Summary
Wir stellen eine Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen aus Lungenmetastasen vor, die ein chirurgisches Protokoll zur selektiven Photokonversion von Lungenmetastasen beinhaltet, gefolgt von der Identifizierung von redisseminierten Tumorzellen in tertiären Organen.
Abstract
Metastasen - die systemische Ausbreitung von Krebs - sind die häufigste krebsbedingte Todesursache. Obwohl die Metastasierung gemeinhin als unidirektionaler Prozess angesehen wird, bei dem sich Zellen aus dem Primärtumor ausbreiten und Metastasen säen, können sich Tumorzellen in bestehenden Metastasen auch wiederausbreiten und neue Läsionen in tertiären Lokalisationen hervorrufen, in einem Prozess, der als "Metastasierung-von-Metastasen" oder "Metastasen-zu-Metastase-Seeing" bekannt ist. Die Aussaat von Metastasen zu Metastasen kann die Metastasierungslast erhöhen und die Lebensqualität und das Überleben des Patienten beeinträchtigen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Prozesse hinter diesem Phänomen zu verstehen, um Behandlungsstrategien für Patienten mit metastasierendem Krebs zu verfeinern.
Über die Aussaat von Metastasen zu Metastasen ist wenig bekannt, was zum Teil auf logistische und technologische Einschränkungen zurückzuführen ist. Studien zur Metastasen-zu-Metastase-Aussaat stützen sich in erster Linie auf Sequenzierungsmethoden, die für Forscher, die den genauen Zeitpunkt von Metastasen-zu-Metastase-Seeding-Ereignissen untersuchen oder was sie fördert oder verhindert, möglicherweise nicht praktikabel sind. Dies unterstreicht den Mangel an Methoden, die die Untersuchung der Metastasen-zu-Metastasen-Aussaat erleichtern. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein murines chirurgisches Protokoll für die selektive Photokonversion von Lungenmetastasen entwickelt und beschreiben es hier, das eine spezifische Markierung und Schicksalsverfolgung von Tumorzellen ermöglicht, die sich von der Lunge in tertiäre Stellen ausbreiten. Unseres Wissens ist dies die einzige Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen und der Aussaat von Metastasen zu Metastasen aus der Lunge, die keine Genomanalyse erfordert.
Introduction
Metastasen sind die häufigste krebsbedingte Todesursache1. Metastasierender Krebs entsteht, wenn sich Zellen des Primärtumors im ganzen Körper ausbreiten und sich zu klinisch nachweisbaren Tumoren in entfernten Organen vermehren 2,3.
Obwohl die Metastasierung gemeinhin als unidirektionaler Prozess angesehen wird, bei dem sich Tumorzellen vom Primärtumor aus ausbreiten und entfernte Organe besiedeln4, deuten immer mehr klinische und experimentelle Beweise darauf hin, dass ein komplexerer, multidirektionaler Prozess im Spiel ist. Es hat sich gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen den Primärtumor wieder einsäen können (falls noch vorhanden)5,6,7,8,9, und Tumorzellen aus bestehenden metastasierten Herden können zu tertiären Stellen wandern und neue Läsionen hervorrufen 10,11,12,13. Tatsächlich deuten neuere Genomanalysen darauf hin, dass einige metastasierende Läsionen nicht vom Primärtumor, sondern von anderen Metastasen stammen - ein Phänomen, das als "Metastasierung von Metastasen" oder "Metastasen-zu-Metastase-Seeing" bekannt ist14,15,16. Die Aussaat von Metastasen zu Metastasen kann den Krankheitsprozess auch nach der Entfernung des Primärtumors fortsetzen, die Metastasierungslast erhöhen und die Lebensqualität und das Überleben der Patienten verringern. Daher ist das Verständnis der Prozesse, die hinter der Aussaat von Metastasen zu Metastasen stehen, von entscheidender Bedeutung, um Behandlungsstrategien für Patienten mit metastasierender Erkrankung zu verfeinern.
Trotz der potenziell schwerwiegenden klinischen Auswirkungen ist nur wenig über die Aussaat von Metastasen zu Metastasen bekannt, was zum Teil auf logistische und technologische Einschränkungen zurückzuführen ist. Studien am Menschen sind durch einen Mangel an klinischen Proben begrenzt. Klinische Resektionen und Biopsien von metastasierten Läsionen sind selten, ebenso wie die Biopsie von scheinbar gesunden Organen, in denen einzelne gestreute Tumorzellen lauern können. Das bedeutet, dass Studien am Menschen in der Regel nur mit Autopsieproben von Personen möglich sind, deren Primärtumoren entweder noch vorhanden sind oder zuvor reseziert wurden, aber den Forschern noch zur Verfügung stehen. Wenn solche Proben verfügbar sind, müssen Abstammungsanalysen der Krebsprogression mit Hilfe von Sequenzierungsmethodendurchgeführt werden 14. Die Massensequenzierung von übereinstimmenden Primärtumoren und Metastasen hat jedoch nicht die Sensitivität, die für eine umfassende Abstammungsverfolgung erforderlich ist. Zum Beispiel kann die Massensequenzierung einer Läsion einen Subklon aufdecken, der in keiner seiner passenden Läsionen nachweisbar ist. In diesem Fall wäre es nicht möglich, die Herkunft dieses Subklons zu bestimmen. Es kann im Primärtumor oder in einer anderen Metastase mit einer Häufigkeit unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden gewesen sein, oder es kann nach der anfänglichen Kolonisierung der metastasierten Läsion entstanden sein, in der es gefunden wurde. Die Einzelzellsequenzierung bietet eine erhöhte Empfindlichkeit, aber ihre hohen Kosten schränken die großflächige Anwendung dieser Technik ein. Der retrospektive Charakter dieser Studien bedeutet auch, dass sie nur begrenzte Einblicke in transiente metastasierende Ereignisse und die Krankheitslandschaft zu verschiedenen Zeitpunkten bieten.
