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Cancer Research

फोटोकोनवर्जन का उपयोग करके फेफड़े के मेटास्टेस से ट्यूमर सेल प्रसार को ट्रैक करना

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65732
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 2,4, 2,3,4,5,6,7, 1,2,3,5,6,7, *1,2,8, *1,2,3,5,6
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

हम फेफड़े के मेटास्टेस के चयनात्मक फोटोकोनवर्जन के लिए एक सर्जिकल प्रोटोकॉल से जुड़े फेफड़े के मेटास्टेस से ट्यूमर सेल रीडिसेमिनेशन का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद तृतीयक अंगों में पुन: प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान होती है।

Abstract

मेटास्टेसिस - कैंसर का प्रणालीगत प्रसार - कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण है। यद्यपि मेटास्टेसिस को आमतौर पर एक यूनिडायरेक्शनल प्रक्रिया के रूप में माना जाता है जिसमें प्राथमिक ट्यूमर से कोशिकाएं फैलती हैं और बीज मेटास्टेस होती हैं, मौजूदा मेटास्टेस में ट्यूमर कोशिकाएं भी "मेटास्टेसिस-से-मेटास्टेसिस" या "मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग" नामक प्रक्रिया में तृतीयक साइटों में नए घावों को फिरसे प्रसारित कर सकती हैं और जन्म दे सकती हैं। मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग मेटास्टेटिक बोझ को बढ़ा सकती है और रोगी के जीवन और अस्तित्व की गुणवत्ता को कम कर सकती है। इसलिए, मेटास्टैटिक कैंसर वाले रोगियों के लिए उपचार रणनीतियों को परिष्कृत करने के लिए इस घटना के पीछे की प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है।

मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग के बारे में बहुत कम जानकारी है, जो कि तार्किक और तकनीकी सीमाओं के कारण है। मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग पर अध्ययन मुख्य रूप से अनुक्रमण विधियों पर निर्भर करता है, जो मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग घटनाओं के सटीक समय का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकता है या जो उन्हें बढ़ावा देता है या रोकता है। यह उन पद्धतियों की कमी को उजागर करता है जो मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग के अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। इसे संबोधित करने के लिए, हमने विकसित किया है - और यहां वर्णन किया है - फेफड़े के मेटास्टेस के चयनात्मक फोटोकोनवर्जन के लिए एक म्यूरिन सर्जिकल प्रोटोकॉल, फेफड़े से तृतीयक साइटों तक पुन: प्रसार करने वाले ट्यूमर कोशिकाओं के विशिष्ट अंकन और भाग्य ट्रैकिंग की अनुमति देता है। हमारे ज्ञान के लिए, फेफड़ों से ट्यूमर सेल रीडिसेमिनेशन और मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग का अध्ययन करने का यही एकमात्र तरीका है जिसमें जीनोमिक विश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है।

Introduction

मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण है1. मेटास्टैटिक कैंसर तब उत्पन्न होता है जब प्राथमिक ट्यूमर से कोशिकाएं पूरे शरीर में फैल जाती हैं और दूर के अंगों में नैदानिक रूप से पता लगाने योग्य ट्यूमर में फैल जाती हैं 2,3.

हालांकि मेटास्टेसिस को आमतौर पर एक यूनिडायरेक्शनल प्रक्रिया के रूप में माना जाता है जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर से फैलती हैं और दूरके अंगों को उपनिवेशित करती हैं, नैदानिक और प्रयोगात्मक साक्ष्य बढ़ने से पता चलता है कि एक अधिक जटिल, बहु-दिशात्मक प्रक्रिया खेल में है। यह दिखाया गया है कि ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी प्राथमिक ट्यूमर (यदि अभी भी जगह में है)5,6,7,8,9 reseed कर सकते हैं, और मौजूदा मेटास्टैटिक foci से ट्यूमर कोशिकाओं तृतीयक साइटों के लिए यात्रा और नए घावों10,11,12,13 को जन्म दे सकते हैं. दरअसल, हाल के जीनोमिक विश्लेषणों के साक्ष्य से पता चलता है कि कुछ मेटास्टैटिक घाव प्राथमिक ट्यूमर से नहीं, बल्कि अन्य मेटास्टेस से उत्पन्न होते हैं-एक घटना जिसे "मेटास्टेसिस-से-मेटास्टेसिस" या "मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग"14,15,16के रूप में जाना जाता है। मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग प्राथमिक ट्यूमर को हटाने, मेटास्टेटिक बोझ बढ़ाने और जीवन और अस्तित्व की रोगी गुणवत्ता को कम करने के बाद भी रोग प्रक्रिया को बनाए रख सकती है। इसलिए, मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग के पीछे की प्रक्रियाओं को समझना मेटास्टेटिक बीमारी वाले रोगियों के लिए उपचार रणनीतियों को परिष्कृत करने के लिए महत्वपूर्ण है।

संभावित गंभीर नैदानिक निहितार्थों के बावजूद, मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग के बारे में बहुत कम जानकारी है, जो कि तार्किक और तकनीकी सीमाओं के कारण है। मानव अध्ययन नैदानिक नमूनों की कमी से सीमित हैं। मेटास्टैटिक घावों की नैदानिक लकीर और बायोप्सी असामान्य हैं, जैसा कि प्रतीत होता है कि स्वस्थ अंगों की बायोप्सी है, जहां एकल प्रसारित ट्यूमर कोशिकाएं दुबक सकती हैं। इसका मतलब यह है कि मानव अध्ययन आमतौर पर केवल उन व्यक्तियों से शव परीक्षा के नमूनों का उपयोग करके संभव होता है जिनके प्राथमिक ट्यूमर या तो अभी भी जगह में हैं या पहले से उच्छेदित थे लेकिन अभी भी शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं। जब इस तरह के नमूने उपलब्ध हैं, कैंसर की प्रगति के वंश विश्लेषण अनुक्रमण तरीकों14 का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. हालांकि, मिलान किए गए प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेस के थोक अनुक्रमण में व्यापक वंश अनुरेखण के लिए आवश्यक संवेदनशीलता नहीं है। उदाहरण के लिए, एक घाव के थोक अनुक्रमण से एक सबक्लोन प्रकट हो सकता है जो इसके किसी भी मिलान वाले घावों में ज्ञानी नहीं है। इस मामले में, कोई इस उपक्लोन की उत्पत्ति का निर्धारण करने में असमर्थ होगा। यह प्राथमिक ट्यूमर या किसी अन्य मेटास्टेसिस में पता लगाने की सीमा से नीचे की आवृत्ति पर मौजूद हो सकता है, या यह मेटास्टैटिक घाव के प्रारंभिक उपनिवेशण के बाद उत्पन्न हो सकता है। एकल-कोशिका अनुक्रमण संवेदनशीलता में वृद्धि प्रदान करता है, लेकिन इसकी उच्च लागत इस तकनीक के बड़े पैमाने पर अनुप्रयोग को सीमित करती है। इन अध्ययनों की पूर्वव्यापी प्रकृति का अर्थ यह भी है कि वे अलग-अलग समय बिंदुओं पर क्षणिक मेटास्टेटिक घटनाओं और रोग परिदृश्य में सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

