Summary
Vi præsenterer en metode til at studere tumorcellereformidling fra lungemetastaser, der involverer en kirurgisk protokol til selektiv fotokonvertering af lungemetastaser, efterfulgt af identifikation af redisseminerede tumorceller i tertiære organer.
Abstract
Metastaser - den systemiske spredning af kræft - er den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald. Selvom metastase almindeligvis betragtes som en ensrettet proces, hvor celler fra den primære tumor spredes og frømetastaser, kan tumorceller i eksisterende metastaser også sprede sigigen og give anledning til nye læsioner på tertiære steder i en proces kendt som "metastase-fra-metastaser" eller "metastase-til-metastase-såning." Metastase-til-metastase såning kan øge den metastatiske byrde og mindske patientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse af processerne bag dette fænomen afgørende for at forfine behandlingsstrategier for patienter med metastatisk kræft.
Lidt er kendt om metastase-til-metastase-såning, delvis på grund af logistiske og teknologiske begrænsninger. Undersøgelser af metastase-til-metastase-såning er primært afhængige af sekventeringsmetoder, hvilket måske ikke er praktisk for forskere, der studerer den nøjagtige timing af metastase-til-metastase-såningsbegivenheder, eller hvad der fremmer eller forhindrer dem. Dette fremhæver manglen på metoder, der letter undersøgelsen af metastase-til-metastase-såning. For at løse dette har vi udviklet - og beskriver heri - en murinkirurgisk protokol til selektiv fotokonvertering af lungemetastaser, der muliggør specifik mærkning og skæbnesporing af tumorceller, der respredes fra lungen til tertiære steder. Så vidt vi ved, er dette den eneste metode til at studere tumorcellereformidling og metastase-til-metastase-såning fra lungerne, der ikke kræver genomisk analyse.
Introduction
Metastaser er den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald1. Metastatisk kræft opstår, når celler fra den primære tumor spredes i hele kroppen og spredes til klinisk påviselige tumorer i fjerne organer 2,3.
Selvom metastase almindeligvis betragtes som en ensrettet proces, hvor tumorceller spredes fra den primære tumor og koloniserer fjerne organer4, tyder stigende kliniske og eksperimentelle beviser på, at en mere kompleks, multi-directional proces er på spil. Det har vist sig, at cirkulerende tumorceller kan genfrø den primære tumor (hvis den stadig er på plads)5,6,7,8,9, og tumorceller fra eksisterende metastatiske foci kan rejse til tertiære steder og give anledning til nye læsioner 10,11,12,13 . Faktisk tyder beviser fra nyere genomiske analyser på, at nogle metastatiske læsioner ikke stammer fra den primære tumor, men fra andre metastaser - et fænomen kendt som "metastase-fra-metastaser" eller "metastase-til-metastase-såning"14,15,16. Metastase-til-metastase-såning kan fortsætte sygdomsprocessen, selv efter fjernelse af den primære tumor, øge metastatisk byrde og mindske patientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse af processerne bag metastase-til-metastase-såning afgørende for at forfine behandlingsstrategier for patienter med metastatisk sygdom.
På trods af de potentielt alvorlige kliniske implikationer er der lidt kendt om metastase-til-metastase-såning, delvis på grund af logistiske og teknologiske begrænsninger. Humane undersøgelser er begrænset af en mangel på kliniske prøver. Klinisk resektion og biopsi af metastatiske læsioner er ualmindelige, ligesom biopsi af tilsyneladende sunde organer, hvor enkelt disseminerede tumorceller kan lure. Det betyder, at humane undersøgelser typisk kun er mulige ved hjælp af obduktionsprøver fra personer, hvis primære tumorer enten stadig er på plads eller tidligere blev resekteret, men stadig er tilgængelige for forskere. Når sådanne prøver er tilgængelige, skal afstamningsanalyser af kræftprogression udføres ved hjælp af sekventeringsmetoder14. Imidlertid har bulksekventering af matchede primære tumorer og metastaser ikke den følsomhed, der er nødvendig for omfattende afstamningssporing. For eksempel kan bulksekventering af en læsion afsløre en subklon, der ikke kan påvises i nogen af dens matchede læsioner. I dette tilfælde ville man ikke være i stand til at bestemme oprindelsen af denne subklon. Det kan have været til stede i den primære tumor eller en anden metastase med en frekvens under detektionsgrænsen, eller det kan være opstået efter den første kolonisering af den metastatiske læsion, den blev fundet i. Enkeltcellesekventering giver øget følsomhed, men dens høje omkostninger begrænser den store anvendelse af denne teknik. Den retrospektive karakter af disse studier betyder også, at de giver begrænset indsigt i forbigående metastatiske hændelser og sygdomslandskabet på forskellige tidspunkter.
