Summary
Vi presenterer en metode for å studere tumorcelleformidling fra lungemetastaser med kirurgisk protokoll for selektiv fotokonvertering av lungemetastaser, etterfulgt av identifisering av formidlede tumorceller i tertiære organer.
Abstract
Metastase - den systemiske spredningen av kreft - er den viktigste årsaken til kreftrelaterte dødsfall. Selv om metastase vanligvis betraktes som en ensrettet prosess hvor celler fra primærtumoren sprer seg og frømetastaser, kan tumorceller i eksisterende metastaser også spreseg og gi opphav til nye lesjoner på tertiære steder i en prosess kjent som "metastase-fra-metastaser" eller "metastase-til-metastasesåing." Metastase-til-metastasesåing kan øke metastatisk belastning og redusere pasientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse av prosessene bak dette fenomenet avgjørende for å raffinere behandlingsstrategier for pasienter med metastatisk kreft.
Lite er kjent om metastase-til-metastasesåing, delvis på grunn av logistiske og teknologiske begrensninger. Studier av metastase-til-metastasesåing er primært avhengige av sekvenseringsmetoder, noe som kanskje ikke er praktisk for forskere som studerer den nøyaktige timingen av metastase-til-metastase-såhendelser eller hva som fremmer eller forhindrer dem. Dette fremhever mangelen på metoder som letter studiet av metastase-til-metastasesåing. For å løse dette har vi utviklet - og beskriver her - en murine kirurgisk protokoll for selektiv fotokonvertering av lungemetastaser, som tillater spesifikk merking og skjebnesporing av tumorceller som sprer seg fra lungen til tertiære steder. Så vidt vi vet, er dette den eneste metoden for å studere tumorcelle redisseminering og metastase-til-metastase såing fra lungene som ikke krever genomisk analyse.
Introduction
Metastase er den viktigste årsaken til kreftrelaterte dødsfall1. Metastatisk kreft oppstår når celler fra primærtumoren sprer seg gjennom hele kroppen og sprer seg til klinisk påvisbare svulster i fjerne organer 2,3.
Selv om metastase vanligvis betraktes som en ensrettet prosess hvor tumorceller sprer seg fra primærtumoren og koloniserer fjerne organer4, tyder økende klinisk og eksperimentelt bevis på at en mer kompleks, flerveis prosess er på spill. Det er vist at sirkulerende tumorceller kan reseed primærtumoren (hvis den fortsatt er på plass)5,6,7,8,9, og tumorceller fra eksisterende metastatiske foci kan reise til tertiære steder og gi opphav til nye lesjoner 10,11,12,13. Faktisk tyder bevis fra nyere genomiske analyser på at noen metastaserende lesjoner ikke oppstår fra primærtumoren, men fra andre metastaser - et fenomen kjent som "metastase-fra-metastaser" eller "metastase-til-metastasesåing"14,15,16. Metastase-til-metastasesåing kan videreføre sykdomsprosessen selv etter fjerning av primærtumor, øke metastatisk belastning og redusere pasientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse av prosessene bak metastase-til-metastasesåing avgjørende for å raffinere behandlingsstrategier for pasienter med metastatisk sykdom.
Til tross for de potensielt alvorlige kliniske implikasjonene, er lite kjent om metastase-til-metastasesåing, delvis på grunn av logistiske og teknologiske begrensninger. Studier på mennesker er begrenset av mangel på kliniske prøver. Klinisk reseksjon og biopsi av metastaserende lesjoner er uvanlig, som er biopsi av tilsynelatende friske organer, hvor enkelt spredte tumorceller kan lure. Dette betyr at menneskelige studier vanligvis bare er mulig ved bruk av obduksjonsprøver fra personer hvis primære svulster enten fortsatt er på plass eller tidligere ble resektert, men er fortsatt tilgjengelige for forskere. Når slike prøver foreligger, må avstamningsanalyser av kreftprogresjon utføres ved hjelp av sekvenseringsmetoder14. Bulksekvensering av matchede primærtumorer og metastaser har imidlertid ikke den sensitiviteten som trengs for omfattende avstamningssporing. For eksempel kan bulksekvensering av en lesjon avsløre en subklon som ikke kan oppdages i noen av dens matchede lesjoner. I dette tilfellet ville man ikke kunne bestemme opprinnelsen til denne subklonen. Det kan ha vært tilstede i primærtumor eller annen metastase med en frekvens under deteksjonsgrensen, eller det kan ha oppstått etter den første koloniseringen av den metastatiske lesjonen den ble funnet i. Enkeltcellesekvensering gir økt følsomhet, men de høye kostnadene begrenser storskala anvendelse av denne teknikken. Studienes retrospektive karakter gjør også at de gir begrenset innsikt i forbigående metastatiske hendelser og sykdomslandskapet på ulike tidspunkter.