पशु मॉडल में, हाल ही में तकनीकी प्रगति अब उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प 17,18,19,20 के साथ भावी phylogenetic मानचित्रण के लिए अनुमति देते हैं. ये तकनीकें CRISPR/Cas9 जीनोम एडिटिंग का उपयोग एक विकसित बारकोड के साथ इंजीनियर कोशिकाओं के लिए करती हैं - आनुवांशिक उत्परिवर्तन जो समय के साथ जमा होते हैं। अनुक्रमण पर, प्रत्येक कोशिका के वंश का पता उसके बारकोड 17,18,19,20 के उत्परिवर्ती प्रोफ़ाइल के आधार पर लगाया जा सकता है। दरअसल, इस तरह की तकनीक का उपयोग पहले से ही मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग को मैप करने के लिए किया जा रहा है। हाल के एक पेपर में, झांग एट अल ने प्रदर्शित किया कि हड्डी मेटास्टेस में स्तन और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाएं हड्डी से कई अंगों में बीज माध्यमिक मेटास्टेस तक पुन: प्रसारित होती हैं21.

हालांकि इन उपन्यास विधियों में कैंसर की प्रगति के विस्तृत, उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ़ाइलोजेनेटिक मानचित्र उत्पन्न करने की बड़ी क्षमता है, वे मेटास्टेसिस-टू-मेटास्टेसिस सीडिंग घटनाओं के सटीक समय का अध्ययन करने वालों के लिए अत्यधिक अव्यावहारिक हैं और जो उन्हें बढ़ावा देता है या रोकता है। मेटास्टैटिक कैंसर की हमारी समझ और उपचार को परिष्कृत करने के लिए इन ज्ञान अंतरालों को भरना महत्वपूर्ण है, लेकिन इस तरह के अध्ययनों को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रौद्योगिकियों की उल्लेखनीय कमी है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, हमने हाल ही में विकसित किया है - और यहां मौजूद है - एक उपन्यास तकनीक जो हमें विशेष रूप से मेटास्टैटिक साइट (फेफड़े) में फोटोकोनवर्जन के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं को चिह्नित करने की अनुमति देती है और बाद में उन्हें तृतीयक अंगों में फिर से पहचानती है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में दिखाया है कि स्तन कैंसर कोशिकाएं फेफड़े के मेटास्टेस और बीज तृतीयक अंगों13 से पुन: प्रसार करती हैं। इस तकनीक का उपयोग एक संकीर्ण खिड़की के भीतर पुनर्प्रसार की घटनाओं के समय को निर्धारित करने और पुनर्प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है, जिससे पुनर्प्रसारित कोशिकाओं के ऑर्गेनोट्रोपिज्म के अध्ययन की सुविधा मिलती है और जो पुनर्प्रसार को बढ़ावा देता है / रोकता है।

जबकि फोटोकोनवर्सन और स्थानीय रूप से इंड्यूसिबल क्रे / लॉक्स सिस्टम जो स्थायी रूप से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन को दूसरे के साथ प्रतिस्थापित करते हैं, पहले ट्यूमर कोशिकाओं को चिह्नित करने और ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है 11,22,23, हमारे ज्ञान के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं के स्पैटिओटेम्पोरल अंकन के लिए कोई दृष्टिकोण फेफड़ों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है - 14 सबसे आम कैंसर 24 में से किसी एक का निदान करने वाले पुरुषों और महिलाओं के बीच मेटास्टेसिस की सबसे आम साइटों में से एक. किसी भी कैंसर सेल प्रकार और फेफड़े के मेटास्टेसिस पीढ़ी के लिए किसी भी प्रोटोकॉल का उपयोग हमारी प्रक्रिया के साथ किया जा सकता है, जिससे यह मेटास्टेसिस शोधकर्ताओं के लिए व्यापक रूप से उपयोगी हो जाता है। फेफड़े के मेटास्टेस उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली सभी कैंसर कोशिकाओं को एक फोटोकन्वर्टिबल या फोटो-स्विचेबल प्रोटीन व्यक्त करना चाहिए, और शोधकर्ता यह चुन सकते हैं कि उनकी विशिष्ट आवश्यकताओं और संसाधनों के आधार पर किस प्रोटीन का उपयोग करना है। इस अध्ययन में, हमने 6DT1 स्तन कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया जो फोटोकन्वर्टिबल ग्रीन-टू-रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन Dendra2 (6DT1-Dendra2 कोशिकाओं)25 को हिस्टोन H2B से टैग किए गए थे। हमने 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 कोशिकाओं को मादा Rag2-/- चूहों के चौथे स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया। प्राथमिक ट्यूमर इंजेक्शन के बाद 12 से 16 दिनों के बीच स्पष्ट थे और प्रयोग की अवधि के लिए उच्छेदित नहीं थे। सहज फेफड़े मेटास्टेस ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद 19 से 26 दिनों के बीच विकसित हुए। ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद 26 से 29 दिनों के बीच फोटोकोनवर्जन सर्जरी की गई। फेफड़ों के मेटास्टेसिस बोझ के कारण सर्जरी के बाद 72 घंटे द्वारा चूहों की बलि दी गई थी।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं कशेरुक जानवरों के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया है, चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज द्वारा पूर्व अनुमोदन सहित.

सर्जरी से पहले, कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करके चूहों में फेफड़े के मेटास्टेस उत्पन्न किए जाते हैं जो एक फोटोकन्वर्टिबल / फोटो-स्विचेबल प्रोटीन व्यक्त करते हैं; फेफड़े मेटास्टेसिस पीढ़ी के लिए कई प्रोटोकॉल 26,27,28 प्रकाशित किया गया है.