I dyremodeller giver de seneste teknologiske fremskridt nu mulighed for prospektiv fylogenetisk kortlægning med høj rumlig og tidsmæssig opløsning 17,18,19,20. Disse teknikker bruger CRISPR / Cas9 genomredigering til at konstruere celler med en udviklende stregkode - arvelige mutationer, der akkumuleres over tid. Ved sekventering kan hver celles afstamning spores baseret på mutationsprofilen for dens stregkode 17,18,19,20. Faktisk bruges sådan teknologi allerede til at kortlægge metastase-til-metastase-såning. I et nyligt papir viste Zhang et al., at bryst- og prostatacancerceller i knoglemetastaser respredes fra knoglen til frø sekundære metastaser i flere organer21.
Mens disse nye metoder har stort potentiale til at generere detaljerede, højopløselige fylogenetiske kort over kræftprogression, er de meget upraktiske for dem, der studerer den nøjagtige timing af metastase-til-metastase-såningshændelser, og hvad der fremmer eller forhindrer dem. At udfylde disse videnshuller er afgørende for at forfine vores forståelse og behandling af metastatisk kræft, men der er en mærkbar mangel på teknologier til at lette sådanne undersøgelser. For at imødekomme dette behov har vi for nylig udviklet - og præsenterer heri - en ny teknik, der giver os mulighed for specifikt at markere tumorceller via fotokonvertering i et metastatisk sted (lungen) og efterfølgende genidentificere dem i tertiære organer. Ved hjælp af denne teknik viste vi for nylig, at brystkræftceller respredes fra lungemetastaser og frø tertiære organer13. Denne teknik kan også bruges til at bestemme tidspunktet for reformidlingsbegivenheder inden for et snævert vindue og kvantificere redisseminerede tumorceller, hvilket letter undersøgelsen af organotropisme af redisseminerede celler, og hvad der fremmer / forhindrer redisseminering.
Mens fotokonvertering og lokalt inducerbare cre / lox-systemer, der permanent erstatter et fluorescerende protein med et andet, tidligere er blevet brugt til at markere og spore tumorceller 11,22,23, så vidt vi ved, er ingen tilgang til rumlig tidsmæssig mærkning af tumorceller blevet optimeret til at målrette lungen - et af de mest almindelige metastasesteder blandt mænd og kvinder diagnosticeret med nogen af de 14 mest almindelige kræftformer 24. Enhver kræftcelletype og enhver protokol til generering af lungemetastaser kan bruges sammen med vores procedure, hvilket gør den bredt nyttig for metastaseforskere. Alle kræftceller, der bruges til at generere lungemetastaser, skal udtrykke et fotokonvertibelt eller fotoomskifteligt protein, og forskere kan vælge, hvilket protein der skal bruges baseret på deres specifikke behov og ressourcer. I denne undersøgelse brugte vi 6DT1 brystkræftceller, der stabilt udtrykte det fotokonvertible grøn-til-røde fluorescerende protein Dendra2 (6DT1-Dendra2-celler)25 mærket til histon H2B. Vi injicerede 5,0 × 104 6DT1-Dendra2-celler i den fjerde brystfedtpude hos kvindelige Rag2-/- mus. Primære tumorer var håndgribelige mellem 12 og 16 dage efter injektion og blev ikke resekteret i løbet af eksperimentet. Spontane lungemetastaser udviklede sig mellem 19 og 26 dage efter tumorcelleinjektion. Fotokonverteringsoperationer blev udført mellem 26 og 29 dage efter tumorcelleinjektion. Mus blev ofret 72 timer efter operationen på grund af lungemetastasebyrde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer beskrevet i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjer og forskrifter for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
Før operationen skal lungemetastaser genereres hos mus ved hjælp af kræftceller, der udtrykker et fotokonvertibelt / fotoomskifteligt protein; Flere protokoller for lungemetastasegenerering er blevet offentliggjort 26,27,28.
