Summary
肺転移の選択的光変換のための外科的プロトコルを含む肺転移からの腫瘍細胞の再分配を研究する方法を提示し、続いて第三次臓器における再播種性腫瘍細胞の同定を行います。
Abstract
転移(がんの全身性広がり)は、がん関連死の主な原因です。転移は、原発腫瘍の細胞が播種して転移を播種する一方向のプロセスであると一般的に考えられていますが、既存の転移の腫瘍 細胞も再播種し、「転移からの転移」または「転移から転移への播種」として知られるプロセスで三次部位に新しい病変を生じさせる可能性があります。転移から転移への播種は、転移の負担を増加させ、患者の生活の質および生存率を低下させる可能性がある。したがって、この現象の背後にあるプロセスを理解することは、転移性がん患者の治療戦略を洗練させるために重要です。
転移から転移への播種については、物流上および技術上の限界もあって、ほとんど知られていない。転移から転移への播種に関する研究は、主にシーケンシング法に依存しており、転移から転移への播種イベントの正確なタイミングや、それらを促進または防止するものを研究する研究者にとっては実用的ではない可能性があります。これは、転移から転移への播種の研究を容易にする方法論の欠如を浮き彫りにしています。これに対処するために、我々は、肺転移の選択的光変換のためのマウス外科的プロトコルを開発し、本明細書に記載し、肺から三次部位に再播種する腫瘍細胞の特異的マーキングと運命追跡を可能にする。私たちの知る限り、これは腫瘍細胞の再播種と肺からの転移から転移への播種を研究するための唯一の方法であり、ゲノム解析を必要としません。
Introduction
転移は、がん関連死の主な原因です1。転移性がんは、原発腫瘍の細胞が全身に播種し、遠隔臓器の臨床的に検出可能な腫瘍に増殖するときに発生します2,3。
転移は、腫瘍細胞が原発腫瘍から播種し、離れた臓器にコロニーを形成する一方向のプロセスであると一般的に考えられていますが4、臨床的および実験的証拠の増加は、より複雑で多方向のプロセスが作用していることを示唆しています。循環腫瘍細胞は原発腫瘍を再播種することができ(まだ存在する場合)5,6,7,8,9、および既存の転移性病巣からの腫瘍細胞が三次部位に移動して新しい病変を引き起こす可能性があることが示されています10,11,12,13.実際、最近のゲノム解析からの証拠は、一部の転移性病変が原発腫瘍からではなく、他の転移から生じることを示唆しています-「転移からの転移」または「転移から転移への播種」として知られる現象14,15,16。転移から転移への播種は、原発腫瘍を切除した後でも疾患プロセスを永続させ、転移負荷を増加させ、患者の生活の質と生存率を低下させる可能性があります。したがって、転移から転移への播種の背後にあるプロセスを理解することは、転移性疾患患者の治療戦略を洗練させるために重要です。
潜在的に重篤な臨床的影響にもかかわらず、転移から転移への播種についてはほとんど知られていない、一部は物流上および技術上の限界のためである。ヒトでの研究は、臨床サンプルの不足によって制限されています。転移性病変の臨床的切除および生検は、単一の播種性腫瘍細胞が潜んでいる可能性のある一見健康な臓器の生検と同様にまれである。つまり、ヒトでの研究は、通常、原発腫瘍がまだ残っているか、以前に切除されたが研究者がまだ利用できる個人の剖検サンプルを使用してのみ可能です。そのような試料が入手可能な場合、癌進行の系統解析は、配列決定法を用いて実施されなければならない14。しかしながら、一致した原発腫瘍および転移の一括シーケンシングは、包括的な系統追跡に必要な感度を有していない。例えば、1つの病変のバルクシーケンシングにより、一致した病変のいずれでも検出できないサブクローンが明らかになることがあります。この場合、このサブクローンの起源を特定することはできません。原発腫瘍または別の転移に検出限界を下回る頻度で存在していたか、またはそれが発見された転移性病変の最初のコロニー形成後に発生した可能性があります。シングルセルシーケンシングは感度を向上させますが、コストが高いため、この手法の大規模な適用は制限されます。これらの研究のレトロスペクティブな性質は、一過性の転移事象と異なる時点での疾患の状況に関する洞察が限られていることも意味します。