1. सर्जरी की तैयारी

  1. माउस की तैयारी (बालों को हटाने और इंटुबैषेण), सर्जरी और वसूली के लिए अलग-अलग कार्य क्षेत्र तैयार करें।
  2. एक आटोक्लेव में सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणु.
    नोट: एक युक्तियाँ केवल तकनीक इस सर्जरी के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में, एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला बाद की प्रक्रियाओं के लिए उपकरणों resterilize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. गर्म सर्जिकल प्लेटफॉर्म चालू करें और इसे 37-40 डिग्री सेल्सियस पर पहुंचने और स्थिर करने की अनुमति दें।
  4. 5% isoflurane के साथ संज्ञाहरण प्रेरित करें, और फिर isoflurane 3% को कम. संज्ञाहरण पर्याप्तता का आकलन करने के लिए प्रक्रिया के दौरान समय-समय पर पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण करें।
  5. एक सही पार्श्व decubitus स्थिति में संवेदनाहारी माउस रखें. क्षेत्र में डिपिलिटरी क्रीम लगाकर ऊपरी-बाएँ छाती/साइड बॉडी ( चित्र 1A देखें) के बालों को हटा दें। पानी के साथ धुंध या कागज तौलिया का एक टुकड़ा गीला करें और बालों और डिपिलिटरी क्रीम को पोंछ दें। जब तक सभी बाल शल्य चिकित्सा क्षेत्र से हटा दिया जाता है तब तक आवश्यकतानुसार दोहराएं।
    नोट: 20 एस से अधिक समय तक माउस पर डिपिलिटरी क्रीम न छोड़ें, क्योंकि यह त्वचा को नुकसान पहुंचा सकता है।
  6. 2-0 रेशम सीवन के साथ एक 22 जी कैथेटर के आधार के ऊपर ~ 3 मिमी एक डबल गाँठ टाई. 2 इंच लंबी पूंछ छोड़ दें।
  7. इस कैथेटर के साथ माउस intubate के रूप में पहले29,30 वर्णित. सफल इंटुबैषेण की पुष्टि करने के लिए, कैथेटर के अंत में एक मुद्रास्फीति बल्ब संलग्न करें और धीरे से निचोड़ें।
    नोट: चूहे जिन्हें सफलतापूर्वक इंटुबैट किया गया है, बल्ब निचोड़ के साथ द्विपक्षीय छाती वृद्धि का अनुभव करेंगे।
  8. कसकर जगह में इंटुबैषेण कैथेटर रखने के लिए एक डबल गाँठ के साथ माउस के थूथन के आसपास 2-0 रेशम सीवन सुरक्षित.

2. फेफड़े को उजागर करने के लिए सर्जरी

नोट: शल्य चिकित्सा क्षेत्र के संदूषण से बचने के लिए एक हुड या लामिना का प्रवाह कैबिनेट में, photoconversion सहित सर्जरी (चित्रा 1) के सभी चरणों प्रदर्शन.

  1. एंटीसेप्टिक साबुन से हाथ धोएं और नए बाँझ दस्ताने पहनें।
    नोट: इस सर्जरी के लिए केवल टिप्स तकनीक का उपयोग किया जाता है, गैर-बाँझ दस्ताने का भी उपयोग किया जा सकता है। अल्कोहल-आधारित कीटाणुनाशक के साथ गैर-बाँझ दस्ताने को साफ करने की सिफारिश की जाती है।
  2. ब्यूप्रेनोर्फिन (0.03 मिलीग्राम/एमएल) की 0.1 मिलीग्राम/किग्रा खुराक तैयार करें और एनाल्जेसिया के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
    नोट: स्थानीय दर्द अवरोधकों और नॉनस्टेरॉइडल एंटी-इंफ्लेमेटरी ड्रग्स सहित मल्टीमॉडल एनाल्जेसिया का उपयोग ब्यूप्रेनोर्फिन के साथ संयोजन में किया जाना चाहिए यदि उन्हें ब्याज के जीव विज्ञान में हस्तक्षेप करने की उम्मीद नहीं है।
  3. कॉर्नियल क्षति को रोकने के लिए दोनों माउस आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
  4. गर्म शल्य चिकित्सा मंच पर सही पार्श्व decubitus स्थिति में माउस रखें.
  5. वेंटिलेटर को इंटुबैषेण कैथेटर से कनेक्ट करें। कैथेटर स्थिर रखने के लिए ध्यान रखना, के रूप में भी मामूली आंदोलनों कैथेटर प्लेसमेंट परेशान और गरीब वेंटिलेशन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  6. स्थिर, वेंटिलेटर-नियंत्रित, द्विपक्षीय छाती उठने और गिरने का निरीक्षण करें।
  7. लेबलिंग टेप के साथ सर्जिकल प्लेटफॉर्म पर अंगों को सुरक्षित करें। माउस की पीठ के साथ टेप का एक और टुकड़ा रखकर और शल्य चिकित्सा मंच (चित्रा 1 ए) पृष्ठीय त्वचा और फर को सुरक्षित करके शल्य चिकित्सा क्षेत्र को स्थिर करें।
  8. निष्फल शल्य चिकित्सा उपकरणों खोलें.
  9. सर्जिकल साइट को स्टरलाइज़ करने के लिए माउस की त्वचा पर क्लोरहेक्सिडिन समाधान लागू करें।
  10. उरोस्थि के बाईं ओर ~ 7 मिमी और सबकोस्टल मार्जिन के ऊपर ~ 7 मिमी क्षेत्र की पहचान करें। संदंश के साथ इस क्षेत्र पर त्वचा लिफ्ट और एक ~ 10 मिमी परिपत्र चीरा तेज सूक्ष्म विदारक कैंची का उपयोग कर, केवल त्वचा में कटौती करने के लिए ख्याल रखना.
  11. रिबकेज (चित्रा 1 बी) पर नरम ऊतक निकालें। एक दाग़ना कलम के साथ दोनों सिरों पर किसी भी प्रमुख जहाजों को दागना।
    नोट: त्वचा में 10 मिमी परिपत्र चीरा अंतर्निहित सभी नरम ऊतक excising के अलावा, परिधि से कुछ अतिरिक्त गैर पेशी नरम ऊतक को हटाने प्रक्रिया के भविष्य के चरणों की सुविधा.
  12. एक हाथ से, 6वें या 7वें रिब को ऊपर उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें। दूसरी ओर, कुंद सूक्ष्म विदारक कैंची के एक ब्लेड का उपयोग करें - छाती की दीवार के समानांतर कोण, गोल किनारे नीचे का सामना करना पड़ - और ध्यान से वक्ष गुहा(चित्रा 1C)में प्रवेश करने के लिए 6वें या 7वें इंटरकोस्टल मांसपेशी छेद. धीरे कैंची बारी बारी के रूप में जरूरत के रूप में और कटौती करने के लिए एक ~ 10 मिमी चीरा इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में, फेफड़े के ऊतकों को छूने और पसलियों को काटने से बचने के लिए ख्याल रखना.
  13. नाजुक रूप से फेफड़े और छाती की दीवार के बीच की जगह को बढ़ाने के लिए इंटरकोस्टल चीरा की ओर संपीड़ित हवा का निर्वहन करें। उचित प्रवाह शक्ति खोजने और किसी भी मलबे के नोजल को साफ करने के लिए पहले किसी की कलाई या हाथ पर हवा का निर्वहन करें, फिर फेफड़ों की चोट को रोकने के लिए चीरा पर कम फटने में।
  14. एक हाथ से, 6वें या 7वें रिब को ऊपर उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें। दूसरे हाथ से, रिट्रैक्टर को बंद रखें और इसे इंटरकोस्टल चीरा में डालें। रिट्रैक्टर के ब्लेड को इस तरह से ओरिएंट करें कि वे छाती की दीवार के समानांतर हों, फेफड़े को छूने से बचने के लिए देखभाल करें (चित्र 1डी)।
  15. एक बार रिट्रैक्टर जगह में है, धीरे-धीरे संभाल जारी, खोलने के लिए और फेफड़े (चित्रा 1E) बेनकाब करने के लिए अनुवर्तक की अनुमति. चित्रा 2 ए फोटोकोनवर्जन से पहले उजागर फेफड़ों के मेटास्टेस की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है, जिसमें वे नग्न आंखों की तरह दिखते हैं, और एफआईटीसी (हरे, गैर-फोटोकोवर्टेड) और टीआरआईटीसी (लाल, फोटोकोवर्टेड) फ्लोरोसेंट चैनलों में व्यापक क्षेत्र रोशनी का उपयोग करते हुए।