1. Forberedelse til operation
- Forbered forskellige arbejdsområder til museforberedelse (hårfjerning og intubation), kirurgi og genopretning.
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter i en autoklave.
BEMÆRK: Da der anvendes en tips-only teknik til denne operation, kan en varm perlesterilisator bruges til at gensterilisere instrumenter til efterfølgende procedurer. - Tænd for den opvarmede kirurgiske platform, og lad den nå og stabilisere sig ved 37-40 °C.
- Inducer anæstesi med 5% isofluran, og sænk derefter isofluran til 3%. Udfør tåklemmetest med jævne mellemrum under hele proceduren for at vurdere anæstesitilstrækkelighed.
- Placer den bedøvede mus i en højre lateral decubitus position. Fjern hårene på øverste venstre bryst/sidekrop (se figur 1A) ved at påføre hårfjerningscreme på området. Fugt et stykke gaze eller køkkenrulle med vand og tør håret og hårfjerningscremen væk. Gentag efter behov, indtil alt hår er fjernet fra det kirurgiske felt.
BEMÆRK: Efterlad ikke hårfjerningscreme på musen i mere end 20 sekunder, da dette kan beskadige huden. - Bind en dobbelt knude ~ 3 mm over bunden af et 22 G kateter med 2-0 silkesutur. Forlad 2 tommer lange haler.
- Intuberes musen med dette kateter som tidligere beskrevet 29,30. For at bekræfte vellykket intubation skal du fastgøre en inflationspære til enden af kateteret og forsigtigt klemme.
BEMÆRK: Mus, der er blevet intuberet med succes, vil opleve bilateral brysthævning med pæreklemme. - Fastgør 2-0 silkesuturen tæt omkring musens snude med en dobbelt knude for at holde intubationskateteret på plads.
2. Kirurgi for at udsætte lungen
BEMÆRK: Udfør alle trin i operationen (figur 1), herunder fotokonvertering, i en hætte eller laminært flowskab for at undgå forurening af det kirurgiske felt.
- Vask hænder med antiseptisk sæbe og tag nye sterile handsker på.
BEMÆRK: Da der anvendes en teknik, der kun giver tips, kan ikke-sterile handsker også anvendes. Det anbefales at desinficere ikke-sterile handsker med et alkoholbaseret desinfektionsmiddel. - Forbered en 0,1 mg/kg dosis buprenorphin (0,03 mg/ml) og injicer subkutant for analgesi.
BEMÆRK: Multimodal analgesi, herunder lokale smerteblokkere og ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler, bør anvendes sammen med buprenorphin, hvis de ikke forventes at interferere med den relevante biologi. - Påfør oftalmisk salve på begge museøjne for at forhindre hornhindeskader.
- Placer musen i højre laterale decubitusposition på den opvarmede kirurgiske platform.
- Tilslut ventilatoren til intubationskateteret. Sørg for at holde kateteret stabilt, da selv små bevægelser kan forstyrre kateterets placering og føre til dårlig ventilation.
- Overhold stabil, ventilatorstyret, bilateral bryststigning og fald.
- Fastgør lemmerne til den kirurgiske platform med mærkningstape. Stabiliser det kirurgiske felt ved at placere et andet stykke tape langs musens ryg og fastgøre dorsal hud og pels til den kirurgiske platform (figur 1A).
- Åbn de steriliserede kirurgiske instrumenter.
- Påfør chlorhexidinopløsning på musens hud for at sterilisere det kirurgiske sted.
- Identificer området ~ 7 mm til venstre for brystbenet og ~ 7 mm over subkostalmargenen. Løft huden over dette område med tang og lav et ~ 10 mm cirkulært snit ved hjælp af skarp mikrodissekerende saks, og pas på kun at klippe huden.
- Fjern blødt væv over brystkassen (figur 1B). Cauterize alle større fartøjer i begge ender med en cautery pen.