動物モデルでは、最近の技術の進歩により、高い空間的および時間的分解能を備えた前向き系統発生マッピングが可能になりました17,18,19,20。これらの技術は、CRISPR/Cas9ゲノム編集を利用して、進化するバーコード(時間の経過とともに蓄積する遺伝性変異)を持つ細胞を操作します。シーケンシングでは、バーコード17、18、19、20の突然変異プロファイルに基づいて各細胞の系統をたどることができます。実際、このような技術は、転移から転移への播種をマッピングするためにすでに使用されています。最近の論文で、Zhangらは、骨転移中の乳がん細胞と前立腺がん細胞が骨から再播種し、複数の臓器に二次転移を播種することを実証しました21。
これらの新しい方法は、がんの進行に関する詳細で高解像度の系統図を作成する大きな可能性を秘めていますが、転移から転移への播種イベントの正確なタイミングと、それらを促進または予防するものを研究している人にとっては、非常に実用的ではありません。これらの知識のギャップを埋めることは、転移性がんの理解と治療を洗練させるために不可欠ですが、そのような研究を促進するための技術が著しく不足しています。このニーズに対処するために、私たちは最近、転移部位(肺)の光変換を介して腫瘍細胞を特異的にマーキングし、その後三次臓器でそれらを再識別できる新しい技術を開発し、ここに提示します。この手法を用いて、我々は最近、乳がん細胞が肺転移から再播種し、第三次臓器に種をまくことを示した13。この手法は、狭いウィンドウ内で再播種イベントのタイミングを決定し、再播種した腫瘍細胞を定量するためにも使用でき、再播種された細胞の器官向性および再播種を促進/防止するものの研究を容易にします。
ある蛍光タンパク質を別の蛍光タンパク質に恒久的に置き換える光変換および局所誘導性cre/loxシステムは、腫瘍細胞のマーキングと追跡に以前に使用されてきましたが11,22,23、私たちの知る限り、腫瘍細胞の時空間マーキングのアプローチは、最も一般的な14の癌のいずれかと診断された男性と女性の間で最も一般的な転移部位の1つである肺を標的にするように最適化されていません24.肺転移生成のためのあらゆるがん細胞タイプとプロトコルを私たちの手順で使用することができ、転移研究者にとって広く有用です。肺転移の生成に使用されるすべてのがん細胞は、光変換性または光切り替え可能なタンパク質を発現する必要があり、研究者は特定のニーズとリソースに基づいて使用するタンパク質を選択できます。本研究では、ヒストンH2Bにタグ付けされた光変換可能な緑色から赤色の蛍光タンパク質Dendra2(6DT1-Dendra2細胞)25を安定に発現する6DT1乳癌細胞を用いた。雌のRag2-/-マウスの4番目の乳腺脂肪パッドに5.0×104 6DT1-Dendra2細胞を注入した。原発腫瘍は注射後12〜16日の間に触知可能であり、実験期間中は切除されなかった。自然肺転移は、腫瘍細胞注射後19〜26日の間に発症した。光変換手術は、腫瘍細胞注射後26〜29日の間に行われました。マウスは、肺転移の負担のために術後72時間までに犠牲にされました。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバートアインシュタイン医科大学の施設動物管理および使用委員会による事前承認を含む、脊椎動物の使用に関するガイドラインおよび規制に従って実行されています。
手術に先立ち、光変換性/光スイッチ性タンパク質を発現するがん細胞を用いたマウスに肺転移を発生させます。肺転移生成のためのいくつかのプロトコルが公開されています26,27,28。
1.手術の準備
- マウスの準備(脱毛と挿管)、手術、および回復のために、個別の作業領域を準備します。