In Tiermodellen ermöglichen die jüngsten technologischen Fortschritte nun eine prospektive phylogenetische Kartierung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung 17,18,19,20. Diese Techniken nutzen die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung, um Zellen mit einem sich entwickelnden Barcode zu manipulieren - vererbbare Mutationen, die sich im Laufe der Zeit ansammeln. Bei der Sequenzierung kann die Abstammung jeder Zelle anhand des Mutationsprofils ihres Barcodes 17,18,19,20 zurückverfolgt werden. Tatsächlich wird eine solche Technologie bereits eingesetzt, um die Aussaat von Metastasen zu Metastasen abzubilden. In einer kürzlich erschienenen Arbeit zeigten Zhang et al., dass Brust- und Prostatakrebszellen in Knochenmetastasen aus dem Knochen zu sekundären Metastasen in mehreren Organen zurückkehren21.
Während diese neuartigen Methoden ein großes Potenzial haben, detaillierte, hochauflösende phylogenetische Karten der Krebsprogression zu erstellen, sind sie höchst unpraktisch für diejenigen, die den genauen Zeitpunkt von Metastasierungs-zu-Metastasen-Seeing-Ereignissen untersuchen und was sie fördert oder verhindert. Die Schließung dieser Wissenslücken ist von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis und die Behandlung von metastasierendem Krebs zu verfeinern, aber es gibt einen deutlichen Mangel an Technologien, die solche Studien ermöglichen. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir kürzlich eine neuartige Technik entwickelt, die es uns ermöglicht, Tumorzellen durch Photokonversion in einer metastasierten Stelle (der Lunge) spezifisch zu markieren und sie anschließend in tertiären Organen zu reidentifizieren. Mit dieser Technik haben wir kürzlich gezeigt, dass sich Brustkrebszellen aus Lungenmetastasen und Seed-Tertiärorganen reseminieren13. Diese Technik kann auch verwendet werden, um den Zeitpunkt von Redisseminationsereignissen innerhalb eines engen Zeitfensters zu bestimmen und redisseminierte Tumorzellen zu quantifizieren, was die Untersuchung des Organotropismus von redisseminierten Zellen und der Frage, was die Redissemination fördert/verhindert, erleichtert.
Während Photokonversion und lokal induzierbare cre/lox-Systeme, die ein fluoreszierendes Protein dauerhaft durch ein anderes ersetzen, bereits zuvor zur Markierung und Verfolgung von Tumorzellen verwendet wurden 11,22,23, wurde unseres Wissens nach kein Ansatz für die räumlich-zeitliche Markierung von Tumorzellen optimiert, um auf die Lunge abzuzielen - eine der häufigsten Metastasierungsstellen bei Männern und Frauen, bei denen eine der 14 häufigsten Krebsarten diagnostiziert wurde 24. Jeder Krebszelltyp und jedes Protokoll zur Generierung von Lungenmetastasen kann mit unserem Verfahren verwendet werden, was es für Metastasenforscher allgemein nützlich macht. Alle Krebszellen, die zur Bildung von Lungenmetastasen verwendet werden, sollten ein photokonvertierbares oder photoschaltbares Protein exprimieren, und die Forscher können je nach ihren spezifischen Bedürfnissen und Ressourcen auswählen, welches Protein sie verwenden möchten. In dieser Studie verwendeten wir 6DT1-Brustkrebszellen, die stabil das photokonvertierbare grün-rot fluoreszierende Protein Dendra2 (6DT1-Dendra2-Zellen)25 exprimierten, das an das Histon H2B gebunden war. Wir injizierten 5,0 × 104 6DT1-Dendra2-Zellen in das vierte Brustfettpolster weiblicher Rag2-/- Mäuse. Die Primärtumoren waren zwischen 12 und 16 Tagen nach der Injektion tastbar und wurden für die Dauer des Experiments nicht reseziert. Spontane Lungenmetastasen entwickelten sich zwischen 19 und 26 Tagen nach der Injektion von Tumorzellen. Photokonversionsoperationen wurden zwischen 26 und 29 Tagen nach der Injektion der Tumorzellen durchgeführt. Die Mäuse wurden 72 Stunden nach der Operation aufgrund der Belastung durch Lungenmetastasen getötet.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
Vor der Operation sollen Lungenmetastasen in Mäusen mit Hilfe von Krebszellen erzeugt werden, die ein photokonvertierbares/photoschaltbares Protein exprimieren; Es wurden mehrere Protokolle zur Generierung von Lungenmetastasen veröffentlicht 26,27,28.