BEMÆRK: Ud over at fjerne alt blødt væv, der ligger til grund for det 10 mm cirkulære snit i huden, letter fjernelse af yderligere ikke-muskulært blødt væv fra omkredsen fremtidige trin i proceduren. - Brug med den ene hånd tang til at hæve den 6. eller 7. ribben. Brug på den anden side et enkelt blad af den stumpe mikrodissekerende saks - vinklet parallelt med brystvæggen, afrundet kant nedad - og gennembor forsigtigt den 6. eller 7. interkostale muskel for at komme ind i brysthulen (figur 1C). Drej forsigtigt saksen efter behov og klip for at lave et ~ 10 mm snit i det interkostale rum, pas på at undgå at røre lungevævet og skære ribbenene.
- Udlad forsigtigt trykluft mod det interkostale snit for at øge mellemrummet mellem lungen og brystvæggen. Udlad luften først ved ens håndled eller hånd for at finde den passende strømningsstyrke og rydde dysen for snavs, derefter i korte udbrud ved snittet for at forhindre lungeskade.
- Brug med den ene hånd tang til at hæve den 6. eller 7. ribben. Hold retraktoren lukket med den anden hånd og indsæt den i det interkostale snit. Orienter retraktorens knive, så de er parallelle med brystvæggen, og pas på at undgå at røre selve lungen (figur 1D).
- Når retraktoren er på plads, skal du langsomt slippe håndtaget, så retractoren kan åbne og blotte lungen (figur 1E). Figur 2A viser repræsentative billeder af eksponerede lungemetastaser før fotokonvertering, herunder hvordan de ser ud med det blotte øje, og i FITC (grøn, ikke-fotokonverteret) og TRITC (rød, fotokonverteret) fluorescerende kanaler, mens der anvendes bredfeltbelysning.
3. Lungemetastase fotokonvertering
BEMÆRK: Detaljer og variationer af følgende trin kan findes i diskussionen.
- Påfør forsigtigt 2-3 dråber sterilt PBS opvarmet til 37 °C på det eksponerede lungevæv for at forhindre udtørring.
- Placer et stykke sterilt aluminiumsfolie med en lille udskæring over musen. Placer udskæringen direkte over det udsatte lungevæv og størrelse det for kun at udsætte den åbne del af brystkassen og et par millimeter omgivende blødt væv og hud for at sikre fotokonvertering af kun den udsatte lunge.
- Placer en kasse med en udskæring over musen og aluminiumsfolien. Sørg for, at udskæringen er direkte over den udsatte lunge.
- Placer fotokonverteringslampen direkte over udskæringen på kassen (figur 1F).
- Tænd fotokonverteringslampen, og lad 6 minutters kontinuerlig belysning af eksponeret lungevæv.
BEMÆRK: Overvåg musens vitale tegn ved hjælp af de fysiologiske overvågningsprogrammer på ventilatoren. - Efter fotokonvertering skal du slukke for lampen og fjerne lampen, kassen og aluminiumsfoliemasken fra musen.
4. Procedure til lukning af brystvæg
- Gentag trin 2.13 for at adskille lungen fra brystvæggen.
- Tag forsigtigt fat i tilbagetrækningshåndtaget og klem for at lukke knivene.
- Manøvrer den lukkede retraktor ud af det interkostale rum, og pas på at undgå at røre lungevævet.
- Brug 5-0 silkesuturen til at lukke det interkostale snit med et simpelt kontinuerligt suturmønster, der inkorporerer ribben på begge sider af snittet (figur 1G). Træk suturen tæt for at sikre, at sårkanterne er appositionelle og genoprette brystvæggens integritet (figur 1H). Pas på ikke at stramme suturen for meget, da dette kan rive de interkostale muskler.
- Fastgør suturen ved at knytte de to ender af suturen sammen 4x. Skær suturhalerne så tæt på knuden som muligt.
- Luk huden med kirurgiske hæfteklammer.
- Fjern overskydende luft fra brysthulen med en 1 ml insulinsprøjte med en 28 G nål påsat. Find xiphoid-processen taktilt, og indsæt nålen lige under, fremad mod venstre skulder for at komme ind i brysthulen gennem membranen. Træk sprøjten tilbage til ~1 ml; Fjern kanylen fra musen og tøm luften ud af sprøjten. Gentag denne proces 3-4x.