- すべての手術器具をオートクレーブで滅菌します。
注:この手術にはチップのみの技術が使用されるため、ホットビーズ滅菌器を使用して、その後の手順のために器具を再滅菌することができます。 - 加熱された手術プラットフォームの電源を入れ、37〜40°Cに到達して安定させます。
- 5%イソフルランで麻酔を誘発し、イソフルランを3%に下げます。麻酔の妥当性を評価するために、手順全体を通して定期的につま先のつまみテストを実行します。
- 麻酔をかけたマウスを右外側褥瘡の位置に置きます。左上胸/脇腹の毛を取り除きます( 図1Aを参照)その部分に脱毛クリームを塗ります。ガーゼまたはペーパータオルを水で湿らせ、髪と脱毛クリームを拭き取ります。すべての髪の毛が手術野から取り除かれるまで、必要に応じて繰り返します。
注意: 脱毛クリームをマウスに20秒以上放置すると、皮膚に損傷を与える可能性があるため、マウスに放置しないでください。 - 22Gのカテーテルの基部から~3mm上に2-0のシルク縫合糸でダブルノットを結びます。2インチの長さの尾を残します。
- 前述のように、このカテーテルでマウスを挿管します29,30。挿管が成功したことを確認するには、カテーテルの端に膨張バルブを取り付け、静かに絞ります。
注:挿管に成功したマウスは、球根の圧迫で両側の胸部上昇を経験します。 - 2-0のシルク縫合糸をマウスの鼻の周りに二重の結び目でしっかりと固定し、挿管カテーテルを所定の位置に保ちます。
2.肺を露出させる手術
注:光変換を含む手術のすべてのステップ(図1)は、手術野の汚染を避けるために、フードまたは層流キャビネットで行ってください。
- 消毒石鹸で手を洗い、新しい滅菌手袋を着用してください。
注:この手術にはチップのみの技術が使用されるため、非滅菌手袋を使用することもできます。非滅菌手袋をアルコールベースの消毒剤で消毒することをお勧めします。 - 0.1 mg / kg用量のブプレノルフィン(0.03 mg / mL)を準備し、鎮痛のために皮下注射します。.
注:局所鎮痛薬や非ステロイド性抗炎症薬を含むマルチモーダル鎮痛薬は、関心のある生物学に干渉することが予想されない場合は、ブプレノルフィンと組み合わせて使用する必要があります。. - 角膜の損傷を防ぐために、マウスの両目に眼軟膏を塗布します。
- マウスを加熱された手術プラットフォームの右外側褥瘡位置に置きます。
- 人工呼吸器を挿管カテーテルに接続します。わずかな動きでもカテーテルの留置が乱れ、換気が悪くなる可能性があるため、カテーテルを安定させるように注意してください。
- 安定した、人工呼吸器で制御された、両側の胸部の上昇と下降を観察します。
- 手足をラベリングテープで手術台に固定します。マウスの背中に沿って別のテープを貼り、背側の皮膚と毛皮を手術台に固定して、手術野を安定させます(図1A)。
- 滅菌した手術器具を開きます。
- クロルヘキシジン溶液をマウスの皮膚に塗布して、手術部位を滅菌します。
- 胸骨の左側に~7mm、肋骨下縁から~7mm上の領域を特定します。鉗子でこの部分の皮膚を持ち上げ、鋭利なマイクロ解剖ハサミを使用して~10mmの円形切開を行い、皮膚だけを切断するように注意します。
- 胸郭の上の軟部組織を切除します(図1B)。両端の主要な血管を焼灼ペンで焼灼します。
注:皮膚の10mm円形切開の下にあるすべての軟部組織を切除することに加えて、周囲からいくつかの追加の非筋肉軟部組織を取り除くと、手順の将来のステップが容易になります。 - 片手で鉗子を使用して、6番目 または7番目の 肋骨を持ち上げます。もう一方の手では、鈍いマイクロ解剖ハサミの1枚刃(胸壁に平行な角度を付け、丸みを帯びたエッジを下に向けて)を使用し、6番目 または7番目の 肋間筋を慎重に突き刺して胸腔に入ります(図1C)。必要に応じてハサミを静かに回転させ、肺組織に触れたり肋骨を切ったりしないように注意しながら、肋間腔に~10mmの切開を行うようにカットします。
