Summary
Presentiamo un metodo per lo studio della ridisseminazione delle cellule tumorali da metastasi polmonari che prevede un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, seguito dall'identificazione di cellule tumorali ridisseminate negli organi terziari.
Abstract
Le metastasi - la diffusione sistemica del cancro - sono la principale causa di decessi correlati al cancro. Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule del tumore primario si disseminano e seminano metastasi, le cellule tumorali nelle metastasi esistenti possono anche ridisseminarsi e dare origine a nuove lesioni nei siti terziari in un processo noto come "metastasi da metastasi" o "semina da metastasi a metastasi". La semina da metastasi a metastasi può aumentare il carico metastatico e diminuire la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base di questo fenomeno è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con cancro metastatico.
Poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sulla semina da metastasi a metastasi si basano principalmente su metodi di sequenziamento, che potrebbero non essere pratici per i ricercatori che studiano l'esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi o ciò che li promuove o li previene. Ciò evidenzia la mancanza di metodologie che facilitino lo studio del seeding da metastasi a metastasi. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato - e descriviamo qui - un protocollo chirurgico murino per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, consentendo la marcatura specifica e il monitoraggio del destino delle cellule tumorali che si ridisseminano dal polmone ai siti terziari. Per quanto ne sappiamo, questo è l'unico metodo per studiare la ridisseminazione delle cellule tumorali e la semina da metastasi a metastasi dai polmoni che non richiede l'analisi genomica.
Introduction
Le metastasi sono la principale causa di decessi correlati al cancro1. Il cancro metastatico insorge quando le cellule del tumore primario si diffondono in tutto il corpo e proliferano in tumori clinicamente rilevabili in organi distanti 2,3.
Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule tumorali si disseminano dal tumore primario e colonizzano organidistanti, l'aumento delle evidenze cliniche e sperimentali suggerisce che è in gioco un processo più complesso e multidirezionale. È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti possono riseminare il tumore primario (se ancora in sede)5,6,7,8,9 e le cellule tumorali provenienti da focolai metastatici esistenti possono viaggiare verso i siti terziari e dare origine a nuove lesioni 10,11,12,13. In effetti, l'evidenza di recenti analisi genomiche suggerisce che alcune lesioni metastatiche non derivano dal tumore primario, ma da altre metastasi, un fenomeno noto come "metastasi da metastasi" o "semina da metastasi a metastasi"14,15,16. La semina da metastasi a metastasi può perpetuare il processo patologico anche dopo la rimozione del tumore primario, aumentando il carico metastatico e diminuendo la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base della semina da metastasi a metastasi è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con malattia metastatica.
Nonostante le implicazioni cliniche potenzialmente gravi, poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sull'uomo sono limitati dalla scarsità di campioni clinici. La resezione clinica e la biopsia delle lesioni metastatiche sono rare, così come la biopsia di organi apparentemente sani, dove possono annidarsi singole cellule tumorali disseminate. Ciò significa che gli studi sull'uomo sono in genere possibili solo utilizzando campioni autoptici di individui i cui tumori primari sono ancora in atto o sono stati precedentemente resecati ma sono ancora disponibili per i ricercatori. Quando tali campioni sono disponibili, le analisi del lignaggio della progressione del cancro devono essere eseguite utilizzando metodi di sequenziamento14. Tuttavia, il sequenziamento di massa di tumori primari e metastasi abbinati non ha la sensibilità necessaria per un tracciamento completo del lignaggio. Ad esempio, il sequenziamento di massa di una lesione può rivelare un subclone che non è rilevabile in nessuna delle sue lesioni corrispondenti. In questo caso, non si sarebbe in grado di determinare l'origine di questo subclone. Può essere stata presente nel tumore primitivo o in un'altra metastasi con una frequenza inferiore al limite di rilevamento, oppure può essere insorta dopo la colonizzazione iniziale della lesione metastatica in cui è stata trovata. Il sequenziamento a singola cellula fornisce una maggiore sensibilità, ma il suo costo elevato limita l'applicazione su larga scala di questa tecnica. La natura retrospettiva di questi studi significa anche che forniscono una visione limitata degli eventi metastatici transitori e del panorama della malattia in diversi punti temporali.