BEMÆRK: Pas på ikke at punktere indre organer. Desuden er det vigtigt at bruge en 1 ml sprøjte og gentage proceduren 3-4x i stedet for at bruge en sprøjte med større volumen og forsøge at fjerne al luften på én gang. Brug af en sprøjte med større volumen kan resultere i for stort vakuum i brysthulen og føre til udspiling og beskadigelse af lungevævet. - Sluk for isofluranen.
- Fortsæt ventilationen med 100% ilt, indtil musen viser tegn på opvågnen.
- Når musen viser tegn på opvågning, skal du frakoble intubationskateteret fra ventilatoren, skære suturen omkring snuden og ekstubere musen.
- Fjern musen og overfør den til et rent bur placeret ~ 2 fod under en varmelampe. Overvåg, indtil den er helt gendannet. Hvis musen viser tegn på vejrtrækningsbesvær eller manglende mobilitet, bedøves den med 5% isofluran i 5 min, sørger for tilstrækkelig bedøvelse ved at observere et tab af reflekser ved tåklemmen og afliver via cervikal dislokation.
- Når musen er helt vågnet fra anæstesi og begynder at bevæge sig, skal du forberede en anden 0,1 mg / kg dosis buprenorphin og injicere den subkutant til postoperativ analgesi.
- Efter operationen skal du sikre dig, at musene er anbragt individuelt. Giv antibiotika i drikkevandet (enrofloxacin, slutkoncentration 0,4 mg / ml).
- I de 3 dage efter operationen skal du kontrollere musen to gange om dagen for tegn på nød. Til smertebehandling administreres 0,1 mg/kg buprenorphin (0,03 mg/ml) subkutant hver 4.-6. time. Aflive musen, hvis den viser tegn på infektion, immobilitet eller vejrtrækningsbesvær. Efter den tredje dag kan mus kontrolleres en gang om dagen.
5. Prøvebehandling og påvisning af fotokonverterede celler ved hjælp af vævsrensning
- Mellem 3 og 5 dage (eller den ønskede tid) efter fotokonverteringsoperationen bedøves musen med 5% isofluran, isofluran reduceres fra 5% til 2,5% efter induktion, sikres tilstrækkelig bedøvelse ved at observere et tab af reflekser ved tåklemmen, og der udføres en terminal transkardieperfusion med 10 ml PBS ved stuetemperatur efterfulgt af 10 ml 4% paraformaldehyd afkølet til 4 °C som tidligere beskrevet31.
- Saml organerne af interesse og optisk rydde dem som tidligere beskrevet31.
- Billede af det rensede væv med et lysarkmikroskop som tidligere beskrevet31. Alternativt kan du placere det ryddede væv i en glasbundskål og billede i FITC- og TRITC-kanalerne for at visualisere grønne (ikke-fotokonverterede) og røde (fotokonverterede) celler ved hjælp af en konfokal, roterende disk eller multifotonmikroskop.
6. Prøvebehandling og påvisning af fotokonverterede celler ved hjælp af vævsdisaggregering
- Bedøv musen med 5% isofluran i 5 min, sørg for tilstrækkelig bedøvelse ved at observere et tab af reflekser ved tåklemmen og ofre via cervikal dislokation 3-5 dage efter fotokonvertering.
- Saml og fordøje organerne af interesse som tidligere beskrevet13.
- Plade det fordøjede væv og læg dem i en inkubator for at klæbe natten over som tidligere beskrevet13.
- Den følgende dag afbildes de belagte celler i FITC- og TRITC-kanalerne for at visualisere grønne (ikke-fotokonverterede) og røde (fotokonverterede) celler som tidligere beskrevet13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De trin i operationen, der er beskrevet i denne protokol, er illustreret i figur 1. Kort sagt bedøves musen, og håret fjernes fra venstre brystkasse. Musen intuberes og ventileres derefter, hvilket gør det muligt for musen at modtage ilt, mens brysthulen er åben. Blødt væv fjernes for at udsætte brystkassen, og der foretages et snit i den 6. eller 7. interkostale muskel. En retraktor indsættes i det interkostale brud og frigives for at sprede de tilstødende ribben og udsætte venstre lunge og eventuelle fotokonvertible metastaser derpå. Lungen og metastaser udsættes derefter for blåt lys for at fotokonvertere de udsatte læsioner. Efter fotokonvertering fjernes retraktoren, ribbenene sys sammen igen, og den overliggende hud lukkes. Endelig fjernes overskydende luft fra brysthulen for at lette trykket på lungerne og give musen mulighed for at genoptage uafhængig, spontan åndedræt.
