Summary
Apresentamos um método para estudo da redisseminação de células tumorais a partir de metástases pulmonares envolvendo um protocolo cirúrgico para fotoconversão seletiva de metástases pulmonares, seguido da identificação de células tumorais redisseminadas em órgãos terciários.
Abstract
A metástase - a disseminação sistêmica do câncer - é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Embora a metástase seja comumente pensada como um processo unidirecional em que as células do tumor primário se disseminam e semeiam metástases, as células tumorais em metástases existentes também podem se redisseminare dar origem a novas lesões em sítios terciários, em um processo conhecido como "metástase de metástases" ou "semeadura de metástase para metástase". A semeadura de metástases para metástases pode aumentar a carga metastática e diminuir a qualidade de vida e a sobrevida do paciente. Portanto, compreender os processos por trás desse fenômeno é crucial para refinar as estratégias de tratamento de pacientes com câncer metastático.
Pouco se sabe sobre a semeadura de metástases para metástases, devido, em parte, a limitações logísticas e tecnológicas. Os estudos sobre a semeadura de metástases para metástases dependem principalmente de métodos de sequenciamento, o que pode não ser prático para os pesquisadores que estudam o momento exato dos eventos de semeadura de metástase para metástase ou o que os promove ou impede. Isso evidencia a falta de metodologias que facilitem o estudo da semeadura de metástases para metástases. Para resolver isso, desenvolvemos - e descrevemos aqui - um protocolo cirúrgico murino para a fotoconversão seletiva de metástases pulmonares, permitindo marcação específica e rastreamento do destino de células tumorais que se redisseminam do pulmão para sítios terciários. Até onde sabemos, este é o único método para estudar a redisseminação de células tumorais e a semeadura de metástases para metástases a partir dos pulmões que não requer análise genômica.
Introduction
Metástases são a principal causa de mortes relacionadas ao câncer1. O câncer metastático surge quando células do tumor primário se disseminam por todo o corpo e proliferam em tumores clinicamente detectáveis em órgãos distantes 2,3.
Embora a metástase seja comumente considerada como um processo unidirecional em que as células tumorais se disseminam a partir do tumor primário e colonizam órgãosdistantes4, evidências clínicas e experimentais crescentes sugerem que um processo multidirecional mais complexo está em jogo. Tem sido demonstrado que células tumorais circulantes podem resemear o tumor primário (se ainda existentes)5,6,7,8,9, e células tumorais de focos metastáticos existentes podem viajar para sítios terciários e dar origem a novas lesões10,11,12,13 . De fato, evidências de análises genômicas recentes sugerem que algumas lesões metastáticas não surgem do tumor primário, mas de outras metástases, fenômeno conhecido como "semeadura de metástases de metástases" ou "semeadura de metástase para metástase"14,15,16. A disseminação de metástases para metástases pode perpetuar o processo da doença mesmo após a remoção do tumor primário, aumentando a carga metastática e diminuindo a qualidade de vida e a sobrevida dos pacientes. Portanto, compreender os processos por trás da semeadura de metástase para metástase é crucial para refinar as estratégias de tratamento para pacientes com doença metastática.
Apesar das implicações clínicas potencialmente graves, pouco se sabe sobre a semeadura de metástases para metástases, devido, em parte, a limitações logísticas e tecnológicas. Os estudos em humanos são limitados pela escassez de amostras clínicas. A ressecção clínica e a biópsia de lesões metastáticas são incomuns, assim como a biópsia de órgãos aparentemente saudáveis, onde células tumorais disseminadas únicas podem se esconder. Isso significa que os estudos em humanos normalmente só são possíveis usando amostras de autópsia de indivíduos cujos tumores primários ainda estão em vigor ou foram ressecados anteriormente, mas ainda estão disponíveis para os pesquisadores. Quando essas amostras estão disponíveis, análises de linhagens da progressão do câncer devem ser realizadas por métodos desequenciamento14. No entanto, o sequenciamento em massa de tumores primários e metástases compatíveis não tem a sensibilidade necessária para o rastreamento abrangente da linhagem. Por exemplo, o sequenciamento em massa de uma lesão pode revelar um subclone que é indetectável em qualquer uma de suas lesões pareadas. Nesse caso, não seria possível determinar a origem desse subclone. Pode estar presente no tumor primário ou em outra metástase com frequência abaixo do limite de detecção, ou pode ter surgido após a colonização inicial da lesão metastática em que foi encontrado. O sequenciamento unicelular proporciona maior sensibilidade, mas seu alto custo limita a aplicação em larga escala dessa técnica. A natureza retrospectiva desses estudos também significa que eles fornecem informações limitadas sobre eventos metastáticos transitórios e o cenário da doença em diferentes pontos de tempo.