1. Vorbereitung auf die Operation
- Bereiten Sie verschiedene Arbeitsbereiche für die Vorbereitung der Maus (Haarentfernung und Intubation), die Operation und die Genesung vor.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven.
HINWEIS: Da bei dieser Operation nur eine Tips-Technik verwendet wird, kann ein Heißperlen-Sterilisator verwendet werden, um Instrumente für nachfolgende Eingriffe zu resterilisieren. - Schalten Sie die beheizte Operationsplattform ein und lassen Sie sie bei 37-40 °C erreichen und stabilisieren.
- Induzieren Sie eine Anästhesie mit 5 % Isofluran und senken Sie dann das Isofluran auf 3 %. Führen Sie während des gesamten Eingriffs regelmäßig Zehenklemmtests durch, um die Angemessenheit der Anästhesie zu beurteilen.
- Bringen Sie die anästhesierte Maus in eine rechte seitliche Dekubitusposition. Entfernen Sie die Haare der oberen linken Brust/des seitlichen Körpers (siehe Abbildung 1A), indem Sie Enthaarungscreme auf den Bereich auftragen. Befeuchten Sie ein Stück Gaze oder Papiertuch mit Wasser und wischen Sie das Haar und die Enthaarungscreme weg. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis alle Haare aus dem Operationsfeld entfernt sind.
HINWEIS: Lassen Sie die Enthaarungscreme nicht länger als 20 s auf der Maus, da dies die Haut schädigen kann. - Binden Sie einen Doppelknoten ~3 mm über der Basis eines 22-G-Katheters mit 2-0-Seidennaht. Lassen Sie 2 Zoll lange Schwänze stehen.
- Intubieren Sie die Maus mit diesem Katheter wie zuvor beschrieben29,30. Um eine erfolgreiche Intubation zu bestätigen, befestigen Sie eine Aufblasbirne am Ende des Katheters und drücken Sie sie vorsichtig zusammen.
HINWEIS: Bei Mäusen, die erfolgreich intubiert wurden, kommt es zu einer beidseitigen Anhebung des Brustkorbs mit Bulbusquetschung. - Befestigen Sie die 2-0-Seidennaht mit einem Doppelknoten fest um die Schnauze der Maus, um den Intubationskatheter an Ort und Stelle zu halten.
2. Operation zur Freilegung der Lunge
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte der Operation (Abbildung 1), einschließlich der Photokonversion, in einer Haube oder einem Laminar-Flow-Schrank durch, um eine Kontamination des Operationsfeldes zu vermeiden.
- Waschen Sie sich die Hände mit antiseptischer Seife und ziehen Sie neue sterile Handschuhe an.
HINWEIS: Da bei dieser Operation nur Spitzen verwendet werden, können auch unsterile Handschuhe verwendet werden. Es wird empfohlen, unsterile Handschuhe mit einem Desinfektionsmittel auf Alkoholbasis zu desinfizieren. - Bereiten Sie eine Dosis von 0,1 mg/kg Buprenorphin (0,03 mg/ml) vor und injizieren Sie es subkutan zur Analgesie.
HINWEIS: Multimodale Analgesie, einschließlich lokaler Schmerzblocker und nichtsteroidaler Antirheumatika, sollte in Verbindung mit Buprenorphin angewendet werden, wenn nicht zu erwarten ist, dass sie die Biologie von Interesse beeinträchtigen. - Tragen Sie Augensalbe auf beide Mäuseaugen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.
- Platzieren Sie die Maus in der rechten seitlichen Dekubitusposition auf der beheizten Operationsplattform.
- Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Intubationskatheter an. Achten Sie darauf, den Katheter ruhig zu halten, da bereits leichte Bewegungen die Katheterplatzierung stören und zu einer schlechten Belüftung führen können.
- Beobachten Sie ein stabiles, beatmungsgesteuertes, beidseitiges Heben und Senken des Brustkorbs.
- Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Beschriftungsband an der Operationsplattform. Stabilisieren Sie das Operationsfeld, indem Sie ein weiteres Stück Klebeband entlang des Rückens der Maus anbringen und die Rückenhaut und das Fell an der Operationsplattform befestigen (Abbildung 1A).
- Öffnen Sie die sterilisierten chirurgischen Instrumente.
- Tragen Sie Chlorhexidinlösung auf die Haut der Maus auf, um die Operationsstelle zu sterilisieren.
- Identifizieren Sie den Bereich ~7 mm links vom Brustbein und ~7 mm über dem subkostalen Rand. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette über diesen Bereich und machen Sie einen ~10 mm kreisförmigen Schnitt mit einer scharfen Mikropräparierschere, wobei Sie darauf achten, nur die Haut zu schneiden.
- Entfernen Sie das Weichgewebe über dem Brustkorb (Abbildung 1B). Kauterisieren Sie alle größeren Gefäße an beiden Enden mit einem Kauterstift.
