRITC pour visualiser les cellules vertes (non photoconverties) et rouges (photoconverties) comme décrit précédemment13.
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Representative Results
Les étapes de la chirurgie décrites dans ce protocole sont illustrées à la figure 1. En bref, la souris est anesthésiée et les poils sont retirés du thorax gauche. La souris est ensuite intubée et ventilée, ce qui lui permet de recevoir de l’oxygène pendant que la cavité thoracique est ouverte. Les tissus mous sont enlevés pour exposer la cage thoracique et une incision est pratiquée dans le 6e ou 7e muscle intercostal. Un écarteur est inséré dans la brèche intercostale et relâché pour écarter les côtes adjacentes et exposer le poumon gauche et toutes les métastases photoconvertibles qui s’y trouvent. Le poumon et les métastases sont ensuite exposés à la lumière bleue pour photoconvertir les lésions exposées. Après la photoconversion, l’écarteur est retiré, les côtes sont suturées ensemble et la peau sus-jacente est fermée. Enfin, l’excès d’air est retiré de la cavité thoracique pour soulager la pression sur les poumons et permettre à la souris de reprendre une respiration indépendante et spontanée.
Le protocole décrit ici peut être adapté à un certain nombre de protéines photoconvertibles/photo-commutables. S’assurer que les cellules photoconverties atteignent leur intensité de fluorescence maximale dans le canal photoconverti peut faciliter leur identification dans d’autres organes. Les conditions nécessaires pour atteindre l’intensité maximale de fluorescence après photoconversion doivent être déterminées empiriquement, car elles peuvent varier avec d’autres aspects de l’expérience, tels que la protéine photoconvertible utilisée et l’intensité de la lumière utilisée pour la photoconversion. Les figures 2B, C montrent comment l’intensité de fluorescence a changé dans les canaux FITC (non photoconverti) et TRITC (photoconverti) en fonction de la durée d’exposition à la lumière bleue dans un échantillon ex vivo . Nous avons déterminé que 6 minutes d’exposition à la lumière bleue produisaient le signal le plus brillant dans le canal photoconverti et qu’une exposition supplémentaire conduisait à un photoblanchiment. Nous avons ensuite mesuré l’intensité de fluorescence dans les deux canaux avant et après 6 min d’exposition à la lumière bleue, in vivo, et obtenu des résultats similaires (Figure 2D).
Ensuite, le cerveau, le foie et le poumon droit non photoconverti ont été prélevés sur des souris qui ont subi cette chirurgie avec (groupe expérimental) et sans (groupe témoin) la lampe de photoconversion allumée. Les tissus ont été nettoyés optiquement comme décrit précédemment31, placés dans une boîte à fond en verre et imagés sur un microscope multiphotonique construit sur mesure32 à l’aide d’une lentille d’objectif 25x 1,0 NA et d’une longueur d’onde d’excitation de 880 nm. La fluorescence a été capturée pour les canaux vert et rouge à l’aide des filtres passe-bande 525/35 nm et 580/60 nm, respectivement. Les cellules photoconverties et non photoconverties ont pu être clairement identifiées dans les trois types de tissus chez les souris qui ont subi la chirurgie avec une exposition à la lumière bleue (Figure 3). Comme on pouvait s’y attendre, seules des cellules tumorales non photoconverties ont été trouvées dans les tissus des souris qui ont subi la chirurgie sans exposition à la lumière bleue.
Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole chirurgical de la chirurgie de photoconversion pulmonaire. (A) Souris épilée placée sur la scène chirurgicale et mise en position avec du ruban adhésif. (B) Un dégagement circulaire de 10 mm de la peau et des tissus mous au-dessus de la cage thoracique. (C) Brèche initiale du muscle intercostal avec des ciseaux de micro-dissection à bord émoussé. (D) Écarteur fermé inséré dans une incision intercostale de 10 mm. (E) Écarteur ouvert exposant le tissu pulmonaire. (F) Lampe de photoconversion en place directement au-dessus du thorax ouvert de la souris. (G) Suture continue simple qui incorpore la côte des deux côtés de l’incision intercostale. (H) Suture serrée et fixée pour rétablir l’intégrité de la paroi thoracique. (I) Élimination de l’air de la cavité thoracique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Détermination des conditions nécessaires pour atteindre l’intensité maximale de fluorescence dans le canal photoconverti. (A) Images représentatives des métastases pulmonaires exprimant Dendra2 exposées avant l’exposition à la lumière bleue dans un éclairage ambiant sans filtre et à faible grossissement (1) et à fort grossissement (2), et à fort grossissement dans les canaux FITC (3) et TRITC avec éclairage à grand champ (4). (B) Images de fluorescence d’une métastase pulmonaire exprimant Dendra2 avant l’exposition à la lumière bleue, et après 2 min, 4 min, 6 min et 8 min d’exposition à la lumière bleue, ex vivo. (C) Intensité de fluorescence moyenne normalisée d’une métastase pulmonaire exprimant Dendra2 en fonction de la durée d’exposition à la lumière bleue, ex vivo. (D) Intensité moyenne normalisée de fluorescence d’une métastase pulmonaire exprimant Dendra2 avant et après 6 min d’exposition à la lumière bleue, in vivo. Barres d’échelle = 2 mm (A), 400 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives de cellules tumorales photoconverties (rangée du haut) et non photoconverties (rangée du bas) trouvées dans le poumon, le cerveau et le foie controlatéraux de souris ayant subi une chirurgie de photoconversion. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Lampe à matrice de LED de 400 nm construite sur mesure.(A) Désactivé et (B) Activé. CF = Ventilateur de refroidissement, R = Réflecteur, LED = LED haute puissance de 400 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans cet article, nous décrivons un protocole chirurgical pour la photoconversion sélective des cellules tumorales dans le poumon. Cette technique permet aux chercheurs de marquer sélectivement les cellules tumorales dans le poumon et de suivre leur devenir en les réidentifiant dans tout le corps à un moment ultérieur, facilitant ainsi l’étude des métastases des métastases pulmonaires. En utilisant ce protocole, il a été possible de visualiser des cellules photoconverties dans le cerveau, le foie et le poumon droit non photoconverti de souris ayant subi la chirurgie avec photoconversion, indiquant que ces cellules se sont rediffusées des métastases pulmonaires photoconverties vers ces sites tertiaires. Nous n’avons pas trouvé de globules rouges dans les organes des souris qui n’ont pas subi de photoconversion, ce qui indique que l’autofluorescence naturelle dans les cellules n’est pas assez brillante pour être confondue avec les cellules tumorales photoconverties.
Une attention particulière à certains aspects de l’expérience peut augmenter le taux de réussite de cette procédure. Tout d’abord, lors de la génération de métastases pulmonaires, le protocole de génération de métastases et de protéine photoconvertible/photocommutable doit être pris en compte. Il a été rapporté que certaines protéines fluorescentes sont immunogènes 33,34,35,36. Ainsi, les cellules cancéreuses exprimant de telles protéines peuvent ne pas métastaser spontanément chez les souris immunocompétentes. En effet, nous avons observé que des tumeurs primaires se forment à la fois chez les souris syngéniques immunocompétentes (FVB) et chez les souris immunodéprimées (Rag2-/-) lors de l’injection orthotopique de cellules 6DT1-Dendra2. Cependant, les métastases ne se sont développées que chez les souris Rag2-/-, ce qui indique que Dendra2 peut être quelque peu immunogène. Les moyens de surmonter l’immunogénicité potentielle des protéines fluorescentes pour générer des métastases pulmonaires comprennent l’utilisation d’une souris immunodéprimée, la génération de métastases par injection dans la veine caudale, l’utilisation d’une protéine photoconvertible/photocommutable différente, ou l’utilisation d’un animal transgénique dans lequel la protéine photoconvertible/photocommutable est génétiquement codée de sorte que les souris sont tolérées à la protéine37. L’intensité et la stabilité du signal fluorescent dans le canal photoconverti doivent également être prises en compte. Pour de nombreuses protéines photoconvertibles/photocommutables, le signal dans le canal photoconverti diminue avec le temps à mesure que la protéine se dégrade et se dilue avec la division cellulaire. Avec d’autres, nous avons déjà montré que Dendra2 photoconverti lié à H2B peut être détecté de manière fiable pendant 7 jours dans les cellules en division et 16 jours dans les cellules non divisées 38,39. Lier la protéine photoconvertible à une protéine à faible taux de renouvellement peut prolonger la demi-vie du signal photoconverti. Les méthodes de dépannage du modèle de métastases pulmonaires doivent dépendre de l’objectif de recherche et du type de cellule cancéreuse utilisé.
Deuxièmement, il est important de planifier correctement la chirurgie en fonction du modèle de maladie d’intérêt. Ceux qui travaillent avec des modèles de maladie avec des métastases pulmonaires à croissance rapide peuvent avoir un délai limité pour effectuer la chirurgie avant que les souris ne soient trop submergées par la charge tumorale pour se remettre de la chirurgie et / ou survivre au temps souhaité après la chirurgie. Une compréhension approfondie de la chronologie du modèle de maladie, ainsi que l’utilisation de stratégies d’imagerie non invasives telles que la microtomodensitométrie, peuvent aider à planifier cette procédure.