I dyremodeller tillater nyere teknologiske fremskritt nå prospektiv fylogenetisk kartlegging med høy romlig og tidsmessig oppløsning 17,18,19,20. Disse teknikkene bruker CRISPR / Cas9-genomredigering for å konstruere celler med en utviklende strekkode - arvelige mutasjoner som akkumuleres over tid. Ved sekvensering kan avstamningen til hver celle spores basert på mutasjonsprofilen til strekkoden 17,18,19,20. Faktisk brukes slik teknologi allerede til å kartlegge metastase-til-metastasesåing. I et nylig papir viste Zhang et al. at bryst- og prostatakreftceller i benmetastaser redisseminerer fra beinet til frø sekundære metastaser i flere organer21.
Selv om disse nye metodene har stort potensial til å generere detaljerte, høyoppløselige fylogenetiske kart over kreftprogresjon, er de svært upraktiske for de som studerer den nøyaktige timingen av metastase-til-metastase-såhendelser og hva som fremmer eller forhindrer dem. Å fylle disse kunnskapshullene er avgjørende for å foredle vår forståelse og behandling av metastatisk kreft, men det er en merkbar mangel på teknologier for å lette slike studier. For å imøtekomme dette behovet har vi nylig utviklet - og presenterer her - en ny teknikk som gjør at vi spesifikt kan merke tumorceller via fotokonvertering på et metastatisk sted (lungen) og deretter reidentifisere dem i tertiære organer. Ved hjelp av denne teknikken viste vi nylig at brystkreftceller sprer seg fra lungemetastaser og frø tertiære organer13. Denne teknikken kan også brukes til å bestemme tidspunktet for redissemineringshendelser innenfor et smalt vindu og kvantifisere redisseminerte tumorceller, forenkle studiet av organotropisme av redisseminerte celler og hva som fremmer / forhindrer spredning.
Mens fotokonvertering og lokalt induserbare cre / lox-systemer som permanent erstatter ett fluorescerende protein med et annet, tidligere har blitt brukt til å markere og spore tumorceller 11,22,23, så vidt vi vet, har ingen tilnærming for spatiotemporal markering av tumorceller blitt optimalisert for å målrette lungen - et av de vanligste stedene for metastase blant menn og kvinner diagnostisert med noen av de 14 vanligste kreftene 24. Enhver kreftcelletype og hvilken som helst protokoll for generering av lungemetastaser kan brukes med vår prosedyre, noe som gjør den bredt nyttig for metastaseforskere. Alle kreftceller som brukes til å generere lungemetastaser, skal uttrykke et fotokonvertibelt eller fotobyttebart protein, og forskere kan velge hvilket protein som skal brukes basert på deres spesifikke behov og ressurser. I denne studien brukte vi 6DT1 brystkreftceller som stabilt uttrykte det fotokonvertible grønne til røde fluorescerende proteinet Dendra2 (6DT1-Dendra2-celler)25 merket til histonen H2B. Vi injiserte 5,0 × 104 6DT1-Dendra2 celler i den fjerde brystfettputen til kvinnelige Rag2-/- mus. Primære svulster var palpable mellom 12 og 16 dager etter injeksjon og ble ikke resektert i løpet av forsøket. Spontane lungemetastaser utviklet seg mellom 19 og 26 dager etter injeksjon av tumorceller. Fotokonverteringsoperasjoner ble utført mellom 26 og 29 dager etter tumorcelleinjeksjon. Mus ble ofret etter 72 timer etter operasjonen på grunn av lungemetastasebelastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer og forskrifter for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
Før operasjonen skal lungemetastaser genereres hos mus ved hjelp av kreftceller som uttrykker et fotokonvertibelt / fotobyttebart protein; Flere protokoller for generering av lungemetastaser er publisert 26,27,28.