Nei modelli animali, i recenti progressi tecnologici consentono ora una mappatura filogenetica prospettica con un'elevata risoluzione spaziale e temporale 17,18,19,20. Queste tecniche utilizzano l'editing del genoma CRISPR/Cas9 per ingegnerizzare le cellule con un codice a barre in evoluzione, mutazioni ereditabili che si accumulano nel tempo. Al momento del sequenziamento, il lignaggio di ciascuna cellula può essere tracciato in base al profilo mutazionale del suo codice a barre 17,18,19,20. In effetti, tale tecnologia viene già utilizzata per mappare la semina da metastasi a metastasi. In un recente articolo, Zhang et al. hanno dimostrato che le cellule tumorali della mammella e della prostata nelle metastasi ossee si ridisseminano dall'osso per seminare metastasi secondarie in più organi21.
Sebbene questi nuovi metodi abbiano un grande potenziale per generare mappe filogenetiche dettagliate e ad alta risoluzione della progressione del cancro, sono altamente impraticabili per coloro che studiano l'esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi e ciò che li promuove o li previene. Colmare queste lacune di conoscenza è fondamentale per perfezionare la nostra comprensione e il trattamento del cancro metastatico, ma c'è una notevole mancanza di tecnologie per facilitare tali studi. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato - e presentiamo qui - una nuova tecnica che ci consente di marcare in modo specifico le cellule tumorali tramite fotoconversione in un sito metastatico (il polmone) e successivamente reidentificarle negli organi terziari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo recentemente dimostrato che le cellule del cancro al seno si ridisseminano dalle metastasi polmonari e seminano gli organi terziari13. Questa tecnica può anche essere utilizzata per determinare la tempistica degli eventi di ridisseminazione all'interno di una finestra ristretta e quantificare le cellule tumorali disseminate, facilitando lo studio dell'organotropismo delle cellule disseminate e di ciò che promuove/previene la ridisseminazione.
Mentre la fotoconversione e i sistemi cre/lox localmente inducibili che sostituiscono permanentemente una proteina fluorescente con un'altra sono stati precedentemente utilizzati per marcare e tracciare le cellule tumorali 11,22,23, per quanto ne sappiamo, nessun approccio per la marcatura spazio-temporale delle cellule tumorali è stato ottimizzato per colpire il polmone - uno dei siti più comuni di metastasi tra uomini e donne a cui è stato diagnosticato uno dei 14 tumori più comuni 24. Qualsiasi tipo di cellula tumorale e qualsiasi protocollo per la generazione di metastasi polmonari può essere utilizzato con la nostra procedura, rendendola ampiamente utile per i ricercatori di metastasi. Tutte le cellule tumorali utilizzate per generare metastasi polmonari dovrebbero esprimere una proteina fotoconvertibile o fotocommutabile e i ricercatori possono scegliere quale proteina utilizzare in base alle loro esigenze e risorse specifiche. In questo studio, abbiamo utilizzato cellule di carcinoma mammario 6DT1 che esprimevano stabilmente la proteina fluorescente fotoconvertibile da verde a rosso Dendra2 (cellule 6DT1-Dendra2)25 marcata con l'istone H2B. Abbiamo iniettato 5,0 ×10 4 cellule 6DT1-Dendra2 nel quarto cuscinetto adiposo mammario di topi femmina Rag2-/-. I tumori primari erano palpabili tra 12 e 16 giorni dopo l'iniezione e non sono stati resecati per tutta la durata dell'esperimento. Le metastasi polmonari spontanee si sono sviluppate tra 19 e 26 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali. Gli interventi chirurgici di fotoconversione sono stati eseguiti tra 26 e 29 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali. I topi sono stati sacrificati entro 72 ore dall'intervento chirurgico a causa del carico di metastasi polmonari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, inclusa la previa approvazione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Albert Einstein College of Medicine.