3. फेफड़े के मेटास्टेसिस फोटोकोनवर्जन

नोट: निम्नलिखित चरणों पर विवरण और विविधताएं चर्चा में पाई जा सकती हैं।

  1. धीरे बाँझ पीबीएस के 2-3 बूंदों को उजागर फेफड़ों के ऊतकों को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए लागू करने के लिए सुखाने को रोकने के लिए.
  2. माउस के ऊपर एक छोटे कटआउट के साथ बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा रखें. उजागर फेफड़े के ऊतकों पर सीधे कटआउट की स्थिति और यह केवल उजागर फेफड़े के photoconversion सुनिश्चित करने के लिए वक्ष के केवल खुले हिस्से और आसपास के नरम ऊतक और त्वचा के कुछ मिलीमीटर बेनकाब करने के लिए आकार.
  3. माउस और एल्यूमीनियम पन्नी के ऊपर कटआउट के साथ एक बॉक्स रखें। सुनिश्चित करें कि कटआउट सीधे उजागर फेफड़े के ऊपर है।
  4. फोटोकन्वर्जन lamp को सीधे बॉक्स (चित्रा 1 एफ) पर कटआउट पर रखें।
  5. photoconversion दीपक पर मुड़ें और उजागर फेफड़ों के ऊतकों की निरंतर रोशनी के 6 मिनट की अनुमति दें.
    नोट: वेंटिलेटर पर शारीरिक निगरानी कार्यक्रमों का उपयोग माउस के महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी करें।
  6. फोटोकोनवर्जन के बाद, दीपक बंद करें, और माउस से दीपक, बॉक्स और एल्यूमीनियम पन्नी मुखौटा हटा दें।

4. छाती की दीवार को बंद करने की प्रक्रिया

  1. छाती की दीवार से फेफड़े को अलग करने के लिए 2.13 कदम दोहराएँ.
  2. रिट्रैक्टर हैंडल को सावधानी से पकड़ें और ब्लेड को बंद करने के लिए निचोड़ें।
  3. इंटरकोस्टल स्पेस से बंद रिट्रैक्टर को पैंतरेबाज़ी करें, फेफड़े के ऊतकों को छूने से बचने के लिए ध्यान रखें।
  4. 5-0 रेशम सिवनी का प्रयोग, चीरा (चित्रा 1G) के दोनों किनारों पर पसली को शामिल है कि एक सरल निरंतर सिवनी पैटर्न के साथ intercostal चीरा बंद. यह सुनिश्चित करने के लिए सिवनी को कसकर खींचो कि घाव के किनारे उपयुक्त हैं और छाती की दीवार (चित्रा 1एच) की अखंडता को फिर से स्थापित करें। ध्यान रखें कि सिवनी को अधिक कसने के लिए नहीं क्योंकि यह इंटरकोस्टल मांसपेशियों को फाड़ सकता है।
  5. सिवनी के दो सिरों को एक साथ 4x गाँठ करके सिवनी को सुरक्षित करें। सिवनी पूंछ को जितना संभव हो उतना गाँठ के करीब काटें।
  6. सर्जिकल स्टेपल के साथ त्वचा को बंद करें।
  7. एक 28 जी सुई संलग्न के साथ एक 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज के साथ वक्ष गुहा से अतिरिक्त हवा निकालें. xiphoid प्रक्रिया चतुराई से पता लगाएँ, और ठीक नीचे सुई डालें, डायाफ्राम के माध्यम से वक्ष गुहा में प्रवेश करने के लिए बाएं कंधे की ओर आगे बढ़ना. ~ 1 एमएल करने के लिए सिरिंज पर वापस ड्रा; माउस से सुई निकालें और सिरिंज से हवा का निर्वहन करें. इस प्रक्रिया को 3-4x दोहराएं।
    नोट: ध्यान रखें कि किसी भी आंतरिक अंग को पंचर न करें। इसके अलावा, यह एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और एक बड़ी मात्रा सिरिंज का उपयोग कर और एक ही बार में सभी हवा को दूर करने की कोशिश कर के बजाय 3-4x प्रक्रिया को दोहराने के लिए महत्वपूर्ण है. एक बड़ी मात्रा सिरिंज के उपयोग से वक्ष गुहा में बहुत अधिक वैक्यूम हो सकता है और फेफड़ों के ऊतकों में गड़बड़ी और क्षति हो सकती है।
  8. आइसोफ्लुरेन बंद करें।
  9. 100% ऑक्सीजन के साथ वेंटिलेशन जारी रखें जब तक कि माउस जागृति के लक्षण नहीं दिखाता है।
  10. एक बार माउस जागृति के लक्षण दिखाता है, वेंटिलेटर से इंटुबैषेण कैथेटर डिस्कनेक्ट करें, थूथन के चारों ओर सिवनी में कटौती, और माउस extubate.
  11. माउस को अनटेप करें और इसे हीट लैंप से ~ 2 फीट नीचे रखे एक साफ पिंजरे में स्थानांतरित करें। पूरी तरह से ठीक होने तक मॉनिटर करें। यदि माउस सांस लेने में कठिनाई या गतिशीलता की कमी के लक्षण दिखाता है, तो इसे 5 मिनट के लिए 5% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें, पैर की अंगुली चुटकी पर सजगता के नुकसान को देखकर पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करें, और ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से इच्छामृत्यु करें।
  12. एक बार माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण से जागता है और स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है, buprenorphine की एक और 0.1 मिलीग्राम / किग्रा खुराक तैयार और पश्चात एनाल्जेसिया के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्षन.
  13. सर्जरी के बाद, सुनिश्चित करें कि चूहों को व्यक्तिगत रूप से रखा गया है। पीने के पानी में एंटीबायोटिक्स प्रदान करें (एनरोफ्लोक्सासिन, अंतिम एकाग्रता 0.4 मिलीग्राम /
  14. सर्जरी के बाद 3 दिनों में, संकट के संकेतों के लिए प्रति दिन दो बार माउस की जांच करें। दर्द प्रबंधन के लिए, हर 4-6 घंटे में 0.1 मिलीग्राम/किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन (0.03 मिलीग्राम/एमएल) चमड़े के नीचे प्रशासित करें। माउस euthanize अगर यह संक्रमण के लक्षण से पता चलता है, गतिहीनता, या साँस लेने में कठिनाई. तीसरे दिन के बाद, चूहों प्रति दिन एक बार जाँच की जा सकती है.