- 肋間切開部に向かって圧縮空気を繊細に排出し、肺と胸壁の間のスペースを増やします。最初に手首または手で空気を排出して適切な流動強度を見つけ、ノズルから破片を取り除き、次に切開部で短時間バーストして肺の損傷を防ぎます。
- 片手で鉗子を使用して、6番目 または7番目の 肋骨を持ち上げます。もう一方の手で、リトラクターを閉じたまま、肋間切開に挿入します。リトラクターのブレードは、肺自体に触れないように注意しながら、胸壁と平行になるように向けます(図1D)。
- リトラクターが所定の位置に収まったら、ハンドルをゆっくりと放し、リトラクターを開いて肺を露出させます(図1E)。 図2A は、広視野照明使用時のFITC(緑、非光変換)およびTRITC(赤、光変換)蛍光チャンネルでどのように見えるかを含む、光変換前の露出肺転移の代表的な画像を示しています。
3.肺転移光変換
注: 次の手順の詳細とバリエーションについては、ディスカッションを参照してください。
- 乾燥を防ぐために、露出した肺組織に37°Cに温めた滅菌PBSを2〜3滴静かに塗布します。
- マウスの上に小さな切り欠きのある滅菌アルミホイルを置きます。露出した肺組織の上に切り欠きを直接配置し、胸部の開いた部分と周囲の軟部組織と皮膚の数ミリメートルのみを露出させるようにサイズを調整し、露出した肺のみの光変換を確実にします。
- マウスとアルミホイルの上に切り欠きのある箱を置きます。切り欠きが露出した肺の真上にあることを確認してください。
- 箱の切り欠きの上に光変換ランプを真上に置きます(図1F)。
- 光変換ランプをオンにし、露出した肺組織を6分間連続的に照らします。
注意: 人工呼吸器の生理学的モニタリングプログラムを使用して、マウスのバイタルサインを監視します。 - 光変換後、ランプをオフにし、ランプ、ボックス、アルミホイルマスクをマウスから取り外します。
4.胸壁を閉じる手順
- 手順2.13を繰り返して、肺を胸壁から分離します。
- リトラクターハンドルを慎重につかみ、握ってブレードを閉じます。
- 閉じたリトラクターを肋間腔から取り出し、肺組織に触れないように注意してください。
- 5-0シルク縫合糸を使用して、切開部の両側に肋骨を組み込んだ単純な連続縫合パターンで肋間切開部を閉じます(図1G)。縫合糸をしっかりと引っ張って、創傷縁が同位であることを確認し、胸壁の完全性を再確立します(図1H)。縫合糸を締めすぎると肋間筋が裂けるので注意が必要です。
- 縫合糸の両端を4回結び、縫合糸を固定します。縫合糸の尾をできるだけ結び目の近くで切ります。
- 外科用ステープルで皮膚を閉じます。
- 28Gの針を取り付けた1mLのインスリン注射器で胸腔から余分な空気を取り除きます。剣状突起を触覚的に見つけ、針をすぐ下に挿入し、左肩に向かって前進して横隔膜から胸腔に入ります。シリンジを~1 mLまで引き戻します。マウスから針を抜き、シリンジから空気を排出します。このプロセスを3〜4回繰り返します。
注意: 内臓に穴を開けないように注意してください。さらに、大容量のシリンジを使用して一度にすべての空気を除去しようとするのではなく、1 mLのシリンジを使用して手順を3〜4回繰り返すことが重要です。大容量のシリンジを使用すると、胸腔内の真空が大きすぎて、肺組織の膨張や損傷につながる可能性があります。. - イソフルランをオフにします。
- マウスが覚醒の兆候を示すまで、100%酸素で換気を続けます。
- マウスに覚醒の兆候が見られたら、挿管カテーテルを人工呼吸器から外し、鼻の周りの縫合糸を切断し、マウスを抜管します。
- マウスのテープを外し、ヒートランプの下に~2フィート下に設置された清潔なケージに移します。完全に回復するまで監視します。マウスに呼吸困難や可動性の欠如の兆候が見られる場合は、5%イソフルランで5分間麻酔をかけ、つま先をつまんだときに反射の喪失を観察して適切な麻酔を確保し、子宮頸部脱臼で安楽死させます。.
- マウスが麻酔から完全に目覚めて動き始めたら、さらに0.1 mg / kg用量のブプレノルフィンを準備し、術後鎮痛のために皮下注射します。.