Protokollen beskrevet her kan tilpasses en række forskellige fotokonvertible/fotoomskiftelige proteiner. Sikring af, at fotokonverterede celler når deres maksimale fluorescensintensitet i den fotokonverterede kanal, kan lette deres identifikation i andre organer. De betingelser, der er nødvendige for at opnå maksimal fluorescensintensitet efter fotokonvertering, bør bestemmes empirisk, da de kan variere med andre aspekter af forsøget, såsom det fotokonvertible protein, der anvendes, og intensiteten af det lys, der anvendes til fotokonvertering. Figur 2B,C viser, hvordan fluorescensintensiteten ændrede sig i både FITC- (ikke-fotokonverterede) og TRITC-kanaler (fotokonverterede) kanaler som funktion af varigheden af eksponeringen for blåt lys i en ex vivo-prøve. Vi fastslog, at 6 minutters eksponering for blåt lys producerede det klareste signal i den fotokonverterede kanal, og at yderligere eksponering førte til fotoblegning. Vi målte derefter fluorescensintensiteten i begge kanaler før og efter 6 minutters eksponering for blåt lys, in vivo, og opnåede lignende resultater (figur 2D).
Dernæst blev hjernen, leveren og ikke-fotokonverteret højre lunge høstet fra mus, der gennemgik denne operation med (eksperimentel gruppe) og uden (kontrolgruppe) fotokonverteringslampen tændt. Vævene blev optisk renset som tidligere beskrevet31, anbragt i en glasbundskål og afbildet på et specialbygget multifotonmikroskop32 ved hjælp af en 25x 1,0 NA-objektivlinse og en excitationsbølgelængde på 880 nm. Fluorescens blev fanget for de grønne og røde kanaler ved hjælp af båndpasfiltrene henholdsvis 525/35 nm og 580/60 nm. Fotokonverterede og ikke-fotokonverterede celler kunne tydeligt identificeres i alle tre vævstyper fra mus, der gennemgik operationen med eksponering for blåt lys (figur 3). Som forventet blev der kun fundet ikke-fotokonverterede tumorceller i væv fra mus, der gennemgik operationen uden eksponering for blåt lys.
Figur 1: Oversigt over den kirurgiske protokol for lungefotokonverteringskirurgi. (A) Depileret mus placeret på det kirurgiske stadium og tapet på plads. B) En 10 mm cirkulær rydning af hud og blødt væv over brystkassen. (C) Indledende brud på interkostal muskel med stump kant mikrodissekerende saks. (D) Lukket retractor indsat i 10 mm interkostalt snit. E) Åben retractor, der eksponerer lungevæv. F) Fotokonverteringslampe anbragt direkte over musens åbne brystkasse. (G) Enkel kontinuerlig sutur, der inkorporerer ribben på begge sider af det interkostale snit. (H) Sutur strammet og sikret for at genoprette brystvæggens integritet. (I) Fjernelse af luft fra brysthulen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bestemmelse af de betingelser, der er nødvendige for at opnå maksimal fluorescensintensitet i fotokonverteret kanal. (A) Repræsentative billeder af eksponerede Dendra2-ekspressive lungemetastaser før eksponering for blåt lys i rumbelysning uden filtre og ved lav forstørrelse (1) og høj forstørrelse (2) og høj forstørrelse i FITC- (3) og TRITC-kanaler med vidvinkelbelysning (4). (B) Fluorescensbilleder af en Dendra2-ekspresserende lungemetastase før eksponering for blåt lys og efter 2 min, 4 min, 6 minutter og 8 minutters eksponering for blåt lys, ex vivo. (C) Normaliseret gennemsnitlig fluorescensintensitet af en Dendra2-ekspresserende lungemetastase som funktion af varigheden af eksponering for blåt lys, ex vivo. (D) Normaliseret gennemsnitlig fluorescensintensitet af en Dendra2-ekspresserende lungemetastase før og efter 6 minutters eksponering for blåt lys, in vivo. Skalastænger = 2 mm (A), 400 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af fotokonverterede (øverste række) og ikke-fotokonverterede (nederste række) tumorceller fundet i den kontralaterale lunge, hjerne og lever hos mus, der gennemgik fotokonverteringskirurgi. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Specialbygget 400 nm LED Array-lampe.(A) Fra og (B) Til. CF = Køleventilator, R = reflektor, LED = 400 nm LED med høj effekt. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir beskriver vi en kirurgisk protokol til selektiv fotokonvertering af tumorceller i lungen. Denne teknik gør det muligt for forskere selektivt at markere tumorceller i lungen og spore deres skæbne ved at genidentificere dem i hele kroppen på et senere tidspunkt, hvilket letter undersøgelsen af metastaser fra lungemetastaser. Ved hjælp af denne protokol var det muligt at visualisere fotokonverterede celler i hjernen, leveren og ikke-fotokonverteret højre lunge hos mus, der havde gennemgået operationen med fotokonvertering, hvilket indikerer, at disse celler respredte sig fra de fotokonverterede lungemetastaser til disse tertiære steder. Vi fandt ingen røde blodlegemer i museorganerne, der ikke gennemgik fotokonvertering, hvilket indikerer, at naturlig autofluorescens i celler ikke er lys nok til at blive forvekslet med fotokonverterede tumorceller.
Omhyggelig opmærksomhed på visse aspekter af eksperimentet kan øge succesraten for denne procedure. For det første skal protokollen for metastasegenerering og fotokonvertibelt / fotoomskifteligt protein overvejes ved generering af lungemetastaser. Det er blevet rapporteret, at nogle fluorescerende proteiner er immunogene 33,34,35,36. Således kan kræftceller, der udtrykker sådanne proteiner, ikke spontant metastasere i immunkompetente mus. Faktisk observerede vi, at primære tumorer dannes i både syngeneiske, immunkompetente (FVB) mus og immunkompromitterede (Rag2-/-) mus ved ortopisk injektion af 6DT1-Dendra2-celler. Imidlertid udviklede metastaser sig kun i Rag2-/- mus, hvilket indikerer, at Dendra2 kan være noget immunogent. Måder at overvinde den potentielle immunogenicitet af fluorescerende proteiner til at generere lungemetastaser omfatter anvendelse af en immunkompromitteret mus, generering af metastaser via haleveneinjektion, anvendelse af et andet fotokonvertibelt / fotoomskifteligt protein eller anvendelse af et transgent dyr, hvor det fotokonvertible / fotoomskiftelige protein er genetisk kodet, så musene toleriseres til proteinet37. Styrken og stabiliteten af det fluorescerende signal i den fotokonverterede kanal skal også overvejes. For mange fotokonvertible/fotoomskiftelige proteiner falder signalet i den fotokonverterede kanal over tid, da proteinet nedbrydes og fortyndes med celledeling. Vi og andre har tidligere vist, at fotokonverteret H2B-bundet Dendra2 pålideligt kan detekteres i 7 dage i delende celler og 16 dage i ikke-delende celler38,39. Sammenkædning af det fotokonvertible protein med et protein med en lav omsætningshastighed kan forlænge halveringstiden for det fotokonverterede signal. Metoder til fejlfinding af lungemetastasemodellen skal afhænge af forskningsmålet og den kræftcelletype, der anvendes.
For det andet er det vigtigt at time operationen korrekt baseret på sygdomsmodellen af interesse. De, der arbejder med sygdomsmodeller med hurtigt voksende lungemetastaser, kan have en begrænset tidsramme til at udføre operationen, før musene bliver for overvældet af tumorbyrden til at komme sig efter operationen og / eller overleve den ønskede tid efter operationen. En grundig forståelse af sygdomsmodellens tidslinje samt brugen af ikke-invasive billeddannelsesstrategier såsom mikrocomputertomografi kan hjælpe med timing af denne procedure.