Prima dell'intervento chirurgico, le metastasi polmonari devono essere generate nei topi utilizzando cellule tumorali che esprimono una proteina fotoconvertibile/fotocommutabile; Sono stati pubblicati diversi protocolli per la generazione di metastasi polmonari 26,27,28.
1. Preparazione all'intervento chirurgico
- Preparare aree di lavoro distinte per la preparazione del topo (depilazione e intubazione), chirurgia e recupero.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave.
NOTA: Poiché per questo intervento chirurgico viene utilizzata una tecnica di sola punta, è possibile utilizzare uno sterilizzatore a microsfere calde per risterilizzare gli strumenti per le procedure successive. - Accendere la piattaforma chirurgica riscaldata e lasciarla raggiungere e stabilizzare a 37-40 °C.
- Indurre l'anestesia con isoflurano al 5%, quindi abbassare l'isoflurano al 3%. Eseguire periodicamente test di pizzicamento delle dita dei piedi durante la procedura per valutare l'adeguatezza dell'anestesia.
- Posizionare il topo anestetizzato in una posizione di decubito laterale destro. Rimuovere i peli della parte superiore sinistra del torace/lato del corpo (vedere la Figura 1A) applicando una crema depilatoria sulla zona. Inumidisci un pezzo di garza o un tovagliolo di carta con acqua e pulisci i capelli e la crema depilatoria. Ripetere se necessario fino a quando tutti i peli non sono stati rimossi dal campo operatorio.
NOTA: Non lasciare la crema depilatoria sul topo per più di 20 secondi, poiché ciò può danneggiare la pelle. - Fare un doppio nodo ~3 mm sopra la base di un catetere da 22 G con sutura di seta 2-0. Lascia code lunghe 2 pollici.
- Intubare il topo con questo catetere come descritto in precedenza29,30. Per confermare l'esito positivo dell'intubazione, collegare un bulbo di gonfiaggio all'estremità del catetere e premere delicatamente.
NOTA: I topi che sono stati intubati con successo sperimenteranno un aumento bilaterale del torace con compressione del bulbo. - Fissare saldamente la sutura di seta 2-0 attorno al muso del topo con un doppio nodo per mantenere il catetere per intubazione in posizione.
2. Intervento chirurgico per esporre il polmone
NOTA: Eseguire tutte le fasi dell'intervento chirurgico (Figura 1), compresa la fotoconversione, in una cappa o in una cabina a flusso laminare per evitare la contaminazione del campo operatorio.
- Lavarsi le mani con sapone antisettico e indossare guanti sterili nuovi.
NOTA: Poiché per questo intervento chirurgico viene utilizzata una tecnica di sola punta, è possibile utilizzare anche guanti non sterili. Si consiglia di igienizzare guanti non sterili con un disinfettante a base alcolica. - Preparare una dose di 0,1 mg/kg di buprenorfina (0,03 mg/ml) e iniettare per via sottocutanea per analgesia.
NOTA: L'analgesia multimodale, compresi i bloccanti del dolore locali e i farmaci antinfiammatori non steroidei, deve essere utilizzata in combinazione con buprenorfina se non si prevede che interferiscano con la biologia di interesse. - Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi del topo per prevenire danni alla cornea.
- Posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destra sulla piattaforma chirurgica riscaldata.
- Collegare il ventilatore al catetere per intubazione. Fare attenzione a tenere fermo il catetere, poiché anche lievi movimenti possono disturbare il posizionamento del catetere e portare a una scarsa ventilazione.
- Osservare l'alzarsi e l'abbassarsi bilaterale del torace in modo stabile, controllato dal ventilatore.
- Fissare gli arti alla piattaforma chirurgica con nastro adesivo. Stabilizzare il campo chirurgico posizionando un altro pezzo di nastro adesivo lungo la schiena del topo e fissando la pelle dorsale e il pelo alla piattaforma chirurgica (Figura 1A).
- Aprire gli strumenti chirurgici sterilizzati.