Troisièmement, la coupure par inadvertance des principaux vaisseaux lors de l’ablation des tissus mous peut provoquer des saignements excessifs, entraînant une mauvaise visibilité du champ chirurgical et/ou une exsanguination, comme décrit précédemment40. Éviter les gros vaisseaux et utiliser un stylo cautérisant pendant la chirurgie peut éviter cela. Quatrièmement, lors de l’insertion et du retrait de l’enrouleur, il est crucial de garder les lames de l’enrouleur parallèles à la paroi thoracique à tout moment. L’inclinaison des lames vers les poumons augmente le risque de lésions pulmonaires, et l’inclinaison des lames vers la paroi thoracique augmente le risque de percer la paroi thoracique dans d’autres zones. Si l’insertion ou le retrait de l’écarteur de manière parallèle ne semble pas possible, les ciseaux de micro-dissection à bord émoussé peuvent être utilisés pour augmenter légèrement la longueur de l’incision intercostale avant d’essayer d’insérer/retirer à nouveau l’écarteur. Enfin, il faut veiller à ce que la cage thoracique soit complètement refermée à la fin de la chirurgie. Lors de la suture des côtes, les points de suture doivent être commencés ~1 mm avant le début de l’incision et terminés ~1 mm après. Cela permet d’éviter les ouvertures résiduelles aux extrémités de l’incision. De plus, prenez soin de tirer et d’attacher la suture suffisamment serrée pour éliminer l’espace entre les côtes, mais pas trop serrée pour que les sutures déchirent les muscles intercostaux adjacents et créent des brèches supplémentaires. S’il n’est pas possible de refermer la cavité thoracique, la souris doit être sacrifiée sans cruauté pendant la chirurgie, car elle aura de grandes difficultés ou sera incapable de respirer par elle-même lorsque la ventilation mécanique est arrêtée.
La source lumineuse et la méthodologie exacte de photoconversion peuvent varier d’un laboratoire à l’autre. Toute source de lumière et méthodologies sûres, cohérentes et appropriées pour le modèle peuvent être utilisées. Par exemple, la photoconversion peut être effectuée en transférant la souris sur un stéréoscope ou un autre microscope capable de faire briller la lumière de la longueur d’onde et de l’intensité nécessaires à la photoconversion sur le poumon exposé. Nous utilisons une lampe à diodes électroluminescentes de 400 nm construite sur mesure et réglée à son intensité la plus élevée pour photoconvertir les métastases pulmonaires exprimant Dendra2 (figure supplémentaire S1). Pour soutenir la lampe au-dessus de la souris et s’assurer que la lampe est placée à la même distance au-dessus de chaque souris, nous avons découpé une ouverture de 6,5 x 6,5 cm dans le fond d’une boîte en carton ouverte (18,4 cm (L) x 13,2 cm (l) x 7,3 cm (H)). Nous plaçons la boîte à l’envers sur la souris et posons la lampe de 8,5 x 8,5 cm sur la découpe de 6,5 x 6,5 cm (Figure 1F), de sorte que la lampe soit soutenue et que la lumière bleue puisse atteindre le tissu pulmonaire exposé.
Il est important de noter que certains aspects de ce protocole, y compris la chirurgie et l’utilisation d’anesthésiques, peuvent altérer la cinétique de dissémination et la capacité des cellules tumorales 41,42,43,44. En tant que tel, des contrôles appropriés doivent être utilisés pour s’assurer que les résultats ne sont pas faussés par la procédure.
La principale limite de cette technique est que seules les métastases sur la partie exposée du poumon subiront une photoconversion. Par conséquent, toutes les cellules tumorales qui se rediffusent à partir du poumon ne seront pas photoconverties et toute quantification des cellules redisséminées sera relative. Malgré cette limitation, cette technique peut encore fournir des informations précieuses sur la rediffusion des cellules tumorales, notamment en déterminant si et quand elle se produit, ce qui la favorise ou l’empêche, et l’organotropisme des cellules redisséminées. À notre connaissance, il s’agit de la première technique qui permet le marquage sélectif et le suivi du destin des cellules tumorales dans le poumon. En conclusion, ce protocole décrit une nouvelle technique qui peut être utilisée pour faciliter et améliorer l’étude de la rediffusion des cellules tumorales et de l’ensemencement de métastases à métastases sans analyse génomique. Le ciblage des métastases pulmonaires rend la procédure utile et pertinente pour les chercheurs sur les métastases qui étudient la plupart des principaux types de cancer.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Wade Koba pour son aide en microtomodensitométrie (S10RR029545), Vera DesMarais et Hillary Guzik de l’Analytical Imaging Facility pour leur formation et leur assistance en microscopie, le Centre de cancérologie Einstein Montefiore, l’Institut national du cancer (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), le Centre de biophotonique Gruss Lipper, le Programme intégré d’imagerie pour la recherche sur le cancer, une bourse postdoctorale Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) et une bourse de développement de carrière METAvivor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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