Em modelos animais, avanços tecnológicos recentes permitem o mapeamento filogenético prospectivo com alta resolução espacial e temporal 17,18,19,20. Essas técnicas utilizam a edição do genoma CRISPR/Cas9 para projetar células com um código de barras em evolução - mutações hereditárias que se acumulam ao longo do tempo. Após o sequenciamento, a linhagem de cada célula pode ser traçada com base no perfil mutacional de seu código de barras 17,18,19,20. De fato, essa tecnologia já está sendo usada para mapear a semeadura de metástase para metástase. Em trabalho recente, Zhang e col. demonstraram que células de câncer de mama e próstata em metástases ósseas se redisseminam do osso para semear metástases secundárias em múltiplosórgãos21.
Embora esses novos métodos tenham grande potencial para gerar mapas filogenéticos detalhados e de alta resolução da progressão do câncer, eles são altamente impraticáveis para aqueles que estudam o momento exato dos eventos de semeadura de metástase para metástase e o que os promove ou impede. Preencher essas lacunas de conhecimento é crucial para refinar nossa compreensão e tratamento do câncer metastático, mas há uma notável falta de tecnologias para facilitar tais estudos. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos recentemente - e apresentamos aqui - uma nova técnica que nos permite marcar especificamente células tumorais via fotoconversão em um sítio metastático (o pulmão) e, posteriormente, reidentificá-las em órgãos terciários. Recentemente, com essa técnica, demonstramos que células de câncer de mama se redisseminam a partir de metástases pulmonares e de órgãos terciários desementes13. Esta técnica também pode ser utilizada para determinar o momento dos eventos de redisseminação dentro de uma janela estreita e quantificar as células tumorais redisseminadas, facilitando o estudo do organotropismo das células redisseminadas e o que promove/impede a redisseminação.
Embora a fotoconversão e os sistemas cre/lox localmente induzíveis que substituem permanentemente uma proteína fluorescente por outra tenham sido usados anteriormente para marcar e rastrear células tumorais11,22,23, até onde sabemos, nenhuma abordagem para marcação espaço-temporal de células tumorais foi otimizada para atingir o pulmão - um dos sítios mais comuns de metástase entre homens e mulheres diagnosticados com qualquer um dos 14 cânceres mais comuns24. Qualquer tipo de célula cancerosa e qualquer protocolo para geração de metástases pulmonares podem ser usados com nosso procedimento, tornando-o amplamente útil para pesquisadores de metástases. Todas as células cancerosas usadas para gerar metástases pulmonares devem expressar uma proteína fotoconversível ou fotocomutável, e os pesquisadores podem escolher qual proteína usar com base em suas necessidades e recursos específicos. Neste estudo, usamos 6DT1 células de câncer de mama que expressaram de forma estável a proteína fluorescente fotoconversível verde-vermelho Dendra2 (células 6DT1-Dendra2)25 marcadas com a histona H2B. Foram injetadas 5,0 × 104 células 6DT1-Dendra2 no quarto coxim gorduroso mamário de fêmeas de camundongos Rag2-/-. Os tumores primários foram palpáveis entre 12 e 16 dias após a injeção e não foram ressecados durante todo o experimento. Metástases pulmonares espontâneas se desenvolveram entre 19 e 26 dias após a injeção de células tumorais. As cirurgias de fotoconversão foram realizadas entre 26 e 29 dias após a injeção das células tumorais. Os camundongos foram sacrificados 72 h após a cirurgia devido à carga de metástases pulmonares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.
Antes da cirurgia, as metástases pulmonares devem ser geradas em camundongos usando células cancerosas que expressam uma proteína fotoconversível/fotocomutável; Vários protocolos para geração de metástases pulmonares foram publicados 26,27,28.