- Applicare la soluzione di clorexidina sulla pelle del topo per sterilizzare il sito chirurgico.
- Identificare l'area ~7 mm a sinistra dello sterno e ~7 mm sopra il margine sottocostale. Sollevare la pelle su quest'area con una pinza e praticare un'incisione circolare di ~10 mm utilizzando forbici affilate per microdissezione, avendo cura di tagliare solo la pelle.
- Rimuovere i tessuti molli sopra la gabbia toracica (Figura 1B). Cauterizzare tutti i vasi principali ad entrambe le estremità con una penna per cauterizzazione.
NOTA: Oltre all'asportazione di tutti i tessuti molli sottostanti l'incisione circolare di 10 mm nella pelle, la rimozione di alcuni tessuti molli non muscolari aggiuntivi dal perimetro facilita le fasi future della procedura. - Con una mano, usa le pinze per sollevare la 6ao la 7a costola. Con l'altra mano, utilizzare una singola lama delle forbici da micro-dissezione smussate - angolata parallelamente alla parete toracica, bordo arrotondato rivolto verso il basso - e perforare con cautela il 6° o 7° muscolo intercostale per entrare nella cavità toracica (Figura 1C). Ruotare delicatamente le forbici secondo necessità e tagliare per praticare un'incisione di ~10 mm nello spazio intercostale, facendo attenzione a non toccare il tessuto polmonare e tagliare le costole.
- Scaricare delicatamente l'aria compressa verso l'incisione intercostale per aumentare lo spazio tra il polmone e la parete toracica. Scaricare l'aria prima dal polso o dalla mano per trovare la forza di flusso appropriata e liberare l'ugello da eventuali detriti, quindi in brevi raffiche sull'incisione per prevenire lesioni polmonari.
- Con una mano, usa le pinze per sollevare la 6ao la 7a costola. Con l'altra mano, tenere chiuso il divaricatore e inserirlo nell'incisione intercostale. Orientare le lame del divaricatore in modo che siano parallele alla parete toracica, facendo attenzione a non toccare il polmone stesso (Figura 1D).
- Una volta posizionato il divaricatore, rilasciare lentamente la maniglia, consentendo al divaricatore di aprirsi ed esporre il polmone (Figura 1E). La Figura 2A mostra immagini rappresentative delle metastasi polmonari esposte prima della fotoconversione, compreso il loro aspetto ad occhio nudo e nei canali fluorescenti FITC (verde, non fotoconvertito) e TRITC (rosso, fotoconvertito) durante l'utilizzo dell'illuminazione ad ampio campo.
3. Fotoconversione delle metastasi polmonari
NOTA: I dettagli e le variazioni sui seguenti passaggi sono disponibili nella Discussione.
- Applicare delicatamente 2-3 gocce di PBS sterile riscaldato a 37 °C sul tessuto polmonare esposto per evitare che si secchi.
- Posiziona un pezzo di foglio di alluminio sterile con un piccolo ritaglio sopra il mouse. Posizionare il ritaglio direttamente sul tessuto polmonare esposto e dimensionarlo in modo da esporre solo la porzione aperta del torace e alcuni millimetri di tessuto molle e pelle circostanti per garantire la fotoconversione del solo polmone esposto.
- Posiziona una scatola con un ritaglio sopra il mouse e un foglio di alluminio. Assicurarsi che l'apertura sia direttamente sopra il polmone esposto.
- Posizionare la lampada di fotoconversione direttamente sopra l'apertura sulla scatola (Figura 1F).
- Accendere la lampada di fotoconversione e lasciare 6 minuti di illuminazione continua del tessuto polmonare esposto.
NOTA: Monitorare i segni vitali del topo utilizzando i programmi di monitoraggio fisiologico sul ventilatore. - Dopo la fotoconversione, spegnere la lampada e rimuovere la lampada, la scatola e la maschera di alluminio dal mouse.
4. Procedura per chiudere la parete toracica
- Ripetere il passaggio 2.13 per separare il polmone dalla parete toracica.