- 手術後、マウスが個別に飼育されていることを確認してください。飲料水に抗生物質を投与します(エンロフロキサシン、最終濃度0.4 mg / mL)。
- 手術後3日間は、1日2回マウスに苦痛の兆候がないかチェックします。疼痛管理のために、0.1 mg / kgブプレノルフィン(0.03 mg / mL)を4〜6時間ごとに皮下投与します。.マウスが感染、不動、または呼吸困難の兆候を示している場合は、安楽死させます。3日目以降は、1日1回マウスをチェックできます。
5. 組織透明化による光変換細胞のサンプル処理と検出
- 光変換手術後3〜5日(または所望の期間)の間に、マウスに5%イソフルランを麻酔し、導入後にイソフルランを5%から2.5%に減らし、つま先をつまんだときに反射の喪失を観察して適切な麻酔を確保し、10mLの室温PBSで終末経心灌流を行い、続いて10mLの4%パラホルムアルデヒドを4°Cに冷却した31。
- 関心のある臓器を収集し、前述のように光学的に除去します31。
- 前述のように、透明化した組織をライトシート顕微鏡で画像化します31。あるいは、透明化した組織をガラス底の皿に入れ、FITCおよびTRITCチャンネルで画像化し、共焦点顕微鏡、回転円盤顕微鏡、または多光子顕微鏡を使用して緑色(非光変換)および赤色(光変換)細胞を可視化します。
6. 組織解離による光変換細胞の試料処理と検出
- マウスに5%イソフルランを5分間麻酔し、つま先をつまんだときに反射の喪失を観察して適切な麻酔を確保し、光変換の3〜5日後に子宮頸部脱臼で犠牲にします。
- 前述のように、目的の臓器を収集して消化します13.
- 消化された組織をプレートにかけ、インキュベーターに入れて、前述のように一晩接着します13。
- 翌日、FITCおよびTRITCチャネルでプレーティングされた細胞を画像化し、前述のように緑(非光変換)および赤(光変換)細胞を可視化します13。
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Representative Results
このプロトコルで説明されている手術の手順を 図1に示します。簡単に言うと、マウスに麻酔をかけ、左胸部から毛を取り除きます。その後、マウスに挿管と換気を行い、胸腔が開いている間にマウスに酸素を供給できるようにします。軟部組織を切除して胸郭を露出させ、6番目 または7番目の 肋間筋を切開します。リトラクターは肋間裂孔に挿入され、隣接する肋骨を広げ、左肺とその上の光変換性転移を露出させるために解放されます。次に、肺と転移を青色光に曝露し、露出した病変を光変換します。光変換後、リトラクターを除去し、肋骨を縫合し直し、上にある皮膚を閉じます。最後に、胸腔から余分な空気を除去して肺への圧力を軽減し、マウスが独立した自発呼吸を再開できるようにします。
ここに記述されているプロトコルはいくつかの異なったphotoconvertible/photo-switchable蛋白質に合わせることができる。光変換された細胞が光変換されたチャネルでピーク蛍光強度に達するようにすることで、他の臓器での同定を容易にすることができます。光変換後にピーク蛍光強度を達成するために必要な条件は、使用する光変換性タンパク質や光変換に使用する光の強度など、実験の他の側面によって異なる可能性があるため、経験的に決定する必要があります。図2B、Cは、ex vivoサンプル中の青色光への曝露時間の関数として、FITC(非光変換)チャネルとTRITC(光変換)チャネルの両方で蛍光強度がどのように変化するかを示しています。その結果、青色光を6分間曝露すると、光変換されたチャネルで最も明るい信号が生成され、さらに曝露すると光退色が発生することがわかりました。次に、6分間の青色光曝露前後の両チャンネルの蛍光強度をin vivoで測定したところ、同様の結果が得られました(図2D)。
次に、この手術を受けたマウス(実験群)となし(対照群)から、光変換ランプを点灯させたマウスから、脳、肝臓、および光変換されていない右肺を採取しました。組織を前述したように光学的に透明化し31、ガラス底のディッシュに入れ、25x 1.0 NA対物レンズおよび880nmの励起波長を用いて特注の多光子顕微鏡32 で撮像した。緑チャンネルと赤チャンネルの蛍光は、それぞれバンドパスフィルター525/35 nmおよび580/60 nmを使用して捕捉しました。青色光曝露で手術を受けたマウスの3種類の組織すべてで、光変換された細胞と光変換されていない細胞が明確に識別されました(図3)。予想通り、青色光を浴びずに手術を受けたマウスの組織には、光変換されていない腫瘍細胞のみが見つかりました。