1. Forberedelse til kirurgi
- Forbered forskjellige arbeidsområder for museforberedelse (hårfjerning og intubasjon), kirurgi og gjenoppretting.
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter i en autoklav.
MERK: Som en tips-bare teknikk brukes for denne operasjonen, kan en varm perle sterilisator brukes til å resterilisere instrumenter for påfølgende prosedyrer. - Slå på den oppvarmede kirurgiske plattformen og la den nå og stabilisere seg ved 37-40 °C.
- Indusere anestesi med 5 % isofluran, og senk deretter isofluran til 3 %. Utfør tåklemmetester med jevne mellomrom gjennom hele prosedyren for å vurdere anestesidekning.
- Plasser den bedøvede musen i en høyre lateral decubitusposisjon. Fjern håret på øvre venstre bryst/sidekropp (se figur 1A) ved å påføre hårfjerningskrem på området. Fukt et stykke gasbind eller papirhåndkle med vann og tørk bort håret og hårfjerningskremen. Gjenta etter behov til alt hår er fjernet fra det kirurgiske feltet.
NOTAT: Ikke la hårfjerningskrem ligge på musen i mer enn 20 sekunder, da dette kan skade huden. - Bind en dobbel knute ~ 3 mm over bunnen av et 22 G kateter med 2-0 silke sutur. La 2-tommers lange haler.
- Intuber musen med dette kateteret som tidligere beskrevet29,30. For å bekrefte vellykket intubasjon, fest en oppblåsningspære til enden av kateteret og klem forsiktig.
MERK: Mus som har blitt intubert vellykket, vil oppleve bilateral brystheving med pæreklem. - Fest silkesuturen 2-0 tett rundt musens snute med en dobbel knute for å holde intubasjonskateteret på plass.
2. Kirurgi for å eksponere lungen
MERK: Utfør alle trinnene i operasjonen (figur 1), inkludert fotokonvertering, i en hette eller laminært strømningskabinett for å unngå forurensning av det kirurgiske feltet.
- Vask hendene med antiseptisk såpe og ta på deg nye sterile hansker.
MERK: Som en tips-bare teknikk brukes for denne operasjonen, kan ikke-sterile hansker også brukes. Desinfisering av ikke-sterile hansker med et alkoholbasert desinfeksjonsmiddel anbefales. - Klargjør en dose på 0,1 mg/kg buprenorfin (0,03 mg/ml) og injiser subkutant ved analgesi.
MERK: Multimodal analgesi, inkludert lokale smerteblokkere og ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler, bør brukes sammen med buprenorfin hvis de ikke forventes å forstyrre biologien av interesse. - Påfør oftalmisk salve på begge museøynene for å forhindre hornhinneskader.
- Plasser musen i riktig lateral decubitusposisjon på den oppvarmede kirurgiske plattformen.
- Koble ventilatoren til intubasjonskateteret. Pass på å holde kateteret stødig, da selv små bevegelser kan forstyrre kateterplasseringen og føre til dårlig ventilasjon.
- Observer stabil, ventilatorstyrt, bilateral bryststigning og fall.
- Fest lemmer til kirurgisk plattform med merkingstape. Stabiliser det kirurgiske feltet ved å plassere et annet stykke tape langs musens rygg og feste rygghuden og pelsen til den kirurgiske plattformen (figur 1A).
- Åpne de steriliserte kirurgiske instrumentene.
- Påfør klorhexidinoppløsning på musens hud for å sterilisere operasjonsstedet.
- Identifiser området ~7 mm til venstre for brystbenet og ~7 mm over subkostalmargen. Løft huden over dette området med tang og lag et ~ 10 mm sirkulært snitt ved hjelp av skarp mikrodissekerende saks, pass på å kutte bare huden.
- Fjern bløtvevet over brystkassen (figur 1B). Cauterize noen større fartøy i begge ender med en cautery penn.