1. Preparo para a cirurgia
- Prepare áreas de trabalho distintas para preparação de camundongos (depilação e intubação), cirurgia e recuperação.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave.
NOTA: Como uma técnica somente de pontas é usada para esta cirurgia, um esterilizador de esferas quentes pode ser usado para reesterilizar instrumentos para procedimentos subsequentes. - Ligue a plataforma cirúrgica aquecida e deixe-a alcançar e estabilizar a 37-40 °C.
- Induzir anestesia com isoflurano a 5% e, em seguida, baixar o isoflurano para 3%. Realizar testes de pinça dos dedos dos pés periodicamente durante todo o procedimento para avaliar a adequação da anestesia.
- Coloque o camundongo anestesiado em decúbito lateral direito. Remova os pelos da parte superior esquerda do tórax/corpo lateral (ver Figura 1A) aplicando creme depilatório na área. Umedeça um pedaço de gaze ou papel toalha com água e limpe o cabelo e o creme depilatório. Repita conforme necessário até que todo o cabelo seja removido do campo cirúrgico.
NOTA: Não deixe o creme depilatório no mouse por mais de 20 s, pois isso pode danificar a pele. - Amarre um nó duplo ~3 mm acima da base de um cateter 22G com fio de seda 2-0. Deixe caudas de 2 polegadas de comprimento.
- Intubar o camundongo com esse cateter conforme previamente descrito29,30. Para confirmar o sucesso da intubação, conecte um bulbo de insuflação na extremidade do cateter e aperte suavemente.
NOTA: Camundongos que foram intubados com sucesso experimentarão elevação torácica bilateral com aperto de bulbo. - Fixe firmemente a sutura de seda 2-0 ao redor do focinho do rato com um nó duplo para manter o cateter de intubação no lugar.
2. Cirurgia para exposição do pulmão
OBS: Realizar todas as etapas da cirurgia (Figura 1), inclusive a fotoconversão, em capuz ou gabinete de fluxo laminar para evitar contaminação do campo cirúrgico.
- Lave as mãos com sabão antisséptico e use luvas estéreis novas.
NOTA: Como uma técnica somente de pontas é usada para esta cirurgia, luvas não estéreis também podem ser usadas. Recomenda-se higienizar luvas não estéreis com um desinfetante à base de álcool. - Preparar uma dose de 0,1 mg/kg de buprenorfina (0,03 mg/mL) e injetar por via subcutânea para analgesia.
NOTA: A analgesia multimodal, incluindo bloqueadores da dor locais e anti-inflamatórios não esteroides, deve ser usada em conjunto com a buprenorfina se não se espera que interfiram com a biologia de interesse. - Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos de camundongo para evitar danos na córnea.
- Posicionar o camundongo em decúbito lateral direito sobre a plataforma cirúrgica aquecida.
- Conecte o ventilador ao cateter de intubação. Tome cuidado para manter o cateter estável, pois mesmo pequenos movimentos podem atrapalhar o posicionamento do cateter e levar a uma ventilação deficiente.
- Observar elevação e queda torácica bilateral, estável e controlada pelo ventilador.
- Fixar os membros à plataforma cirúrgica com fita adesiva. Estabilizar o campo cirúrgico colocando outro pedaço de fita ao longo do dorso do camundongo e prendendo a pele dorsal e a pele à plataforma cirúrgica (Figura 1A).
- Abra os instrumentos cirúrgicos esterilizados.
- Aplicar solução de clorexidina na pele do rato para esterilizar o sítio cirúrgico.
- Identificar a área ~7 mm à esquerda do esterno e ~7 mm acima do rebordo subcostal. Levante a pele sobre esta área com pinça e faça uma incisão circular de ~10 mm usando uma tesoura microdissecante afiada, tomando o cuidado de cortar apenas a pele.
- Retirar o tecido mole sobre a caixa torácica (Figura 1B). Cauterizar os vasos principais em ambas as extremidades com uma caneta cauterizada.