HINWEIS: Zusätzlich zur Entfernung des gesamten Weichgewebes unter dem 10 mm kreisförmigen Hautschnitt erleichtert die Entfernung von zusätzlichem nicht-muskulärem Weichgewebe vom Umfang zukünftige Schritte des Eingriffs. - Verwenden Sie mit einer Hand eine Pinzette, um die 6. oder 7. Rippe anzuheben. Mit der anderen Hand wird eine einzelne Klinge der stumpfen Mikropräparierschere - schräg zur Brustwand, abgerundete Kante nach unten - verwendet und den 6. oder 7. Zwischenrippenmuskel vorsichtig durchstochen, um in die Brusthöhle einzudringen (Abbildung 1C). Drehen Sie die Schere vorsichtig nach Bedarf und schneiden Sie, um einen ~10 mm langen Schnitt im Zwischenrippenraum zu machen, wobei Sie darauf achten müssen, dass Sie das Lungengewebe nicht berühren und die Rippen schneiden.
- Leiten Sie die Druckluft vorsichtig in Richtung des Zwischenrippenschnitts ab, um den Abstand zwischen der Lunge und der Brustwand zu vergrößern. Lassen Sie die Luft zuerst am Handgelenk oder an der Hand ab, um die richtige Strömungsstärke zu finden und die Düse von Schmutz zu befreien, und dann in kurzen Stößen am Einschnitt, um Lungenverletzungen zu vermeiden.
- Verwenden Sie mit einer Hand eine Pinzette, um die 6. oder 7. Rippe anzuheben. Mit der anderen Hand halten Sie den Retraktor geschlossen und führen ihn in den Interkostalschnitt ein. Richten Sie die Klingen des Retraktors so aus, dass sie parallel zur Brustwand verlaufen, und achten Sie darauf, dass Sie die Lunge selbst nicht berühren (Abbildung 1D).
- Sobald der Retraktor an Ort und Stelle ist, lassen Sie den Griff langsam los, damit sich der Retraktor öffnen und die Lunge freilegen kann (Abbildung 1E). Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder von exponierten Lungenmetastasen vor der Photokonversion, einschließlich ihres Aussehens mit bloßem Auge und in den FITC- (grün, nicht photokonvertierten) und TRITC- (rot, photokonvertierten) Fluoreszenzkanälen unter Verwendung von Weitfeldbeleuchtung.
3. Photokonversion von Lungenmetastasen
HINWEIS: Details und Variationen der folgenden Schritte finden Sie in der Diskussion.
- Tragen Sie vorsichtig 2-3 Tropfen steriles, auf 37 °C erwärmtes PBS auf das freiliegende Lungengewebe auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Legen Sie ein Stück sterile Alufolie mit einem kleinen Ausschnitt über die Maus. Positionieren Sie den Ausschnitt direkt über dem freigelegten Lungengewebe und legen Sie ihn so fest, dass nur der offene Teil des Thorax und einige Millimeter des umgebenden Weichgewebes und der Haut freigelegt werden, um die Photokonversion nur der freigelegten Lunge zu gewährleisten.
- Legen Sie eine Schachtel mit einem Ausschnitt über die Maus und die Alufolie. Stellen Sie sicher, dass sich der Ausschnitt direkt über der freiliegenden Lunge befindet.
- Platzieren Sie die Fotokonversionslampe direkt über der Aussparung an der Box (Abbildung 1F).
- Schalten Sie die Photokonversionslampe ein und lassen Sie das freiliegende Lungengewebe 6 Minuten lang ununterbrochen beleuchten.
HINWEIS: Überwachen Sie die Vitalfunktionen der Maus mit den physiologischen Überwachungsprogrammen am Beatmungsgerät. - Schalten Sie nach der Fotokonvertierung die Lampe aus und entfernen Sie die Lampe, die Box und die Aluminiumfolienmaske von der Maus.
4. Verfahren zum Schließen der Brustwand
- Wiederholen Sie Schritt 2.13, um die Lunge von der Brustwand zu trennen.
- Fassen Sie vorsichtig den Griff des Retraktors und drücken Sie ihn, um die Klingen zu schließen.
- Manövrieren Sie den geschlossenen Retraktor aus dem Interkostalraum heraus und achten Sie darauf, das Lungengewebe nicht zu berühren.
- Mit dem 5-0-Seidennaht wird der Interkostalschnitt mit einem einfachen durchgehenden Nahtmuster verschlossen, das die Rippe auf beiden Seiten des Einschnitts einschließt (Abbildung 1G). Ziehen Sie die Naht fest, um sicherzustellen, dass die Wundränder appositional sind und die Integrität der Brustwand wiederhergestellt wird (Abbildung 1H). Achten Sie darauf, die Naht nicht zu straffen, da dies die Zwischenrippenmuskeln reißen kann.
- Befestigen Sie die Naht, indem Sie die beiden Enden der Naht 4x miteinander verknoten. Schneiden Sie die Nahtenden so nah wie möglich am Knoten ab.
- Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern.
- Entfernen Sie überschüssige Luft aus der Brusthöhle mit einer 1-ml-Insulinspritze mit einer 28-G-Nadel. Lokalisieren Sie den Processus xiphoideus taktil und führen Sie die Nadel direkt darunter in Richtung der linken Schulter ein, um durch das Zwerchfell in die Brusthöhle einzudringen. Ziehen Sie die Spritze auf ~1 ml zurück; Entfernen Sie die Nadel von der Maus und lassen Sie die Luft aus der Spritze ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4x.