MERK: I tillegg til å fjerne alt bløtvev som ligger til grunn for det 10 mm sirkulære snittet i huden, vil fjerning av noe ekstra ikke-muskulært bløtvev fra omkretsen lette fremtidige trinn i prosedyren. - Med en hånd, bruk tang for å heveden 6. eller 7. ribben. Med den annen hånd, bruk et enkelt blad av den stumpe mikrodissekerende saksen - vinklet parallelt med brystveggen, avrundet kant vendt ned - og stikk forsiktig hull på 6. eller 7. interkostalmuskel for å komme inn i brysthulen (figur 1C). Roter saksen forsiktig etter behov og kutt for å lage et ~ 10 mm snitt i interkostalrommet, pass på å unngå å berøre lungevevvet og kutte ribbeina.
- Delikat utslipp av trykkluft mot interkostalsnittet for å øke rommet mellom lungen og brystveggen. Tøm luften først ved håndleddet eller hånden for å finne riktig strømningsstyrke og fjerne dysen av rusk, deretter i korte støt ved snittet for å forhindre lungeskade.
- Med en hånd, bruk tang for å heveden 6. eller 7. ribben. Med den andre hånden, hold retractoren lukket og sett den inn i intercostal snitt. Orienter bladene på tilbaketrekkeren slik at de er parallelle med brystveggen, og pass på at du ikke berører selve lungen (figur 1D).
- Når retractoren er på plass, slipper du håndtaket sakte, slik at retractoren kan åpne og eksponere lungen (figur 1E). Figur 2A viser representative bilder av eksponerte lungemetastaser før fotokonvertering, inkludert hvordan de ser ut for det blotte øye, og i fluorescerende kanaler FITC (grønn, ikke-fotokonvertert) og TRITC (rød, fotokonvertert) ved bruk av bredfeltbelysning.
3. Lungemetastase fotokonvertering
MERK: Detaljer og variasjoner over følgende trinn finner du i diskusjonen.
- Påfør forsiktig 2-3 dråper steril PBS oppvarmet til 37 °C på det eksponerte lungevevet for å forhindre tørking.
- Legg et stykke steril aluminiumsfolie med en liten utskjæring over musen. Plasser utskjæringen rett over det eksponerte lungevevet og størrelse det for å eksponere bare den åpne delen av thorax og noen få millimeter omkringliggende bløtvev og hud for å sikre fotokonvertering av bare den eksponerte lungen.
- Plasser en boks med en utskjæring over musen og aluminiumsfolie. Sørg for at utskjæringen er direkte over den eksponerte lungen.
- Plasser fotokonverteringslampen rett over utskjæringen på esken (figur 1F).
- Slå på fotokonverteringslampen og la 6 minutter kontinuerlig belysning av eksponert lungevev.
MERK: Overvåk musens vitale tegn ved hjelp av de fysiologiske overvåkingsprogrammene på ventilatoren. - Etter fotokonvertering, slå av lampen, og fjern lampen, esken og aluminiumsfoliemasken fra musen.
4. Prosedyre for å lukke brystveggen
- Gjenta trinn 2.13 for å skille lungen fra brystveggen.
- Ta forsiktig tak i det tilbaketrekkende håndtaket og klem for å lukke bladene.
- Manøvrer den lukkede tilbaketrekkeren ut av interkostalrommet, pass på å unngå å berøre lungevevvet.
- Bruk 5-0 silkesuturen, lukk interkostalsnittet med et enkelt kontinuerlig suturmønster som inkorporerer ribben på begge sider av snittet (figur 1G). Trekk suturen stramt for å sikre at sårkantene er apposisjonelle og gjenopprett brystveggens integritet (figur 1H). Pass på at du ikke strammer suturen for mye, da dette kan rive interkostalmusklene.
- Fest suturen ved å knytte de to endene av suturen sammen 4x. Klipp suturhalene så nær knuten som mulig.
- Lukk huden med kirurgiske stifter.
- Fjern overflødig luft fra brysthulen med en 1 ml insulinsprøyte med en 28 G kanyle påsatt. Finn xiphoidprosessen taktilt, og sett nålen rett under, fremover mot venstre skulder for å komme inn i thoraxhulen gjennom membranen. Trekk sprøyten tilbake til ~1 ml; Fjern nålen fra musen og tøm luften fra sprøyten. Gjenta denne prosessen 3-4x.