NOTA: Além de excisar todo o tecido mole subjacente à incisão circular de 10 mm na pele, a remoção de algum tecido mole não muscular adicional do perímetro facilita as etapas futuras do procedimento. - Com uma mão, use pinças para elevar a6ª ou7ª costela. Por outro lado, utilizar uma única lâmina da tesoura romba microdissecante - angulada paralela à parede torácica, borda arredondada voltada para baixo - e perfurar cuidadosamente o6º ou7º músculo intercostal para entrar na cavidade torácica (Figura 1C). Gire suavemente a tesoura conforme necessário e corte para fazer uma incisão de ~10 mm no espaço intercostal, tomando cuidado para evitar tocar o tecido pulmonar e cortar as costelas.
- Descarregar delicadamente ar comprimido em direção à incisão intercostal para aumentar o espaço entre o pulmão e a parede torácica. Descarregar o ar primeiro no pulso ou na mão para encontrar a força de fluxo adequada e limpar o bico de quaisquer detritos, depois em rajadas curtas na incisão para evitar lesões pulmonares.
- Com uma mão, use pinças para elevar a6ª ou7ª costela. Com a outra mão, segure o afastador fechado e insira-o na incisão intercostal. Orientar as lâminas do espaçador de forma que fiquem paralelas à parede torácica, tomando cuidado para não tocar o próprio pulmão (Figura 1D).
- Uma vez instalado o afastador, solte lentamente a alça, permitindo que o afastador abra e exponha o pulmão (Figura 1E). A Figura 2A mostra imagens representativas de metástases pulmonares expostas antes da fotoconversão, incluindo sua aparência a olho nu, e nos canais fluorescentes FITC (verde, não fotoconvertido) e TRITC (vermelho, fotoconvertido) usando iluminação de campo amplo.
3. Fotoconversão de metástases pulmonares
Observação : detalhes e variações sobre as etapas a seguir podem ser encontrados na discussão.
- Aplique suavemente 2-3 gotas de PBS estéril aquecido a 37 °C no tecido pulmonar exposto para evitar a secagem.
- Coloque um pedaço de papel alumínio estéril com um pequeno recorte sobre o mouse. Posicione o recorte diretamente sobre o tecido pulmonar exposto e dimensione-o para expor apenas a porção aberta do tórax e alguns milímetros de tecido mole circundante e pele para garantir a fotoconversão apenas do pulmão exposto.
- Coloque uma caixa com um recorte sobre o mouse e papel alumínio. Certifique-se de que o recorte esteja diretamente sobre o pulmão exposto.
- Coloque a lâmpada de fotoconversão diretamente sobre o recorte da caixa (Figura 1F).
- Ligue a lâmpada de fotoconversão e permita 6 min de iluminação contínua do tecido pulmonar exposto.
NOTA: Monitore os sinais vitais do mouse usando os programas de monitoramento fisiológico no ventilador. - Após a fotoconversão, desligue a lâmpada e remova a lâmpada, a caixa e a máscara de folha de alumínio do mouse.
4. Procedimento para fechamento da parede torácica
- Repetir o passo 2.13 para separar o pulmão da parede torácica.
- Segure cuidadosamente a alça do afastador e aperte para fechar as lâminas.
- Manobrar o afastador fechado para fora do espaço intercostal, tomando cuidado para não tocar o tecido pulmonar.
- Com fio de seda 5-0, fechar a incisão intercostal com um padrão de sutura simples e contínua que incorpora a costela em ambos os lados da incisão (Figura 1G). Puxe a sutura com força para garantir que as bordas da ferida sejam aposicionais e restabelecer a integridade da parede torácica (Figura 1H). Tome cuidado para não apertar demais a sutura, pois isso pode rasgar os músculos intercostais.
- Fixar a sutura amarrando as duas extremidades da sutura juntas 4x. Corte a cauda da sutura o mais próximo possível do nó.
- Feche a pele com grampos cirúrgicos.
- Retire o excesso de ar da cavidade torácica com uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 28 G acoplada. Localize o processo xifoide tactilmente e insira a agulha logo abaixo, avançando em direção ao ombro esquerdo para entrar na cavidade torácica através do diafragma. Retirar a seringa para ~1 mL; Retire a agulha do rato e descarregue o ar da seringa. Repita este processo 3-4x.