HINWEIS: Achten Sie darauf, keine inneren Organe zu punktieren. Darüber hinaus ist es wichtig, eine 1-ml-Spritze zu verwenden und den Vorgang 3-4x zu wiederholen, anstatt eine Spritze mit größerem Volumen zu verwenden und zu versuchen, die gesamte Luft auf einmal zu entfernen. Die Verwendung einer Spritze mit größerem Volumen kann zu einem zu großen Vakuum in der Brusthöhle führen und zu einer Dehnung und Schädigung des Lungengewebes führen. - Schalten Sie das Isofluran aus.
- Beatmung mit 100 % Sauerstoff fortsetzen, bis die Maus Anzeichen eines Erwachens zeigt.
- Sobald die Maus Anzeichen des Erwachens zeigt, trennen Sie den Intubationskatheter vom Beatmungsgerät, durchtrennen Sie die Naht um die Schnauze und extubieren Sie die Maus.
- Entklebe die Maus und lege sie in einen sauberen Käfig, der ~2 Fuß unter einer Wärmelampe steht. Überwachen Sie, bis Sie sich vollständig erholt haben. Wenn die Maus Anzeichen von Atembeschwerden oder mangelnder Beweglichkeit zeigt, betäuben Sie sie 5 Minuten lang mit 5% Isofluran, sorgen Sie für eine angemessene Anästhesie, indem Sie einen Verlust der Reflexe beim Einklemmen der Zehen beobachten, und euthanasieren Sie sie durch Zervixluxation.
- Sobald die Maus vollständig aus der Narkose erwacht ist und sich zu bewegen beginnt, bereiten Sie eine weitere Dosis von 0,1 mg/kg Buprenorphin vor und injizieren Sie es subkutan zur postoperativen Analgesie.
- Stellen Sie nach der Operation sicher, dass die Mäuse einzeln untergebracht werden. Geben Sie Antibiotika in das Trinkwasser (Enrofloxacin, Endkonzentration 0,4 mg/ml).
- Untersuchen Sie die Maus in den 3 Tagen nach der Operation zweimal täglich auf Anzeichen von Leiden. Zur Schmerzbehandlung 0,1 mg/kg Buprenorphin (0,03 mg/ml) alle 4-6 Stunden subkutan verabreichen. Euthanasieren Sie die Maus, wenn sie Anzeichen von Infektion, Immobilität oder Atembeschwerden zeigt. Nach dem dritten Tag können die Mäuse einmal täglich kontrolliert werden.
5. Probenaufbereitung und Detektion photokonvertierter Zellen mittels Tissue Clearing
- Zwischen 3 und 5 Tagen (oder der gewünschten Zeitspanne) nach der Photokonversionsoperation wird die Maus mit 5 % Isofluran betäubt, Isofluran nach der Induktion von 5 % auf 2,5 % reduziert, eine angemessene Anästhesie sichergestellt, indem ein Verlust der Reflexe beim Einklemmen der Zehen beobachtet wird, und eine terminale transkardiale Perfusion mit 10 ml PBS bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von 10 ml 4%igem Paraformaldehyd, das auf 4 °C gekühlt wird, wie zuvor beschrieben31.
- Sammeln Sie die interessierenden Organe ein und reinigen Sie sie optisch, wie zuvor beschrieben31.
- Stellen Sie das gereinigte Gewebe mit einem Lichtblattmikroskop ab, wie zuvor beschrieben31. Alternativ können Sie das gereinigte Gewebe in eine Glasbodenschale geben und in den FITC- und TRITC-Kanälen abbilden, um grüne (nicht photokonvertierte) und rote (photokonvertierte) Zellen mit einem konfokalen, rotierenden Scheiben- oder Multiphotonenmikroskop zu visualisieren.
6. Probenverarbeitung und Detektion photokonvertierter Zellen mittels Gewebedisaggregation
- Betäuben Sie die Maus 5 Minuten lang mit 5% Isofluran, sorgen Sie für eine angemessene Anästhesie, indem Sie einen Verlust der Reflexe beim Einklemmen der Zehen beobachten, und opfern Sie 3-5 Tage nach der Photokonversion durch zervikale Luxation.
- Sammeln und verdauen Sie die Organe von Interesse, wie zuvor beschrieben13.
- Tellern Sie das verdaute Gewebe und legen Sie es in einen Inkubator, damit es über Nacht anhaftet, wie zuvor beschrieben13.
- Am nächsten Tag werden die plattierten Zellen in den FITC- und TRITC-Kanälen abgebildet, um grüne (nicht photokonvertierte) und rote (photokonvertierte) Zellen zu visualisieren, wie zuvor beschrieben13.