- Afferrare con cautela la maniglia del divaricatore e premere per chiudere le lame.
- Manovrare il divaricatore chiuso fuori dallo spazio intercostale, facendo attenzione a non toccare il tessuto polmonare.
- Utilizzando la sutura di seta 5-0, chiudere l'incisione intercostale con un semplice schema di sutura continuo che incorpora la costola su entrambi i lati dell'incisione (Figura 1G). Stringere la sutura per assicurarsi che i bordi della ferita siano apposizionali e ristabilire l'integrità della parete toracica (Figura 1H). Fare attenzione a non stringere eccessivamente la sutura in quanto ciò potrebbe strappare i muscoli intercostali.
- Fissare la sutura annodando insieme le due estremità della sutura 4 volte. Taglia le code di sutura il più vicino possibile al nodo.
- Chiudere la pelle con graffette chirurgiche.
- Rimuovere l'aria in eccesso dalla cavità toracica con una siringa da insulina da 1 mL con un ago da 28 G attaccato. Localizzare il processo xifoideo tattilmente e inserire l'ago appena sotto, avanzando verso la spalla sinistra per entrare nella cavità toracica attraverso il diaframma. Tirare indietro la siringa a ~1 mL; Rimuovere l'ago dal mouse e scaricare l'aria dalla siringa. Ripeti questo processo 3-4 volte.
NOTA: Fare attenzione a non forare gli organi interni. Inoltre, è importante utilizzare una siringa da 1 mL e ripetere la procedura 3-4 volte piuttosto che utilizzare una siringa di volume maggiore e cercare di rimuovere tutta l'aria in una volta. L'uso di una siringa di volume maggiore può provocare un vuoto eccessivo nella cavità toracica e portare a distensione e danni al tessuto polmonare. - Spegnere l'isoflurano.
- Continuare la ventilazione con ossigeno al 100% fino a quando il topo non mostra segni di risveglio.
- Una volta che il topo mostra segni di risveglio, scollegare il catetere per intubazione dal ventilatore, tagliare la sutura intorno al muso ed estubare il topo.
- Sblocca il mouse e trasferiscilo in una gabbia pulita posizionata ~ 2 piedi sotto una lampada riscaldante. Monitorare fino a completo ripristino. Se il topo mostra segni di difficoltà respiratoria o mancanza di mobilità, anestetizzarlo con isoflurano al 5% per 5 minuti, garantire un'anestesia adeguata osservando una perdita di riflessi al momento del pizzicamento delle dita dei piedi e praticare l'eutanasia tramite lussazione cervicale.
- Una volta che il topo si è completamente risvegliato dall'anestesia e inizia a muoversi, preparare un'altra dose di 0,1 mg/kg di buprenorfina e iniettarla per via sottocutanea per l'analgesia postoperatoria.
- Dopo l'intervento, assicurarsi che i topi siano alloggiati individualmente. Fornire antibiotici nell'acqua potabile (enrofloxacina, concentrazione finale 0,4 mg/mL).
- Nei 3 giorni successivi all'intervento, controllare il topo due volte al giorno per segni di sofferenza. Per la gestione del dolore, somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina (0,03 mg/ml) per via sottocutanea ogni 4-6 ore. Sopprimere il topo se mostra segni di infezione, immobilità o difficoltà respiratorie. Dopo il terzo giorno, i topi possono essere controllati una volta al giorno.
5. Elaborazione del campione e rilevamento di cellule fotoconvertite mediante pulizia dei tessuti
- Tra 3 e 5 giorni (o il periodo di tempo desiderato) dopo l'intervento di fotoconversione, anestetizzare il topo con isoflurano al 5%, ridurre l'isoflurano dal 5% al 2,5% dopo l'induzione, garantire un'anestesia adeguata osservando una perdita di riflessi al momento del pizzicamento delle dita dei piedi ed eseguire una perfusione transcardica terminale con 10 mL di PBS a temperatura ambiente, seguita da 10 mL di paraformaldeide al 4% raffreddata a 4 °C come descrittoin precedenza 31.