OBS: Tome cuidado para não perfurar nenhum órgão interno. Além disso, é importante usar uma seringa de 1 mL e repetir o procedimento 3-4x em vez de usar uma seringa de maior volume e tentar remover todo o ar de uma só vez. O uso de uma seringa de maior volume pode resultar em um vácuo muito grande na cavidade torácica e levar à distensão e danos ao tecido pulmonar. - Desligue o isoflurano.
- Continue a ventilação com oxigênio a 100% até que o camundongo mostre sinais de despertar.
- Quando o mouse mostrar sinais de despertar, desconecte o cateter de intubação do ventilador, corte a sutura ao redor do focinho e extube o camundongo.
- Destape o mouse e transfira-o para uma gaiola limpa colocada ~2 pés abaixo de uma lâmpada de calor. Monitore até que esteja totalmente recuperado. Se o camundongo apresentar sinais de dificuldade respiratória ou falta de mobilidade, anestesiar-se com isoflurano a 5% por 5 min, garantir anestesia adequada observando perda de reflexos ao pinçar os dedos dos pés e sacrificar por luxação cervical.
- Assim que o camundongo acordar completamente da anestesia e começar a se mover, prepare outra dose de 0,1 mg/kg de buprenorfina e injete-a por via subcutânea para analgesia pós-operatória.
- Após a cirurgia, certifique-se de que os ratos sejam alojados individualmente. Fornecer antibióticos na água potável (enrofloxacina, concentração final 0,4 mg/mL).
- Nos 3 dias seguintes à cirurgia, verifique o rato duas vezes por dia em busca de sinais de angústia. Para o controle da dor, administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina (0,03 mg/mL) por via subcutânea a cada 4-6 horas. Eutanasie o rato se ele mostrar sinais de infecção, imobilidade ou dificuldade respiratória. Após o terceiro dia, os ratos podem ser verificados uma vez por dia.
5. Processamento de amostras e detecção de células fotoconvertidas usando limpeza de tecidos
- Entre 3 e 5 dias (ou o tempo desejado) após a cirurgia de fotoconversão, anestesiar o camundongo com isoflurano a 5%, reduzir o isoflurano de 5% para 2,5% após a indução, assegurar anestesia adequada observando perda dos reflexos ao pinçar os dedos dos pés e realizar perfusão transcárdica terminal com 10 mL de PBS à temperatura ambiente, seguido de 10 mL de paraformaldeído a 4% resfriado a 4 °C, conforme descrito anteriormente31.
- Coletar os órgãos de interesse e limpá-los opticamente conforme descrito anteriormente31.
- Obtenha imagens dos tecidos clareados com um microscópio de lâmina de luz, conforme descrito anteriormente31. Alternativamente, coloque os tecidos limpos em uma placa de fundo de vidro e imagem nos canais FITC e TRITC para visualizar células verdes (não fotoconvertidas) e vermelhas (fotoconvertidas) usando um microscópio confocal, disco giratório ou microscópio multifóton.
6. Processamento de amostras e detecção de células fotoconvertidas usando desagregação tecidual
- Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% por 5 min, garantir anestesia adequada observando perda de reflexos ao pinçar os dedos e sacrificar via luxação cervical 3-5 dias após a fotoconversão.
- Coletar e digerir os órgãos de interesse conforme descrito anteriormente13.
- Plaquear os tecidos digeridos e colocá-los em uma incubadora para aderir durante a noite, como descrito anteriormente13.
- No dia seguinte, obter imagens das células plaqueadas nos canais FITC e TRITC para visualizar as células verdes (não fotoconvertidas) e vermelhas (fotoconvertidas), conforme descrito anteriormente13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os passos da cirurgia descritos neste protocolo estão ilustrados na Figura 1. Em resumo, o camundongo é anestesiado e os pelos são removidos do tórax esquerdo. O camundongo é então intubado e ventilado, o que permite que o camundongo receba oxigênio enquanto a cavidade torácica está aberta. O tecido mole é removido para expor a caixa torácica, e uma incisão é feita no6º ou7º músculo intercostal. Um afastador é inserido na brecha intercostal e liberado para espalhar as costelas adjacentes e expor o pulmão esquerdo e quaisquer metástases fotoconversíveis sobre ele. O pulmão e as metástases são então expostos à luz azul para fotoconverter as lesões expostas. Após a fotoconversão, o afastador é removido, as costelas são suturadas novamente juntas e a pele sobrejacente é fechada. Finalmente, o excesso de ar é removido da cavidade torácica para aliviar a pressão sobre os pulmões e permitir que o rato retome a respiração espontânea independente.