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Representative Results
Die in diesem Protokoll beschriebenen Operationsschritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, die Maus wird betäubt und Haare aus dem linken Brustkorb entfernt. Die Maus wird dann intubiert und beatmet, so dass die Maus Sauerstoff erhalten kann, während die Brusthöhle geöffnet ist. Weichgewebe wird entfernt, um den Brustkorb freizulegen, und es wird ein Schnitt im 6. oder 7. Zwischenrippenmuskel gemacht. Ein Retraktor wird in den Interkostalbruch eingeführt und freigegeben, um die angrenzenden Rippen zu spreizen und die linke Lunge und alle darauf befindlichen photokonvertierbaren Metastasen freizulegen. Die Lunge und die Metastasen werden dann blauem Licht ausgesetzt, um die exponierten Läsionen zu photokonvertieren. Nach der Photokonversion wird der Retraktor entfernt, die Rippen wieder zusammengenäht und die darüber liegende Haut geschlossen. Schließlich wird überschüssige Luft aus der Brusthöhle entfernt, um den Druck auf die Lunge zu verringern und der Maus die Möglichkeit zu geben, ihre unabhängige, spontane Atmung wieder aufzunehmen.
Das hier beschriebene Protokoll kann an eine Reihe verschiedener photokonvertierbarer/photoschaltbarer Proteine angepasst werden. Die Sicherstellung, dass photokonvertierte Zellen ihre maximale Fluoreszenzintensität im photokonvertierten Kanal erreichen, kann ihre Identifizierung in anderen Organen erleichtern. Die Bedingungen, die erforderlich sind, um die maximale Fluoreszenzintensität nach der Photokonversion zu erreichen, sollten empirisch bestimmt werden, da sie mit anderen Aspekten des Experiments variieren können, wie z. B. dem verwendeten photokonvertierbaren Protein und der Intensität des für die Photokonvertierung verwendeten Lichts. Die Abbildungen 2B und C zeigen, wie sich die Fluoreszenzintensität sowohl im FITC-Kanal (nicht photokonvertiert) als auch im TRITC-Kanal (photokonvertiert) in Abhängigkeit von der Dauer der Exposition gegenüber blauem Licht in einer ex vivo Probe änderte. Wir stellten fest, dass eine 6-minütige Exposition mit blauem Licht das hellste Signal im photokonvertierten Kanal erzeugte und dass eine zusätzliche Exposition zu einer Photobleichung führte. Wir haben dann die Fluoreszenzintensität in beiden Kanälen vor und nach 6 Minuten Blaulicht-Exposition in vivo gemessen und ähnliche Ergebnisse erhalten (Abbildung 2D).
Als nächstes wurden das Gehirn, die Leber und die nicht photokonvertierte rechte Lunge von Mäusen entnommen, die sich dieser Operation mit (Versuchsgruppe) und ohne eingeschaltete (Kontrollgruppe) der Photokonversionslampe unterzogen hatten. Die Gewebe wurden, wie zuvor beschrieben31, optisch gereinigt, in eine Glasbodenschale gelegt und auf einem speziell angefertigten Multiphotonenmikroskop32 unter Verwendung einer 25x 1,0 NA Objektivlinse und einer Anregungswellenlänge von 880 nm abgebildet. Die Fluoreszenz wurde für den grünen und roten Kanal mit den Bandpassfiltern 525/35 nm bzw. 580/60 nm erfasst. Photokonvertierte und nicht-photokonvertierte Zellen konnten in allen drei Gewebetypen von Mäusen, die sich der Operation mit blauer Lichtexposition unterzogen hatten, eindeutig identifiziert werden (Abbildung 3). Wie erwartet, wurden nur nicht photokonvertierte Tumorzellen in den Geweben von Mäusen gefunden, die sich der Operation ohne Blaulichtexposition unterzogen hatten.
Abbildung 1: Überblick über das Operationsprotokoll für die Lungen-Photokonversionsoperation. (A) Enthaarte Maus, die auf die chirurgische Bühne gelegt und mit Klebeband fixiert wurde. (B) Eine 10 mm kreisförmige Reinigung von Haut und Weichgewebe über dem Brustkorb. (C) Initialer Bruch des Interkostalmuskels mit einer stumpfen Mikropräparierschere. (D) Geschlossener Retraktor, der in einen 10-mm-Interkostalschnitt eingeführt wird. (E) Offener Retraktor, der Lungengewebe freilegt. (F) Photokonversionslampe direkt über dem offenen Thorax der Maus. (G) Einfache durchgehende Naht, die die Rippe auf beiden Seiten des Interkostalschnitts einschließt. (H) Die Naht wird gestrafft und gesichert, um die Integrität der Brustwand wiederherzustellen. (I) Entfernung von Luft aus der Brusthöhle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestimmung der Bedingungen, die erforderlich sind, um die maximale Fluoreszenzintensität im photokonvertierten Kanal zu erreichen. (A) Repräsentative Bilder von exponierten Dendra2-exprimierenden Lungenmetastasen vor der Blaulicht-Exposition in Raumbeleuchtung ohne Filter und bei niedriger Vergrößerung (1) und hoher Vergrößerung (2) und hoher Vergrößerung in den FITC- (3) und TRITC-Kanälen mit Weitfeldbeleuchtung (4). (B) Fluoreszenzbilder einer Dendra2-exprimierenden Lungenmetastase