For det tredje kan utilsigtet skæring af større kar under fjernelse af blødt væv forårsage overdreven blødning, hvilket fører til dårlig synlighed af det kirurgiske felt og / eller ekssanguination, som tidligere beskrevet40. Undgå større skibe og brug af en cauterizing pen under operationen kan forhindre dette. For det fjerde, når du indsætter og fjerner retraktoren, er det afgørende at holde retraktorbladene parallelt med brystvæggen til enhver tid. Vinklning af knivene mod lungen øger risikoen for lungeskader, og vinklning af knivene mod brystvæggen øger risikoen for at bryde brystvæggen i andre områder. Hvis det ikke synes muligt at indsætte eller fjerne retraktoren parallelt, kan den stumpe kantmikrodissekeringssaks bruges til at øge længden af det interkostale snit lidt, før du forsøger at indsætte/fjerne retraktoren igen. Endelig skal man sørge for, at brystkassen forsegles fuldstændigt ved afslutningen af operationen. Når ribbenene sys sammen igen, skal syningen påbegyndes ~ 1 mm før snittets start og afsluttes ~ 1 mm efter. Dette hjælper med at undgå resterende åbninger på enderne af snittet. Derudover skal du sørge for at trække og binde suturen tæt nok til at fjerne plads mellem ribbenene, men ikke så stramt, at suturerne river de tilstødende interkostale muskler og skaber yderligere brud. Hvis genforsegling af brysthulen ikke kan opnås, skal musen ofres humant under operationen, da den vil have store vanskeligheder eller ikke være i stand til at trække vejret alene, når mekanisk ventilation stoppes.
Lyskilden og den nøjagtige metode til fotokonvertering kan variere mellem laboratorier. Enhver lyskilde og metoder, der er sikre, konsistente og passende for modellen, kan anvendes. For eksempel kan fotokonvertering udføres ved at overføre musen til et stereoskop eller et andet mikroskop, der er i stand til at skinne lys med den bølgelængde og intensitet, der er nødvendig for fotokonvertering på den eksponerede lunge. Vi bruger en specialbygget 400 nm lysemitterende diode array-lampe, der er indstillet til sin højeste intensitet til fotokonvertering af Dendra2-ekspressive lungemetastaser (supplerende figur S1). For at understøtte lampen over musen og sikre, at lampen placeres i samme afstand over hver mus, skærer vi en åbning på 6,5 x 6,5 cm i bunden af en åben papkasse (18,4 cm (L) x 13,2 cm (B) x 7,3 cm (H)). Vi placerer kassen på hovedet over musen og hviler 8,5 x 8,5 cm lampen over 6,5 x 6,5 cm udskæringen (figur 1F), så lampen understøttes, og det blå lys kan nå det udsatte lungevæv.
Det er vigtigt at bemærke, at nogle aspekter af denne protokol, herunder kirurgi og anvendelse af anæstetika, kan ændre tumorcellernes formidlingskinetik og kapacitet 41,42,43,44. Som sådan skal der anvendes passende kontrol for at sikre, at resultaterne ikke forvirres af proceduren.
Hovedbegrænsningen ved denne teknik er, at kun metastaser på den udsatte del af lungen vil gennemgå fotokonvertering. Derfor vil ikke alle tumorceller, der respredes fra lungen, blive fotokonverteret, og enhver kvantificering af reformerede celler vil være relativ. På trods af denne begrænsning kan denne teknik stadig give værdifuld indsigt i tumorcelleremission, herunder bestemmelse af, om og hvornår det sker, hvad der fremmer eller forhindrer det og organotropisme af respredte celler. Så vidt vi ved, er dette den første teknik, der tillader selektiv mærkning og skæbnesporing af tumorceller i lungen. Afslutningsvis beskriver denne protokol en ny teknik, der kan bruges til at lette og forbedre undersøgelsen af tumorcellereformidling og metastase-til-metastase-såning uden genomisk analyse. Målretning af lungemetastaser gør proceduren nyttig og relevant for metastaseforskere, der studerer de fleste større kræftformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Wade Koba for hans hjælp med mikrocomputertomografi (S10RR029545), Vera DesMarais og Hillary Guzik fra Analytical Imaging Facility for deres træning og hjælp med mikroskopi, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, et Sir Henry Wellcome Postdoc-stipendium (221647/Z/20/Z) og en METAvivor Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