O protocolo aqui descrito pode ser adaptado a uma série de diferentes proteínas fotoconversíveis/fotocomutáveis. Garantir que as células fotoconvertidas atinjam seu pico de intensidade de fluorescência no canal fotoconvertido pode facilitar sua identificação em outros órgãos. As condições necessárias para atingir o pico de intensidade de fluorescência após a fotoconversão devem ser determinadas empiricamente, pois podem variar com outros aspectos do experimento, como a proteína fotoconversível que está sendo usada e a intensidade da luz usada para fotoconverter. A Figura 2B,C demonstra como a intensidade da fluorescência mudou nos canais FITC (não fotoconvertido) e TRITC (fotoconvertido) em função da duração da exposição à luz azul em uma amostra ex vivo. Determinamos que 6 min de exposição à luz azul produziram o sinal mais brilhante no canal fotoconvertido e que a exposição adicional levou ao fotoclareamento. Em seguida, medimos a intensidade da fluorescência em ambos os canais antes e após 6 min de exposição à luz azul, in vivo, e obtivemos resultados semelhantes (Figura 2D).
Em seguida, o cérebro, o fígado e o pulmão direito não fotoconvertido foram retirados de camundongos submetidos a essa cirurgia com (grupo experimental) e sem (grupo controle) a lâmpada de fotoconversão ligada. Os tecidos foram opticamente limpos como descrito anteriormente31, colocados em uma placa de fundo de vidro e fotografados em um microscópio multifóton32 personalizado usando uma lente objetiva de 25x 1,0 NA e um comprimento de onda de excitação de 880 nm. A fluorescência foi capturada para os canais verde e vermelho usando os filtros passa-banda 525/35 nm e 580/60 nm, respectivamente. Células fotoconvertidas e não fotoconvertidas puderam ser claramente identificadas nos três tipos de tecidos de camundongos submetidos à cirurgia com exposição à luz azul (Figura 3). Como esperado, apenas células tumorais não fotoconvertidas foram encontradas nos tecidos de camundongos submetidos à cirurgia sem exposição à luz azul.
Figura 1: Visão geral do protocolo cirúrgico para a cirurgia de fotoconversão pulmonar. (A) Camundongo depilado, colocado no palco cirúrgico e fixado em posição. (B) Uma limpeza circular de 10 mm da pele e dos tecidos moles sobre a caixa torácica. (C) Ruptura inicial do músculo intercostal com tesoura microdissecante de borda romba. (D) Espaçador fechado inserido em incisão intercostal de 10 mm. (E) Afastador aberto expondo tecido pulmonar. (F) Lâmpada de fotoconversão colocada diretamente acima do tórax aberto do mouse. (G) Sutura contínua simples que incorpora a costela em ambos os lados da incisão intercostal. (H) Sutura apertada e fixada para restabelecer a integridade da parede torácica. (I) Retirada de ar da cavidade torácica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Determinação das condições necessárias para atingir o pico de intensidade de fluorescência no canal fotoconvertido. (A) Imagens representativas de metástases pulmonares expostas que expressam Dendra2 antes da exposição à luz azul em iluminação ambiente sem filtros e em baixa magnificação (1) e alta magnificação (2), e alta magnificação nos canais FITC (3) e TRITC com iluminação de campo largo (4). (B) Imagens de fluorescência de metástase pulmonar que expressa Dendra2 antes da exposição à luz azul e após 2 min, 4 min, 6 min e 8 min de exposição à luz azul, ex vivo. (C) Intensidade de fluorescência média normalizada de uma metástase pulmonar que expressa Dendra2 em função do tempo de exposição à luz azul, ex vivo. (D) Intensidade média normalizada da fluorescência de uma metástase pulmonar que expressa Dendra2 antes e após 6 min de exposição à luz azul, in vivo. Barras de escala = 2 mm (A), 400 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de células tumorais fotoconvertidas (fileira superior) e não fotoconvertidas (fileira inferior) encontradas no pulmão, cérebro e fígado contralaterais de camundongos submetidos à cirurgia de fotoconversão. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Lâmpada LED Array personalizada de 400 nm.(A) Desligado e (B) ligado. CF = Ventilador de resfriamento, R = Refletor, LED = LED de alta potência de 400 nm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste trabalho, descrevemos um protocolo cirúrgico para a fotoconversão seletiva de células tumorais no pulmão. Essa técnica permite que os pesquisadores marquem seletivamente as células tumorais no pulmão e rastreiem seu destino, reidentificando-as em todo o corpo em um momento posterior, facilitando o estudo de metástases de metástases pulmonares. Com esse protocolo, foi possível visualizar células fotoconvertidas no cérebro, fígado e pulmão direito não fotoconvertido de camundongos submetidos à cirurgia com fotoconversão, indicando que essas células se redisseminaram das metástases pulmonares fotoconvertidas para esses sítios terciários. Não encontramos hemácias nos órgãos de camundongos que não sofreram fotoconversão, indicando que a autofluorescência natural nas células não é brilhante o suficiente para ser confundida com células tumorais fotoconvertidas.