vor der Blaulicht-Exposition und nach 2 min, 4 min, 6 min und 8 min blauer Licht-Exposition, ex vivo. (C) Normalisierte mittlere Fluoreszenzintensität einer Dendra2-exprimierenden Lungenmetastase in Abhängigkeit von der Dauer der Exposition bei blauem Licht, ex vivo. (D) Normalisierte mittlere Fluoreszenzintensität einer Dendra2-exprimierenden Lungenmetastase vor und nach 6-minütiger Exposition bei blauem Licht, in vivo. Maßstabsbalken = 2 mm (A), 400 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von photokonvertierten (obere Reihe) und nicht-photokonvertierten (untere Reihe) Tumorzellen, die in der kontralateralen Lunge, im Gehirn und in der Leber von Mäusen gefunden wurden, die sich einer Photokonversionsoperation unterzogen hatten. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Speziell angefertigte 400-nm-LED-Array-Lampe.(A) Aus und (B) Ein. CF = Lüfter, R = Reflektor, LED = Hochleistungs-400-nm-LED. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll für die selektive Photokonversion von Tumorzellen in der Lunge. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, Tumorzellen in der Lunge selektiv zu markieren und ihr Schicksal zu verfolgen, indem sie sie zu einem späteren Zeitpunkt im ganzen Körper neu identifizieren, was die Untersuchung der Metastasierung von Lungenmetastasen erleichtert. Mit diesem Protokoll war es möglich, photokonvertierte Zellen im Gehirn, in der Leber und in der nicht photokonvertierten rechten Lunge von Mäusen zu visualisieren, die sich der Operation mit Photokonversion unterzogen hatten, was darauf hindeutet, dass diese Zellen von den photokonvertierten Lungenmetastasen zu diesen tertiären Stellen reseminiert wurden. Wir fanden keine roten Blutkörperchen in den Organen von Mäusen, die keine Photokonversion durchliefen, was darauf hindeutet, dass die natürliche Autofluoreszenz in Zellen nicht hell genug ist, um mit photokonvertierten Tumorzellen verwechselt zu werden.
Sorgfältige Beachtung bestimmter Aspekte des Experiments kann die Erfolgsquote dieses Verfahrens erhöhen. Zunächst muss bei der Generierung von Lungenmetastasen das Protokoll für die Metastasenbildung und das photokonvertierbare/photoschaltbare Protein berücksichtigt werden. Es wurde berichtet, dass einige fluoreszierende Proteine immunogen sind 33,34,35,36. Daher kann es sein, dass Krebszellen, die solche Proteine exprimieren, in immunkompetenten Mäusen nicht spontan metastasieren. In der Tat beobachteten wir, dass sich Primärtumoren sowohl bei syngenen, immunkompetenten (FVB) Mäusen als auch bei immungeschwächten (Rag2-/-) Mäusen nach orthotoper Injektion von 6DT1-Dendra2-Zellen bilden. Metastasen entwickelten sich jedoch nur in Rag2-/- Mäusen, was darauf hindeutet, dass Dendra2 etwas immunogen sein könnte. Zu den Möglichkeiten, die potenzielle Immunogenität fluoreszierender Proteine zur Erzeugung von Lungenmetastasen zu überwinden, gehören die Verwendung einer immungeschwächten Maus, die Erzeugung von Metastasen durch Schwanzveneninjektion, die Verwendung eines anderen photokonvertierbaren/photoschaltbaren Proteins oder die Verwendung eines transgenen Tieres, bei dem das photokonvertierbare/photoschaltbare Protein genetisch kodiert ist, so dass die Mäuse für das Protein toleriert werden37. Auch die Stärke und Stabilität des Fluoreszenzsignals im photokonvertierten Kanal muss berücksichtigt werden. Bei vielen photokonvertierbaren/photoschaltbaren Proteinen nimmt das Signal im photokonvertierten Kanal mit der Zeit ab, da das Protein bei der Zellteilung abgebaut und verdünnt wird. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass photokonvertiertes H2B-verknüpftes Dendra2 für 7 Tage in sich teilenden Zellen und 16 Tage in sich nicht teilenden Zellen zuverlässig nachgewiesen werdenkann 38,39. Die Verknüpfung des photokonvertierbaren Proteins mit einem Protein mit einer niedrigen Umsatzrate kann die Halbwertszeit des photokonvertierten Signals verlängern. Die Methoden zur Fehlerbehebung des Lungenmetastasenmodells müssen vom Forschungsziel und dem verwendeten Krebszelltyp abhängen.
Zweitens ist es wichtig, die Operation auf der Grundlage des interessierenden Krankheitsmodells richtig zu planen. Diejenigen, die mit Krankheitsmodellen mit schnell wachsenden Lungenmetastasen arbeiten, haben möglicherweise einen begrenzten Zeitrahmen, um die Operation durchzuführen, bevor die Mäuse von der Tumorlast zu überwältigt sind, um sich von der Operation zu erholen und/oder die gewünschte Zeit nach der Operation zu überleben. Ein gründliches Verständnis des Zeitplans des Krankheitsmodells sowie der Einsatz nicht-invasiver Bildgebungsstrategien wie der Mikro-Computertomographie können bei der zeitlichen Planung dieses Verfahrens helfen.