5. ऊतक समाशोधन का उपयोग करके फोटोकोवर्डेड कोशिकाओं का नमूना प्रसंस्करण और पता लगाना

  1. फोटोकोनवर्जन सर्जरी के बाद 3 से 5 दिनों (या समय की वांछित लंबाई) के बीच, माउस को 5% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें, प्रेरण के बाद 5% से 2.5% तक आइसोफ्लुरेन को कम करें, पैर की अंगुली चुटकी पर सजगता के नुकसान को देखकर पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करें, और कमरे के तापमान पीबीएस के 10 एमएल के साथ एक टर्मिनल ट्रांसकार्डियल छिड़काव करें, इसके बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 10 एमएल को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया जैसा कि पहले31 वर्णित है।
  2. ब्याज के अंगों को इकट्ठा करें और उन्हें पहले वर्णित31 के रूप में वैकल्पिक रूप से साफ़ करें।
  3. छवि एक प्रकाश चादर खुर्दबीन के साथ साफ ऊतकों के रूप में पहले वर्णित31. वैकल्पिक रूप से, एक कॉन्फोकल, कताई डिस्क, या मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हरे (गैर-फोटोकन्वर्ट) और लाल (फोटोकोवर्टेड) कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एफआईटीसी और टीआरआईटीसी चैनलों में एक ग्लास बॉटम डिश और छवि में साफ ऊतकों को रखें।

6. ऊतक विघटन का उपयोग करके फोटोकोवर्डेड कोशिकाओं का नमूना प्रसंस्करण और पता लगाना

  1. 5 मिनट के लिए 5% isoflurane के साथ माउस anesthetize, पैर की अंगुली चुटकी पर सजगता का एक नुकसान देख द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करें, और photoconversion के बाद 3-5 दिनों गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से बलिदान.
  2. ब्याज के अंगों को इकट्ठा करें और पचाएं जैसा कि पहले वर्णितहै 13.
  3. प्लेट पचे ऊतकों और उन्हें एक इनक्यूबेटर में जगह रात भर का पालन करने के रूप में पहले वर्णित13.
  4. अगले दिन, छवि FITC और TRITC चैनलों में मढ़वाया कोशिकाओं हरे (गैर photoconverted) और लाल (photoconverted) कोशिकाओं के रूप में पहले वर्णित13.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सर्जरी के कदम चित्रा 1 में सचित्र हैं. संक्षेप में, माउस को संवेदनाहारी किया जाता है, और बालों को बाएं वक्ष से हटा दिया जाता है। माउस तो intubated और हवादार, जो माउस ऑक्सीजन प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, जबकि वक्ष गुहा खुला है. रिबकेज को बेनकाब करने के लिए नरम ऊतक को हटा दिया जाता है, और 6वें या 7वें इंटरकोस्टल मांसपेशी में एक चीरा लगाया जाता है। इंटरकोस्टल ब्रीच में एक रिट्रैक्टर डाला जाता है और आसन्न पसलियों को फैलाने और बाएं फेफड़े और उसके बाद किसी भी फोटोकन्वर्टिबल मेटास्टेस को उजागर करने के लिए जारी किया जाता है। फेफड़े और मेटास्टेस को तब उजागर घावों को फोटोकन्वर्ट करने के लिए नीली रोशनी के संपर्क में लाया जाता है। फोटोकोनवर्जन के बाद, रिट्रैक्टर को हटा दिया जाता है, पसलियों को वापस एक साथ सीवन किया जाता है, और ऊपरी त्वचा को बंद कर दिया जाता है। अंत में, अतिरिक्त हवा वक्ष गुहा से हटा दिया जाता है फेफड़ों पर दबाव को कम करने और माउस स्वतंत्र फिर से शुरू करने के लिए अनुमति देते हैं, सहज श्वसन.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अलग photoconvertible/फोटो switchable प्रोटीन की एक संख्या के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह सुनिश्चित करना कि फोटोकोवर्डेड कोशिकाएं फोटोकोवर्टेड चैनल में अपनी चरम प्रतिदीप्ति तीव्रता तक पहुंचती हैं, अन्य अंगों में उनकी पहचान की सुविधा प्रदान कर सकती हैं। फोटोकोनसन के बाद चोटी प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि वे प्रयोग के अन्य पहलुओं के साथ भिन्न हो सकते हैं जैसे कि फोटोकन्वर्टिबल प्रोटीन का उपयोग किया जा रहा है और प्रकाश की तीव्रता का उपयोग फोटोकोवर्ट के लिए किया जाता है। चित्रा 2 बी, सी प्रदर्शित करता है कि कैसे प्रतिदीप्ति तीव्रता एफआईटीसी (गैर-फोटोकन्वर्ट) और टीआरआईटीसी (फोटोकोवर्टेड) चैनलों दोनों में एक पूर्व विवो नमूने में नीली रोशनी के संपर्क की अवधि के एक समारोह के रूप में बदल गई। हमने निर्धारित किया कि नीली रोशनी के संपर्क में 6 मिनट ने फोटोकोवर्टेड चैनल में सबसे चमकीले संकेत का उत्पादन किया और अतिरिक्त एक्सपोजर ने फोटोब्लीचिंग का नेतृत्व किया। हमने तो विवो में नीले प्रकाश जोखिम के 6 मिनट से पहले और बाद में दोनों चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा, और इसी तरह के परिणाम(चित्रा 2डी)प्राप्त किए।