図1:肺光変換手術の手術プロトコルの概要。 (A)脱毛マウスを手術ステージに置き、所定の位置にテープで固定した。(B)胸郭上の皮膚と軟部組織の10mmの円形のクリアリング。(C)鈍いエッジのマイクロ解剖ハサミによる肋間筋の最初の破裂。(D)10mmの肋間切開部に挿入されたクローズドリトラクター。(E)肺組織を露出させる開閉器。(F)マウスの開胸部の真上に光変換ランプを配置します。(G)肋間切開の両側に肋骨を組み込んだ単純な連続縫合糸。(H)胸壁の完全性を再確立するために縫合糸を締めて固定します。(I)胸腔からの空気の除去。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:光変換されたチャネルでピーク蛍光強度を達成するために必要な条件の決定。 (A)フィルターなしで低倍率(1)と高倍率(2)で室内照明で青色光を照射する前の露出されたDendra2発現肺転移の代表的な画像、および広視野照明を備えたFITCチャネル(3)とTRITCチャネル(4)での高倍率。(B)青色光曝露前、および青色光曝露の2分後、4分後、6分後、および8分後のDendra2発現肺転移の蛍光 画像。(C)Dendra2を発現する肺転移の正規化された平均蛍光強度を、 ex vivoでの青色光への曝露時間の関数として表したもの。(D)in vivoでの青色光への6分間の曝露前後のDendra2発現肺転移の正規化された平均蛍光強度。スケールバー = 2 mm (A)、400 μm (B)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:光変換手術を受けたマウスの対側の肺、脳、肝臓に見られる光変換された腫瘍細胞(上段)と非光変換された腫瘍細胞(下段)の代表画像。 スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:特注の400nm LEDアレイランプ。(A)オフ、(B)オン。CF = 冷却ファン、R = リフレクター、LED = 高出力 400 nm LED。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この論文では、肺の腫瘍細胞の選択的光変換のための外科的プロトコルについて説明します。この技術により、研究者は肺の腫瘍細胞を選択的にマークし、後で全身で腫瘍細胞を再識別することでその運命を追跡することができ、肺転移からの転移の研究が容易になります。このプロトコルを用いて、光変換手術を行ったマウスの脳、肝臓、非光変換右肺の光変換細胞を可視化することができ、これらの細胞が光変換された肺転移からこれらの三次部位に再播種したことが示されました。マウスの臓器には光変換を受けていない赤血球は見つからず、細胞内の自然自家蛍光は光変換された腫瘍細胞と混同されるほど明るくないことを示しています。
実験の特定の側面に細心の注意を払うことで、この手順の成功率を高めることができます。まず、肺転移を発生させる場合、転移発生のプロトコルと光変換性/光切り替え性タンパク質を考慮する必要があります。一部の蛍光タンパク質は免疫原性があることが報告されています33,34,35,36。したがって、このようなタンパク質を発現する癌細胞は、免疫適格マウスにおいて自発的に転移しない可能性がある。実際、6DT1-Dendra2細胞の同所性注射により、同系免疫正常(FVB)マウスと免疫不全(Rag2-/-)マウスの両方で原発腫瘍が発生することが観察されました。しかし、転移はRag2-/-マウスでのみ発生し、Dendra2がいくらか免疫原性である可能性を示しています。肺転移を生じさせる蛍光タンパク質の潜在的な免疫原性を克服する方法には、免疫不全マウスの使用、尾静脈注射による転移の生成、異なる光変換性/光切り替え可能なタンパク質の使用、または光変換性/光切り替え可能タンパク質が遺伝的にコードされ、マウスがタンパク質に許容されるようにトランスジェニック動物を使用することが含まれる37.また、光変換されたチャネルにおける蛍光シグナルの強度と安定性も考慮する必要があります。多くの光変換性/光スイッチ性タンパク質では、タンパク質が細胞分裂によって分解および希釈されるにつれて、光変換されたチャネルのシグナルは時間の経過とともに減少します。私たちらは、光変換されたH2B結合Dendra2が、分裂細胞で7日間、非分裂細胞で16日間確実に検出できることを以前に示しました38,39。光変換性タンパク質を代謝回転率の低いタンパク質に結合させることで、光変換されたシグナルの半減期を延ばすことができます。肺転移モデルのトラブルシューティング方法は、研究目的と使用するがん細胞の種類によって異なります。
第二に、関心のある疾患モデルに基づいて手術のタイミングを適切に計ることが重要です。肺転移が急速に増殖する疾患モデルを扱う患者は、マウスが腫瘍の負担に圧倒されすぎて手術から回復したり、手術後望ましい期間生存したりする前に、手術を行う期間が限られている可能性があります。疾患モデルのタイムラインを完全に理解し、マイクロコンピュータ断層撮影などの非侵襲的画像戦略を使用することは、この手順のタイミングを計るのに役立つ可能性があります。