Drittens kann das versehentliche Durchtrennen wichtiger Gefäße während der Weichteilentfernung zu übermäßigen Blutungen führen, was zu einer schlechten Sicht auf das Operationsfeld und/oder zu einer Ausblutung führt, wie zuvor beschrieben40. Die Vermeidung großer Gefäße und die Verwendung eines kauterisierenden Pens während der Operation können dies verhindern. Viertens ist es beim Einsetzen und Herausnehmen des Retraktors wichtig, die Retraktorblätter immer parallel zur Brustwand zu halten. Das Anwinkeln der Klingen in Richtung der Lunge erhöht das Risiko einer Lungenschädigung, und das Anwinkeln der Klingen in Richtung der Brustwand erhöht das Risiko, die Brustwand in anderen Bereichen zu durchbrechen. Wenn das parallele Einsetzen oder Entfernen des Retraktors nicht möglich erscheint, kann die Mikropräparierschere mit stumpfer Kante verwendet werden, um die Länge des Interkostalschnitts leicht zu erhöhen, bevor versucht wird, den Retraktor erneut einzuführen/zu entfernen. Schließlich sollte darauf geachtet werden, dass der Brustkorb am Ende der Operation wieder vollständig verschlossen ist. Wenn die Rippen wieder zusammengenäht werden, sollte das Nähen ~1 mm vor Beginn des Schnitts begonnen und ~1 mm danach beendet werden. Dadurch werden Restöffnungen an den Enden des Einschnitts vermieden. Achten Sie außerdem darauf, die Naht fest genug zu ziehen und zu binden, um den Raum zwischen den Rippen zu beseitigen, aber nicht so fest, dass die Nähte die angrenzenden Zwischenrippenmuskeln reißen und zusätzliche Durchbrüche verursachen. Wenn die Brusthöhle nicht wieder verschlossen werden kann, sollte die Maus während der Operation auf humane Weise geopfert werden, da sie große Schwierigkeiten hat oder nicht in der Lage ist, selbstständig zu atmen, wenn die mechanische Beatmung gestoppt wird.
Die Lichtquelle und die genaue Methodik für die Photokonversion können von Labor zu Labor variieren. Es können alle Lichtquellen und Methoden verwendet werden, die sicher, konsistent und für das Modell geeignet sind. Zum Beispiel kann die Photokonversion durchgeführt werden, indem die Maus auf ein Stereoskop oder ein anderes Mikroskop übertragen wird, das in der Lage ist, Licht der Wellenlänge und Intensität zu leuchten, die für die Photokonversion auf die exponierte Lunge erforderlich sind. Wir verwenden eine speziell angefertigte 400-nm-Leuchtdioden-Array-Lampe, die auf ihre höchste Intensität eingestellt ist, um Dendra2-exprimierende Lungenmetastasen zu photokonvertieren (ergänzende Abbildung S1). Um die Lampe über der Maus zu stützen und sicherzustellen, dass die Lampe im gleichen Abstand über jeder Maus platziert wird, schneiden wir eine 6,5 x 6,5 cm große Öffnung in den Boden eines offenen Kartons (18,4 cm (L) x 13,2 cm (B) x 7,3 cm (H)). Wir legen die Box kopfüber über die Maus und legen die 8,5 x 8,5 cm große Lampe auf den 6,5 x 6,5 cm großen Ausschnitt (Abbildung 1F), so dass die Lampe gestützt wird und das blaue Licht das freiliegende Lungengewebe erreichen kann.
Es ist wichtig zu beachten, dass einige Aspekte dieses Protokolls, einschließlich der Operation und der Verwendung von Anästhetika, die Ausbreitungskinetik und -kapazität von Tumorzellen verändern können 41,42,43,44. Daher müssen geeignete Kontrollen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse nicht durch das Verfahren verfälscht werden.
Die Haupteinschränkung dieser Technik besteht darin, dass nur Metastasen auf dem exponierten Teil der Lunge einer Photokonversion unterzogen werden. Daher wird nicht jede Tumorzelle, die sich aus der Lunge redisseminiert, photokonvertiert und jede Quantifizierung von redisseminierten Zellen ist relativ. Trotz dieser Einschränkung kann diese Technik immer noch wertvolle Einblicke in die Neuverbreitung von Tumorzellen liefern, einschließlich der Bestimmung, ob und wann sie stattfindet, was sie fördert oder verhindert und den Organotropismus von redisseminierten Zellen. Unseres Wissens ist dies die erste Technik, die eine selektive Markierung und Schicksalsverfolgung von Tumorzellen in der Lunge ermöglicht. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine neuartige Technik, die verwendet werden kann, um die Untersuchung der Neuverbreitung von Tumorzellen und der Aussaat von Metastasen zu Metastasen ohne Genomanalyse zu erleichtern und zu verbessern. Da das Verfahren auf Lungenmetastasen abzielt, ist es nützlich und relevant für Metastasenforscher, die die meisten wichtigen Krebsarten untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Wade Koba für seine Unterstützung bei der Mikro-Computertomographie (S10RR029545), Vera DesMarais und Hillary Guzik von der Analytical Imaging Facility für ihre Ausbildung und Unterstützung bei der Mikroskopie, dem Einstein Montefiore Cancer Center, dem National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), dem Gruss Lipper Biophotonics Center, dem Integrated Imaging Program for Cancer Research, ein Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z) und einen METAvivor Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