इसके बाद, मस्तिष्क, यकृत, और गैर-फोटोकन्वर्ट दाहिने फेफड़े को चूहों से काटा गया था जो (प्रयोगात्मक समूह) के साथ इस सर्जरी से गुजरते थे और बिना (नियंत्रण समूह) फोटोकोनवर्जन लैंप चालू हो जाता था। ऊतकों को ऑप्टिकल रूप से पहले वर्णित31 के रूप में मंजूरी दे दी गई थी, एक ग्लास बॉटम डिश में रखा गया था, और 25x 1.0 एनए उद्देश्य लेंस और 880 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके कस्टम-निर्मित मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप32 पर imaged किया गया था। प्रतिदीप्ति क्रमशः बैंडपास फिल्टर 525/35 एनएम और 580/60 एनएम का उपयोग कर हरे और लाल चैनलों के लिए कब्जा कर लिया गया था. फोटोकोवर्टेड और गैर-फोटोकोवर्डेड कोशिकाओं को चूहों से सभी तीन ऊतक प्रकारों में स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है जो नीली रोशनी एक्सपोजर(चित्रा 3)के साथ सर्जरी से गुजरे थे। जैसा कि अपेक्षित था, चूहों के ऊतकों में केवल गैर-फोटोकन्वर्ट ट्यूमर कोशिकाएं पाई गईं, जो नीली रोशनी के संपर्क में आए बिना सर्जरी से गुजरीं।

Figure 1
चित्रा 1: फेफड़े photoconversion सर्जरी के लिए शल्य प्रोटोकॉल का अवलोकन. (ए) Depilated माउस शल्य चिकित्सा मंच पर रखा और स्थिति में टेप. (बी) रिबकेज पर त्वचा और नरम ऊतक की एक 10 मिमी परिपत्र समाशोधन। (सी) कुंद बढ़त सूक्ष्म विदारक कैंची के साथ intercostal मांसपेशियों के प्रारंभिक उल्लंघन. (डी) बंद रिट्रैक्टर 10 मिमी इंटरकोस्टल चीरा में डाला गया। (ई) फेफड़े के ऊतकों को उजागर करने वाला खुला रिट्रेक्टर। (एफ) माउस के खुले वक्ष के ऊपर सीधे जगह में फोटोकन्वर्जन लैंप। (जी) सरल निरंतर सिवनी जो इंटरकोस्टल चीरा के दोनों किनारों पर पसली को शामिल करती है। (एच) छाती की दीवार अखंडता को फिर से स्थापित करने के लिए सिवनी कड़ा और सुरक्षित है। (I) वक्षीय गुहा से वायु का निकालना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फोटोकोवर्टेड चैनल में चोटी प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों का निर्धारण। (ए) उजागर डेंड्रा2-व्यक्त फेफड़े के मेटास्टेस की प्रतिनिधि छवियां बिना किसी फिल्टर के कमरे की रोशनी में नीले प्रकाश के संपर्क से पहले और कम आवर्धन (1) और उच्च आवर्धन (2), और एफआईटीसी (3) और टीआरआईटीसी चैनलों में वाइडफील्ड रोशनी (4) के साथ उच्च आवर्धन। (बी) नीले प्रकाश जोखिम से पहले एक Dendra2 व्यक्त फेफड़े मेटास्टेसिस की प्रतिदीप्ति छवियों, और 2 मिनट, 4 मिनट, 6 मिनट, और नीले प्रकाश जोखिम के 8 मिनट के बाद, पूर्व vivo. (सी) नीली रोशनी के संपर्क की अवधि के एक समारोह के रूप में एक डेंड्रा2-व्यक्त फेफड़े मेटास्टेसिस की सामान्यीकृत औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता, पूर्व विवो। (डी) विवो में नीली रोशनी के संपर्क में आने के 6 मिनट से पहले और बाद में एक डेंड्रा2-एक्सप्रेसिंग फेफड़े मेटास्टेसिस की सामान्यीकृत औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। स्केल बार = 2 मिमी (ए), 400 माइक्रोन (बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फोटोकोवर्टेड (शीर्ष पंक्ति) और गैर-फोटोकोवर्टेड (नीचे की पंक्ति) ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां चूहों के विपरीत फेफड़े, मस्तिष्क और यकृत में पाई जाती हैं जो फोटोकोनवर्जन सर्जरी से गुजरती हैं। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा S1: कस्टम-निर्मित 400 एनएम एलईडी सरणी लैंप।(ए) बंद और (बी) पर। CF = कूलिंग फैन, R = रिफ्लेक्टर, LED = हाई-पावर 400 एनएम एलईडी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पत्र में, हम फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं के चयनात्मक फोटोकोनवर्जन के लिए एक सर्जिकल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह तकनीक शोधकर्ताओं को फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से चिह्नित करने और बाद के समय बिंदु पर पूरे शरीर में उन्हें फिर से पहचानकर उनके भाग्य को ट्रैक करने में सक्षम बनाती है, जिससे फेफड़े के मेटास्टेस से मेटास्टेसिस का अध्ययन सुविधाजनक हो जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, मस्तिष्क, यकृत और चूहों के गैर-फोटोकोवर्टेड दाहिने फेफड़े में फोटोकोवर्टेड कोशिकाओं की कल्पना करना संभव था, जो फोटोकोनवर्जन के साथ सर्जरी से गुजर चुके थे, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं को फोटोकोवर्डेड फेफड़े के मेटास्टेस से इन तृतीयक साइटों पर पुन: प्रसारित किया गया था। हमें चूहों के अंगों में कोई लाल कोशिका नहीं मिली जो फोटोकोनवर्जन से नहीं गुजरती थी, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं में प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस फोटोकनवर्डेड ट्यूमर कोशिकाओं के साथ भ्रमित होने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल नहीं है।