MERK: Pass på at du ikke punkterer noen indre organer. Videre er det viktig å bruke en 1 ml sprøyte og gjenta prosedyren 3-4x i stedet for å bruke en sprøyte med større volum og prøve å fjerne all luften på en gang. Bruk av en sprøyte med større volum kan føre til for stort vakuum i brysthulen og føre til utblåsthet og skade i lungevevet. - Slå av isofluran.
- Fortsett ventilasjonen med 100% oksygen til musen viser tegn på oppvåkning.
- Når musen viser tegn på oppvåkning, kobler du intubasjonskateteret fra ventilatoren, kutter suturen rundt snuten og ekstuberer musen.
- Untape musen og overføre den til et rent bur plassert ~ 2 meter under en varmelampe. Overvåk til den er fullstendig gjenopprettet. Hvis musen viser tegn på pustevansker eller mangel på mobilitet, bedøve den med 5% isofluran i 5 minutter, sørg for tilstrekkelig anestesi ved å observere tap av reflekser ved tåklemme, og avlive via cervikal dislokasjon.
- Når musen våkner helt fra anestesi og begynner å bevege seg, klargjør du en ny dose på 0,1 mg/kg buprenorfin og injiserer den subkutant for postoperativ analgesi.
- Etter operasjonen, sørg for at musene er plassert individuelt. Gi antibiotika i drikkevannet (enrofloxacin, endelig konsentrasjon 0,4 mg / ml).
- I de 3 dagene etter operasjonen, sjekk musen to ganger om dagen for tegn på nød. For smertebehandling, administrer 0,1 mg/kg buprenorfin (0,03 mg/ml) subkutant hver 4.-6. time. Avlive musen hvis den viser tegn på infeksjon, immobilitet eller pustevansker. Etter den tredje dagen kan mus kontrolleres en gang per dag.
5. Prøvebehandling og deteksjon av fotokonverterte celler ved hjelp av vevsrydding
- Mellom 3 og 5 dager (eller ønsket tid) etter fotokonverteringskirurgi, bedøve musen med 5% isofluran, reduser isofluran fra 5% til 2,5% etter induksjon, sørg for tilstrekkelig anestesi ved å observere tap av reflekser ved tåklemme, og utfør en terminal transkardial perfusjon med 10 ml romtemperert PBS, etterfulgt av 10 ml 4% paraformaldehyd kjølt til 4 °C som tidligere beskrevet31.
- Samle organene av interesse og fjern dem optisk som tidligere beskrevet31.
- Se for deg det ryddede vevet med et lysarkmikroskop som tidligere beskrevet31. Alternativt kan du plassere det ryddede vevet i en glassbunnskål og bilde i FITC- og TRITC-kanalene for å visualisere grønne (ikke-fotokonverterte) og røde (fotokonverterte) celler ved hjelp av en konfokal, spinndisk eller multifotonmikroskop.
6. Prøvebehandling og deteksjon av fotokonverterte celler ved hjelp av vevsdisaggregering
- Bedøv musen med 5% isofluran i 5 minutter, sørg for tilstrekkelig anestesi ved å observere tap av reflekser ved tåklemme, og ofre via cervikal dislokasjon 3-5 dager etter fotokonvertering.
- Samle og fordøye organene av interesse som tidligere beskrevet13.
- Plate de fordøyde vevene og legg dem i en inkubator for å feste seg over natten som tidligere beskrevet13.
- Dagen etter avbilder du de belagte cellene i FITCH- og TRITC-kanalene for å visualisere grønne (ikke-fotokonverterte) og røde (fotokonverterte) celler som tidligere beskrevet13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trinnene i operasjonen beskrevet i denne protokollen er illustrert i figur 1. Kort sagt, musen er bedøvet, og håret fjernes fra venstre thorax. Musen blir deretter intubert og ventilert, noe som gjør at musen kan motta oksygen mens brysthulen er åpen. Bløtvev fjernes for å eksponere brystkassen, og et snitt gjøres i 6. eller 7. En retractor settes inn i interkostalbruddet og frigjøres for å spre de tilstøtende ribbeina og eksponere venstre lunge og eventuelle fotokonvertible metastaser derpå. Lungen og metastasene blir deretter utsatt for blått lys for å fotokonvertere de eksponerte lesjonene. Etter fotokonvertering fjernes retractoren, ribbeina sys sammen igjen, og den overliggende huden lukkes. Til slutt fjernes overflødig luft fra brysthulen for å lette trykket på lungene og la musen gjenoppta uavhengig, spontan respirasjon.