Uma atenção cuidadosa a certos aspectos do experimento pode aumentar a taxa de sucesso desse procedimento. Primeiro, ao gerar metástases pulmonares, o protocolo para geração de metástases e proteína fotoconversível/fotocomutável deve ser considerado. Tem sido relatado que algumas proteínas fluorescentes são imunogênicas 33,34,35,36. Assim, células cancerosas que expressam tais proteínas podem não metastatizar espontaneamente em camundongos imunocompetentes. De fato, observamos que tumores primários se formam em camundongos singênicos, imunocompetentes (FVB) e imunocomprometidos (Rag2-/-) após injeção ortotópica de células 6DT1-Dendra2. No entanto, as metástases só se desenvolveram em camundongos Rag2-/-, indicando que Dendra2 pode ser um pouco imunogênico. Maneiras de superar a potencial imunogenicidade de proteínas fluorescentes para gerar metástases pulmonares incluem o uso de um camundongo imunocomprometido, a geração de metástases via injeção na veia da cauda, o uso de uma proteína fotoconversível/fotocomutável diferente ou o uso de um animal transgênico no qual a proteína fotoconversível/fotocomutável é codificada geneticamente para que os camundongos sejam tolerados à proteína37. A força e a estabilidade do sinal fluorescente no canal fotoconvertido também devem ser consideradas. Para muitas proteínas fotoconversíveis/fotocomutáveis, o sinal no canal fotoconvertido diminui com o tempo à medida que a proteína é degradada e diluída com a divisão celular. Nós e outros já demonstramos que o Dendra2 fotoconvertido ligado ao H2B pode ser detectado de forma confiável por 7 dias em células em divisão e 16 dias em células não em divisão38,39. Ligar a proteína fotoconversível a uma proteína com uma baixa taxa de turnover pode estender a meia-vida do sinal fotoconvertido. Os métodos para solução de problemas do modelo de metástase pulmonar devem depender do objetivo da pesquisa e do tipo de célula cancerosa que está sendo utilizada.
Em segundo lugar, é importante cronometrar a cirurgia adequadamente com base no modelo de doença de interesse. Aqueles que trabalham com modelos de doença com metástases pulmonares de crescimento rápido podem ter um período de tempo limitado para realizar a cirurgia antes que os camundongos fiquem muito sobrecarregados com a carga tumoral para se recuperar da cirurgia e/ou sobreviver à quantidade desejada de tempo após a cirurgia. Uma compreensão completa da linha do tempo do modelo de doença, bem como o uso de estratégias de imagem não invasivas, como a microtomografia computadorizada, podem ajudar a cronometrar esse procedimento.