प्रयोग के कुछ पहलुओं पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने से इस प्रक्रिया की सफलता दर बढ़ सकती है। सबसे पहले, फेफड़े के मेटास्टेस उत्पन्न करते समय, मेटास्टेसिस पीढ़ी और फोटोकन्वर्टिबल/फोटो-स्विचेबल प्रोटीन के लिए प्रोटोकॉल पर विचार किया जाना चाहिए। यह बताया गया है कि कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीन इम्युनोजेनिक33,34,35,36 हैं। इस प्रकार, इस तरह के प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कैंसर कोशिकाएं प्रतिरक्षात्मक चूहों में अनायास मेटास्टेसाइज नहीं कर सकती हैं। दरअसल, हमने देखा कि प्राथमिक ट्यूमर 6DT1-Dendra2 कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन पर syngeneic, immunocompetent (FVB) चूहों और immunocompromised (Rag2-/-) चूहों दोनों में बनते हैं। हालांकि, मेटास्टेस केवल रैग2-/- चूहों में विकसित हुए, यह दर्शाता है कि डेंड्रा 2 कुछ हद तक इम्युनोजेनिक हो सकता है। फेफड़े के मेटास्टेस उत्पन्न करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संभावित इम्युनोजेनेसिटी को दूर करने के तरीकों में एक इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड माउस का उपयोग करना, पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से मेटास्टेस उत्पन्न करना, एक अलग फोटोकन्वर्टिबल / फोटो-स्विचेबल प्रोटीन का उपयोग करना, या एक ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करना शामिल है जिसमें फोटोकन्वर्टिबल / फोटो-स्विचेबल प्रोटीन आनुवंशिक रूप से एन्कोड किया जाता है ताकि चूहों को प्रोटीन37 को सहन किया जा सके. फोटोकोवर्टेड चैनल में फ्लोरोसेंट सिग्नल की ताकत और स्थिरता पर भी विचार किया जाना चाहिए। कई फोटोकन्वर्टिबल/फोटोस्विचेबल प्रोटीन के लिए, फोटोकन्वर्ट चैनल में सिग्नल समय के साथ कम हो जाता है क्योंकि प्रोटीन कोशिका विभाजन के साथ नीचा और पतला हो जाता है। हम और दूसरों को पहले दिखाया है कि photoconverted एच 2 बी जुड़े Dendra2 मज़बूती से कोशिकाओं को विभाजित में 7 दिनों के लिए और गैर विभाजित कोशिकाओं38,39 में 16 दिनों के लिए पता लगाया जा सकता है. फोटोकन्वर्टिबल प्रोटीन को कम टर्नओवर दर वाले प्रोटीन से जोड़ने से फोटोकन्वर्ट सिग्नल का आधा जीवन बढ़ सकता है। फेफड़े के मेटास्टेसिस मॉडल के समस्या निवारण के तरीके अनुसंधान उद्देश्य और कैंसर सेल प्रकार के उपयोग पर निर्भर होना चाहिए।

दूसरा, ब्याज के रोग मॉडल के आधार पर सर्जरी को ठीक से समय देना महत्वपूर्ण है। जो लोग तेजी से बढ़ते फेफड़ों के मेटास्टेस के साथ रोग मॉडल के साथ काम करते हैं, उनके पास एक सीमित समय सीमा हो सकती है जिसमें सर्जरी करने से पहले चूहों को सर्जरी से उबरने और / या सर्जरी के बाद वांछित समय तक जीवित रहने के लिए ट्यूमर के बोझ से अभिभूत होने से पहले सर्जरी करनी होती है। रोग मॉडल समयरेखा की पूरी तरह से समझ, साथ ही माइक्रो कंप्यूटेड टोमोग्राफी जैसी गैर-इनवेसिव इमेजिंग रणनीतियों का उपयोग, इस प्रक्रिया के समय में मदद कर सकता है।

तीसरा, नरम ऊतक हटाने के दौरान प्रमुख जहाजों के अनजाने में काटने से अत्यधिक रक्तस्राव हो सकता है, जिससे सर्जिकल क्षेत्र और / या बहिष्करण की खराब दृश्यता हो सकती है, जैसा कि पहले40 वर्णित है। प्रमुख जहाजों से बचना और सर्जरी के दौरान एक दागना कलम का उपयोग करना इसे रोक सकता है। चौथा, जब डालने और रिट्रैक्टर को हटाने, यह महत्वपूर्ण है कि हर समय छाती की दीवार के समानांतर रिट्रैक्टर ब्लेड रखें. ब्लेड को फेफड़ों की ओर मोड़ने से फेफड़ों के नुकसान का खतरा बढ़ जाता है, और ब्लेड को छाती की दीवार की ओर मोड़ने से अन्य क्षेत्रों में छाती की दीवार के टूटने का खतरा बढ़ जाता है। डालने या एक समानांतर फैशन में प्रतिकर्षक को हटाने संभव नहीं लगता है, कुंद बढ़त सूक्ष्म विदारक कैंची थोड़ा वापस वापस लेने / रिट्रैक्टर को हटाने की कोशिश करने से पहले इंटरकोस्टल चीरा की लंबाई बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि सर्जरी के अंत में रिबकेज पूरी तरह से फिर से सील हो गया है। पसलियों को वापस एक साथ सीवन करते समय, चीरा की शुरुआत से पहले ~ 1 मिमी सिलाई शुरू की जानी चाहिए और ~ 1 मिमी बाद समाप्त होनी चाहिए। यह चीरे के सिरों पर अवशिष्ट उद्घाटन से बचने में मदद करता है। इसके अतिरिक्त, पसलियों के बीच की जगह को खत्म करने के लिए सिवनी को काफी कसकर खींचने और बांधने का ध्यान रखें, लेकिन इतना तंग नहीं कि टांके आसन्न इंटरकोस्टल मांसपेशियों को फाड़ दें और अतिरिक्त उल्लंघन पैदा करें। यदि वक्ष गुहा को फिर से सील करना हासिल नहीं किया जा सकता है, तो सर्जरी के दौरान माउस को मानवीय रूप से बलिदान किया जाना चाहिए, क्योंकि यांत्रिक वेंटिलेशन बंद होने पर इसे बड़ी कठिनाई होगी या अपने दम पर सांस लेने में असमर्थ होगा।