Protokollen beskrevet her kan tilpasses en rekke forskjellige fotokonvertible / foto-switchable proteiner. Å sikre at fotokonverterte celler når sin maksimale fluorescensintensitet i den fotokonverterte kanalen, kan lette identifiseringen i andre organer. Betingelsene som trengs for å oppnå topp fluorescensintensitet etter fotokonvertering, bør bestemmes empirisk, da de kan variere med andre aspekter av forsøket, for eksempel det fotokonvertible proteinet som brukes og intensiteten av lyset som brukes til å fotokonvertere. Figur 2B,C viser hvordan fluorescensintensiteten endret seg i både FITC (ikke-fotokonvertert) og TRITC (fotokonvertert) kanaler som en funksjon av varigheten av eksponeringen for blått lys i en ex vivo-prøve. Vi fastslo at 6 minutters eksponering for blått lys ga det lyseste signalet i den fotokonverterte kanalen, og at ytterligere eksponering førte til fotobleking. Vi målte deretter fluorescensintensiteten i begge kanalene før og etter 6 min eksponering for blått lys, in vivo, og oppnådde lignende resultater (figur 2D).
Deretter ble hjernen, leveren og ikke-fotokonvertert høyre lunge høstet fra mus som gjennomgikk denne operasjonen med (eksperimentell gruppe) og uten (kontrollgruppe) fotokonverteringslampen slått på. Vevene ble optisk fjernet som tidligere beskrevet31, plassert i en glassbunnsfat, og avbildet på et spesialbygd multifotonmikroskop32 ved hjelp av en 25x 1.0 NA objektivlinse og en eksitasjonsbølgelengde på 880 nm. Fluorescens ble fanget opp for de grønne og røde kanalene ved hjelp av båndpassfiltrene henholdsvis 525/35 nm og 580/60 nm. Fotokonverterte og ikke-fotokonverterte celler kunne tydelig identifiseres i alle tre vevstyper fra mus som gjennomgikk operasjonen med eksponering for blått lys (figur 3). Som forventet ble det bare funnet ikke-fotokonverterte tumorceller i vevet til mus som gjennomgikk operasjonen uten eksponering for blått lys.
Figur 1 Oversikt over operasjonsprotokoll for fotokonvertering av lungene. (A) Depilert mus plassert på operasjonsstadiet og teipet på plass. (B) En 10 mm sirkulær rydding av hud og bløtvev over brystkassen. (C) Første brudd på intercostal muskel med stump kant mikrodissekerende saks. (D) Lukket retractor satt inn i 10 mm intercostal snitt. (E) Åpen retractor som eksponerer lungevev. (F) Fotokonverteringslampe på plass rett over musens åpne thorax. (G) Enkel kontinuerlig sutur som inkorporerer ribben på begge sider av interkostalsnittet. (H) Sutur strammet og festet for å gjenopprette brystveggens integritet. (I) Fjerning av luft fra brysthulen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bestemmelse av forholdene som trengs for å oppnå maksimal fluorescensintensitet i fotokonverterte kanaler. (A) Representative bilder av eksponerte Dendra2-uttrykkende lungemetastaser før eksponering for blått lys i rombelysning uten filtre og ved lav forstørrelse (1) og høy forstørrelse (2), og høy forstørrelse i FITC- (3) og TRITC-kanalene med bredfeltbelysning (4). (B) Fluorescensbilder av en Dendra2-uttrykkende lungemetastase før eksponering for blått lys, og etter 2 min, 4 min, 6 minutter og 8 minutter eksponering for blått lys, ex vivo. (C) Normalisert gjennomsnittlig fluorescensintensitet av en Dendra2-uttrykkende lungemetastase som en funksjon av varigheten av eksponering for blått lys, ex vivo. (D) Normalisert gjennomsnittlig fluorescensintensitet av en Dendra2-uttrykkende lungemetastase før og etter 6 minutters eksponering for blått lys, in vivo. Skalastenger = 2 mm (A), 400 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av fotokonverterte (øverste rad) og ikke-fotokonverterte (nederste rad) tumorceller funnet i kontralateral lunge, hjerne og lever hos mus som gjennomgikk fotokonverteringskirurgi. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Spesialbygd 400 nm LED Array-lampe.(A) Av og (B) på. CF = Kjølevifte, R = Reflektor, LED = Høy effekt 400 nm LED. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi en kirurgisk protokoll for selektiv fotokonvertering av tumorceller i lungen. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å selektivt markere tumorceller i lungen og spore deres skjebne ved å reidentifisere dem gjennom hele kroppen på et senere tidspunkt, noe som letter studiet av metastase fra lungemetastaser. Ved hjelp av denne protokollen var det mulig å visualisere fotokonverterte celler i hjernen, leveren og ikke-fotokonvertert høyre lunge hos mus som hadde gjennomgått operasjonen med fotokonvertering, noe som indikerte at disse cellene spredte seg fra de fotokonverterte lungemetastasene til disse tertiære stedene. Vi fant ingen røde blodlegemer i organene til mus som ikke gjennomgikk fotokonvertering, noe som indikerer at naturlig autofluorescens i celler ikke er lys nok til å forveksles med fotokonverterte tumorceller.
Nøye oppmerksomhet til visse aspekter av forsøket kan øke suksessraten for denne prosedyren. For det første, ved generering av lungemetastaser, må protokollen for metastasegenerering og fotokonvertibelt / foto-switchable protein vurderes. Det har blitt rapportert at noen fluorescerende proteiner er immunogene 33,34,35,36. Dermed kan kreftceller som uttrykker slike proteiner, ikke spontant metastasere i immunkompetente mus. Faktisk observerte vi at primære svulster dannes i både syngene, immunkompetente (FVB) mus og immunkompromitterte (Rag2-/-) mus ved ortotopisk injeksjon av 6DT1-Dendra2-celler. Metastaser utviklet seg imidlertid kun hos Rag2-/- mus, noe som indikerer at Dendra2 kan være noe immunogen. Måter å overvinne den potensielle immunogeniteten til fluorescerende proteiner for å generere lungemetastaser inkluderer bruk av en immunkompromittert mus, generering av metastaser via haleveneinjeksjon, ved bruk av et annet fotokonvertibelt / fotobyttebart protein eller bruk av et transgent dyr der det fotokonvertible / fotobryterbare proteinet er genetisk kodet slik at musene tolereres for proteinet37. Styrken og stabiliteten til det fluorescerende signalet i den fotokonverterte kanalen må også vurderes. For mange fotokonvertible / fotoswitchable proteiner avtar signalet i den fotokonverterte kanalen over tid ettersom proteinet blir nedbrutt og fortynnet med celledeling. Vi og andre har tidligere vist at fotokonvertert H2B-koblet Dendra2 kan påvises pålitelig i 7 dager i delende celler og 16 dager i ikke-delende celler38,39. Kobling av fotokonvertibelt protein til et protein med lav omsetningshastighet kan forlenge halveringstiden til det fotokonverterte signalet. Metoder for feilsøking av lungemetastasemodellen må avhenge av forskningsmålet og kreftcelletypen som brukes.
For det andre er det viktig å time operasjonen riktig basert på sykdomsmodellen av interesse. De som arbeider med sykdomsmodeller med raskt voksende lungemetastaser, kan ha en begrenset tidsramme for å utføre operasjonen før musene blir for overveldet av tumorbelastning for å komme seg etter kirurgi og / eller overleve ønsket tid etter operasjonen. En grundig forståelse av sykdomsmodellens tidslinje, samt bruk av ikke-invasive bildebehandlingsstrategier som mikrocomputertomografi, kan bidra til timing av denne prosedyren.