第三に、軟部組織の除去中に主要な血管を不注意に切断すると、過度の出血を引き起こし、前述のように、術野の視認性の低下および/または放血につながる可能性があります40。手術中に主要な血管を避け、焼灼ペンを使用することで、これを防ぐことができます。第四に、リトラクターを挿入および取り外すときは、リトラクターブレードを常に胸壁と平行に保つことが重要です。ブレードを肺に向けて傾けると肺の損傷のリスクが高まり、ブレードを胸壁に向けて角度を付けると、他の領域で胸壁を破るリスクが高まります。リトラクターを並行して挿入または取り外しが不可能な場合は、鈍いエッジマイクロ解剖ハサミを使用して、肋間切開の長さをわずかに長くしてから、リトラクターを再度挿入/取り外しを試みることができます。最後に、手術の最後に胸郭が完全に再密閉されるように注意する必要があります。肋骨を縫合して元に戻す場合、縫合は切開開始の~1mm前に開始し、~1mm後に終了する必要があります。これにより、切開部の端に開口部が残るのを防ぐことができます。さらに、肋骨の間のスペースをなくすのに十分なほどきつく縫合糸を引っ張って結ぶように注意してくださいが、縫合糸が隣接する肋間筋を引き裂いて追加の裂け目を作成するほどきつくしないでください。胸腔の再密閉が達成できない場合、マウスは、人工呼吸器を停止すると非常に困難になったり、自力で呼吸できなくなったりするため、手術中に人道的に犠牲にする必要があります。
光変換の光源と正確な方法は、ラボによって異なる場合があります。モデルに安全で一貫性があり、適切な光源と方法論を使用できます。例えば、光変換は、露出した肺に光変換に必要な波長および強度の光を照射することができる実体鏡または他の顕微鏡にマウスを移すことによって行われてもよい。Dendra2を発現する肺転移を光変換するために、最高輝度に設定した特注の400nm発光ダイオードアレイランプを使用します(補足図S1)。マウスの上のランプを支え、ランプが各マウスの上に同じ距離に配置されるようにするために、オープントップの段ボール箱の底に6.5 x 6.5 cmの開口部を開けます(18.4 cm(L)x 13.2 cm(W)x 7.3 cm(H))。ボックスを逆さまにしてマウスの上に置き、8.5 x 8.5 cmのランプを6.5 x 6.5 cmの切り欠き(図1F)の上に置き、ランプが支えられ、青色の光が露出した肺組織に届くようにします。
手術および麻酔薬の使用を含むこのプロトコルのいくつかの側面は、腫瘍細胞の播種動態および能力を変化させる可能性があることに注意することが重要である41,42,43,44。そのため、手順によって結果が交絡しないように、適切な管理を使用する必要があります。
この技術の主な制限は、肺の露出部分の転移のみが光変換を受けることです。したがって、肺から再播種するすべての腫瘍細胞が光変換されるわけではなく、再播種した細胞の定量化は相対的です。この制限にもかかわらず、この技術は、腫瘍細胞の再播種が起こるかどうか、いつ起こるか、何がそれを促進または防止するか、再播種した細胞の器官刺激性を判断するなど、腫瘍細胞の再播種に関する貴重な洞察を提供することができます。私たちの知る限り、これは肺の腫瘍細胞の選択的なマーキングと運命追跡を可能にする最初の技術です。結論として、このプロトコルは、ゲノム解析なしで腫瘍細胞の再播種および転移から転移への播種の研究を促進し、強化するために使用できる新しい技術を記述しています。肺転移を標的とすることで、この手順は、ほとんどの主要ながんの種類を研究する転移研究者にとって有用で関連性のあるものになります。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、マイクロコンピュータ断層撮影(S10RR029545)の支援をしてくれたWade Koba氏、顕微鏡検査のトレーニングと支援をしてくれたAnalytical Imaging FacilityのVera DesMarais氏とHillary Guzik氏、アインシュタイン・モンテフィオーレがんセンター、国立がん研究所(P30CA013330、R01CA21248、R01CA255153)、Gruss Lipper Biophotonics Center、Integrated Imaging Program for Cancer Research、 サー・ヘンリー・ウェルカム・ポスドク・フェローシップ(221647/Z/20/Z)、METAvivor Career Development Awardを受賞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
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