प्रकाश स्रोत और फोटोकोनवर्जन के लिए सटीक पद्धति प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकती है। कोई भी प्रकाश स्रोत और कार्यप्रणाली जो मॉडल के लिए सुरक्षित, सुसंगत और उपयुक्त है, का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, photoconversion उजागर फेफड़े पर photoconversion के लिए आवश्यक तरंग दैर्ध्य और तीव्रता के प्रकाश चमक में सक्षम एक स्टीरियोस्कोप या अन्य खुर्दबीन के लिए माउस हस्तांतरण द्वारा किया जा सकता है. हम एक कस्टम-निर्मित 400 एनएम प्रकाश उत्सर्जक डायोड सरणी लैंप का उपयोग करते हैं जो फोटोकन्वर्ट डेंड्रा2-व्यक्त फेफड़े के मेटास्टेस (पूरक चित्रा एस 1) के लिए इसकी उच्चतम तीव्रता पर सेट होता है। माउस के ऊपर दीपक का समर्थन करने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि दीपक प्रत्येक माउस के ऊपर समान दूरी पर रखा गया है, हमने एक खुले-शीर्ष वाले कार्डबोर्ड बॉक्स (18.4 सेमी (एल) x 13.2 सेमी (डब्ल्यू) x 7.3 सेमी (एच)) के तल में 6.5 x 6.5 सेमी का उद्घाटन किया। हम बॉक्स को माउस के ऊपर उल्टा रखते हैं और 6.5 x 6.5 सेमी कटआउट (चित्रा 1 एफ) पर 8.5 x 8.5 सेमी लैंप को आराम देते हैं, इसलिए दीपक समर्थित है, और नीली रोशनी उजागर फेफड़ों के ऊतकों तक पहुंच सकती है।

यह सर्जरी और संवेदनाहारी के उपयोग सहित इस प्रोटोकॉल के कुछ पहलुओं, ट्यूमर कोशिकाओं 41,42,43,44 के प्रसार कैनेटीक्स और क्षमता बदल सकते हैं कि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है. जैसे, यह सुनिश्चित करने के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए कि परिणाम प्रक्रिया से भ्रमित न हों।

इस तकनीक की मुख्य सीमा यह है कि फेफड़े के उजागर हिस्से पर केवल मेटास्टेस फोटोकोनवर्जन से गुजरेंगे। इसलिए, फेफड़े से पुन: प्रसारित होने वाले प्रत्येक ट्यूमर सेल को फोटोकोवर्टेड नहीं किया जाएगा और पुनर्प्रसारित कोशिकाओं का कोई भी परिमाणीकरण सापेक्ष होगा। इस सीमा के बावजूद, यह तकनीक अभी भी ट्यूमर सेल पुनर्वितरण में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, जिसमें यह निर्धारित करना शामिल है कि क्या और कब होता है, क्या इसे बढ़ावा देता है या रोकता है, और पुनर्प्रसारित कोशिकाओं का ऑर्गेनोट्रोपिज्म। हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली तकनीक है जो फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं के चयनात्मक अंकन और भाग्य-ट्रैकिंग की अनुमति देती है। अंत में, इस प्रोटोकॉल को सुविधाजनक बनाने और जीनोमिक विश्लेषण के बिना ट्यूमर सेल redissemination और मेटास्टेसिस से मेटास्टेसिस सीडिंग के अध्ययन को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक उपन्यास तकनीक का वर्णन करता है. फेफड़े के मेटास्टेस को लक्षित करना प्रक्रिया को मेटास्टेसिस शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी और प्रासंगिक बनाता है जो अधिकांश प्रमुख कैंसर प्रकारों का अध्ययन करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक माइक्रो कंप्यूटेड टोमोग्राफी (S10RR029545), वेरा डेसमारैस और एनालिटिकल इमेजिंग फैसिलिटी की हिलेरी गुज़िक के साथ उनकी सहायता के लिए वेड कोबा को माइक्रोस्कोपी के साथ उनके प्रशिक्षण और सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, आइंस्टीन मोंटेफियोर कैंसर सेंटर, नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), ग्रस लिपर बायोफोटोनिक्स सेंटर, कैंसर रिसर्च के लिए एकीकृत इमेजिंग प्रोग्राम, एक सर हेनरी वेलकम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (221647/Z/20/Z), और एक METAvivor कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0-30 V, 0-3 A Power Supply MPJA 9616 PS
12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply MPJA 17563 PD
28 G 1 mL BD Insulin Syringe BD 329410
400 nm light emitting diode array lamp LedEngin Inc. 897-LZPD0UA00 Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below)
5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle Ethicon, Inc. 774B
9 cm 2-0 silk tie Ethicon, Inc. LA55G
Baytril 100 (enrofloxacin) Bayer (Santa Cruz Biotechnology) sc-362890Rx Antibiotic used in drinking water
Buprenorphine Hospira 0409-2012-32 Analgesic
Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD Mouser 172-0250
Chlorhexidine solution Durvet 7-45801-10258-3 Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister Falcon DPSJB-12
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Micro Dissecting Scissors
Fiber-optic illuminator O.C. White Company FL3000 Used during mouse intubation
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery pen
Germinator 500 CellPoint Scientific GER 5287-120V Bead Sterilizer
Graefe forceps Roboz RS-5135
High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts Mouser LZP-D0UA00
Infrared heat lamp Braintree Scientific HL-1
Isoflurane SOL 250 mL PVL Covetrus 29405 Anesthetic
Isoflurane vaporizer SurgiVet VCT302
Jacobson needle holder with lock Kalson Surgical T1-140
Labeling tape Fisher Scientific S68702
LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN Mouser 928-C11395TM
Long cotton tip applicators Medline Industries MDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan CompUSA #S457-1023
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Micro Dissecting Scissors
Murine ventilator Kent Scientific  PS-02 PhysioSuite
Nair Hair Removal Lotion Amazon B001RVMR7K Depilatory cream
Personnet mini retractor Roboz RS-6504 Retractor
Phosphate Buffered Saline 1x Fisher Scientific 14190144 PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W Addgene 51005 Dendra2 lentivirus
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Eye Lubricant
Rodent intubation stand Braintree Scientific RIS 100
Small animal lung inflation bulb Harvard Apparatus 72-9083
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming Kent Scientific SURGI-M02 Heated surgical platform
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black Mouser 565-1440-48-0
Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red Mouser 565-1440-48-2
Tracheal catheter  Exelint International 26746 22 G catheter
Wound closing system veterinary kit Clay Adams IN015 Veterinary surgical stapling kit

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References

  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  5. Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
  6. Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
  7. Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
  9. Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
  10. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  11. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  12. Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
  13. Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
  14. Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
  15. Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
  16. Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  19. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
  20. Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
  21. Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
  22. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  23. Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
  24. Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
  25. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  26. Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  27. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  28. Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
  29. Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
  30. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  31. Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
  32. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  33. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  34. Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
  35. Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
  36. Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
  37. Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
  38. Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
  39. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
  40. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
  41. Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
  42. Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
  43. Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
  44. Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).

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