Terceiro, o corte inadvertido dos grandes vasos durante a remoção de partes moles pode causar sangramento excessivo, levando à má visibilidade do campo cirúrgico e/ou exsanguinação, como descrito anteriormente40. Evitar grandes vasos e usar uma caneta cauterizante durante a cirurgia pode evitar isso. Quarto, ao inserir e remover o afastador, é crucial manter as lâminas do afastador sempre paralelas à parede torácica. Inclinar as lâminas em direção ao pulmão aumenta o risco de dano pulmonar, e inclinar as lâminas em direção à parede torácica aumenta o risco de romper a parede torácica em outras áreas. Se a inserção ou remoção paralela do espaçador não parecer possível, a tesoura microdissecante de borda romba pode ser usada para aumentar ligeiramente o comprimento da incisão intercostal antes de tentar inserir/remover o afastador novamente. Finalmente, deve-se tomar cuidado para garantir que a caixa torácica seja completamente selada no final da cirurgia. Ao suturar as costelas novamente, a costura deve ser iniciada ~1 mm antes do início da incisão e terminada ~1 mm depois. Isso ajuda a evitar aberturas residuais nas extremidades da incisão. Além disso, tome cuidado para puxar e amarrar a sutura com força suficiente para eliminar o espaço entre as costelas, mas não tão apertado que as suturas rasguem os músculos intercostais adjacentes e criem brechas adicionais. Se não for possível conseguir selar novamente a cavidade torácica, o camundongo deve ser sacrificado humanamente durante a cirurgia, pois terá grande dificuldade ou será incapaz de respirar sozinho quando a ventilação mecânica for interrompida.
A fonte de luz e a metodologia exata para fotoconversão podem variar entre os laboratórios. Qualquer fonte de luz e metodologias que sejam seguras, consistentes e apropriadas para o modelo podem ser usadas. Por exemplo, a fotoconversão pode ser realizada transferindo o mouse para um estereoscópio ou outro microscópio capaz de iluminar o comprimento de onda e a intensidade necessários para a fotoconversão no pulmão exposto. Usamos uma lâmpada de matriz de diodos emissores de luz de 400 nm construída sob medida para sua mais alta intensidade para fotoconverter metástases pulmonares que expressam Dendra2 (Figura Suplementar S1). Para apoiar a lâmpada acima do mouse e garantir que a lâmpada seja colocada na mesma distância acima de cada mouse, cortamos uma abertura de 6,5 x 6,5 cm na parte inferior de uma caixa de papelão aberta (18,4 cm (L) x 13,2 cm (W) x 7,3 cm (H)). Colocamos a caixa de cabeça para baixo sobre o mouse e apoiamos a lâmpada de 8,5 x 8,5 cm sobre o recorte de 6,5 x 6,5 cm (Figura 1F), de modo que a lâmpada fique apoiada e a luz azul possa atingir o tecido pulmonar exposto.
É importante ressaltar que alguns aspectos desse protocolo, incluindo a cirurgia e o uso de anestésicos, podem alterar a cinética de disseminação e a capacidade das células tumorais 41,42,43,44. Como tal, devem ser utilizados controlos adequados para garantir que os resultados não sejam confundidos pelo procedimento.
A principal limitação dessa técnica é que apenas metástases na porção exposta do pulmão sofrerão fotoconversão. Portanto, nem toda célula tumoral que se redissemina do pulmão será fotoconvertida e qualquer quantificação de células redisseminadas será relativa. Apesar dessa limitação, essa técnica ainda pode fornecer informações valiosas sobre a redisseminação de células tumorais, incluindo determinar se e quando ela acontece, o que a promove ou previne e o organotropismo de células redisseminadas. Até onde sabemos, esta é a primeira técnica que permite a marcação seletiva e o rastreamento do destino de células tumorais no pulmão. Em conclusão, este protocolo descreve uma nova técnica que pode ser usada para facilitar e aprimorar o estudo da redisseminação de células tumorais e semeadura de metástases para metástases sem análise genômica. O direcionamento para metástases pulmonares torna o procedimento útil e relevante para os pesquisadores de metástases que estudam a maioria dos principais tipos de câncer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Wade Koba por sua assistência com microtomografia computadorizada (S10RR029545), Vera DesMarais e Hillary Guzik do Analytical Imaging Facility por seu treinamento e assistência com microscopia, ao Einstein Montefiore Cancer Center, ao National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), ao Gruss Lipper Biophotonics Center, ao Integrated Imaging Program for Cancer Research, uma bolsa de pós-doutorado Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) e um Prêmio METAvivor de Desenvolvimento de Carreira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