For det tredje kan utilsiktet kutting av store kar under fjerning av bløtvev forårsake overdreven blødning, noe som fører til dårlig synlighet av det kirurgiske feltet og / eller ekssanguinering, som tidligere beskrevet40. Unngå store fartøy og bruke en cauterizing penn under operasjonen kan forhindre dette. For det fjerde, når du setter inn og fjerner retractoren, er det avgjørende å holde retractorbladene parallelle med brystveggen til enhver tid. Vinkling av bladene mot lungene øker risikoen for lungeskade, og vinkling av bladene mot brystveggen øker risikoen for å bryte brystveggen i andre områder. Hvis det ikke virker mulig å sette inn eller fjerne retractoren parallelt, kan den stumpe kanten mikrodissekerende saks brukes til å øke lengden på interkostalsnittet litt før du prøver å sette inn / fjerne retractoren igjen. Til slutt bør det tas hensyn til at brystkassen er helt forseglet på slutten av operasjonen. Når du syr ribbeina sammen igjen, bør sømmen påbegynnes ~ 1 mm før starten av snittet og avsluttes ~ 1 mm etter. Dette bidrar til å unngå gjenværende åpninger på endene av snittet. I tillegg må du passe på å trekke og knytte suturen tett nok til å eliminere mellomrom mellom ribbeina, men ikke så stramt at suturene de tilstøtende interkostalmusklene og skaper ytterligere brudd. Hvis forsegling av brysthulen ikke kan oppnås, bør musen ofres humant under operasjonen, da den vil ha store problemer eller ikke kunne puste på egen hånd når mekanisk ventilasjon stoppes.
Lyskilden og eksakt metodikk for fotokonvertering kan variere mellom laboratorier. Enhver lyskilde og metoder som er trygge, konsistente og passende for modellen kan brukes. For eksempel kan fotokonvertering utføres ved å overføre musen til et stereoskop eller annet mikroskop som er i stand til å skinne lys av bølgelengden og intensiteten som trengs for fotokonvertering på den eksponerte lungen. Vi bruker en spesialbygd 400 nm lysdiodelampe satt til høyeste intensitet for å fotokonvertere Dendra2-uttrykkende lungemetastaser (tilleggsfigur S1). For å støtte lampen over musen og sikre at lampen er plassert i samme avstand over hver mus, kutter vi en 6,5 x 6,5 cm åpning i bunnen av en pappeske med åpen topp (18,4 cm (L) x 13,2 cm (B) x 7,3 cm (H)). Vi plasserer boksen opp ned over musen og hviler lampen på 8,5 x 8,5 cm over utskjæringen på 6,5 x 6,5 cm (figur 1F), slik at lampen støttes, og det blå lyset kan nå det eksponerte lungevevvet.
Det er viktig å merke seg at noen aspekter av denne protokollen, inkludert kirurgi og bruk av anestetika, kan endre spredningskinetikken og kapasiteten til tumorceller 41,42,43,44. Som sådan må riktige kontroller brukes for å sikre at resultatene ikke blir forvirret av prosedyren.
Hovedbegrensningen i denne teknikken er at bare metastaser på den eksponerte delen av lungen vil gjennomgå fotokonvertering. Derfor vil ikke alle tumorceller som sprer seg fra lungen bli fotokonvertert, og enhver kvantifisering av redisseminerte celler vil være relativ. Til tross for denne begrensningen kan denne teknikken fortsatt gi verdifull innsikt i tumorcelleformidling, inkludert å bestemme om og når det skjer, hva som fremmer eller forhindrer det, og organotropismen til formidlede celler. Så vidt vi vet, er dette den første teknikken som tillater selektiv markering og skjebnesporing av tumorceller i lungen. Avslutningsvis beskriver denne protokollen en ny teknikk som kan brukes til å lette og forbedre studiet av tumorcelleformidling og metastase-til-metastasesåing uten genomisk analyse. Målretting av lungemetastaser gjør prosedyren nyttig og relevant for metastaseforskere som studerer de fleste store krefttyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Wade Koba for hans hjelp med mikrocomputertomografi (S10RR029545), Vera DesMarais og Hillary Guzik fra Analytical Imaging Facility for opplæring og hjelp med mikroskopi, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, et Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z), og en METAvivor Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