- Raccogliere gli organi di interesse e pulirli otticamente come descritto in precedenza31.
- Visualizzare i tessuti puliti con un microscopio a foglio ottico come descrittoin precedenza 31. In alternativa, posizionare i tessuti puliti in una capsula con fondo di vetro e visualizzare l'immagine nei canali FITC e TRITC per visualizzare le cellule verdi (non fotoconvertite) e rosse (fotoconvertite) utilizzando un microscopio confocale, a disco rotante o multifotone.
6. Elaborazione del campione e rilevamento di cellule fotoconvertite mediante disaggregazione tissutale
- Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% per 5 minuti, garantire un'anestesia adeguata osservando una perdita di riflessi al momento del pizzicamento delle dita dei piedi e sacrificare tramite lussazione cervicale 3-5 giorni dopo la fotoconversione.
- Raccogliere e digerire gli organi di interesse come descritto in precedenza13.
- Impiattare i tessuti digeriti e metterli in un'incubatrice per farli aderire per una notte come descritto in precedenza13.
- Il giorno seguente, eseguire l'imaging delle cellule piastrate nei canali FITC e TRITC per visualizzare le celle verdi (non fotoconvertite) e rosse (fotoconvertite) come descritto in precedenza13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le fasi dell'intervento chirurgico descritte in questo protocollo sono illustrate nella Figura 1. In breve, il topo viene anestetizzato e i peli vengono rimossi dal torace sinistro. Il topo viene quindi intubato e ventilato, il che consente al topo di ricevere ossigeno mentre la cavità toracica è aperta. I tessuti molli vengono rimossi per esporre la gabbia toracica e viene praticata un'incisione nel 6° o 7° muscolo intercostale. Un divaricatore viene inserito nella breccia intercostale e rilasciato per allargare le costole adiacenti ed esporre il polmone sinistro ed eventuali metastasi fotoconvertibili su di esso. Il polmone e le metastasi vengono quindi esposti alla luce blu per fotoconvertire le lesioni esposte. Dopo la fotoconversione, il divaricatore viene rimosso, le costole vengono suturate insieme e la pelle sovrastante viene chiusa. Infine, l'aria in eccesso viene rimossa dalla cavità toracica per alleviare la pressione sui polmoni e consentire al topo di riprendere la respirazione autonoma e spontanea.
Il protocollo qui descritto può essere adattato a diverse proteine fotoconvertibili/fotocommutabili. Garantire che le cellule fotoconvertite raggiungano la loro massima intensità di fluorescenza nel canale fotoconvertito può facilitare la loro identificazione in altri organi. Le condizioni necessarie per raggiungere l'intensità di fluorescenza di picco dopo la fotoconversione devono essere determinate empiricamente, in quanto possono variare con altri aspetti dell'esperimento, come la proteina fotoconvertibile utilizzata e l'intensità della luce utilizzata per la fotoconversione. Le Figure 2B,C mostrano come l'intensità della fluorescenza sia cambiata in entrambi i canali FITC (non fotoconvertito) e TRITC (fotoconvertito) in funzione della durata dell'esposizione alla luce blu in un campione ex vivo. Abbiamo determinato che 6 minuti di esposizione alla luce blu producevano il segnale più luminoso nel canale fotoconvertito e che un'esposizione aggiuntiva portava al fotosbiancamento. Abbiamo quindi misurato l'intensità della fluorescenza in entrambi i canali prima e dopo 6 minuti di esposizione alla luce blu, in vivo, e abbiamo ottenuto risultati simili (Figura 2D).
Successivamente, il cervello, il fegato e il polmone destro non fotoconvertito sono stati prelevati da topi sottoposti a questo intervento chirurgico con (gruppo sperimentale) e senza (gruppo di controllo) la lampada di fotoconversione accesa. I tessuti sono stati puliti otticamente come descrittoin precedenza 31, posti in un piatto con fondo di vetro e ripresi su un microscopio multifotonepersonalizzato 32 utilizzando un obiettivo 25x 1.0 NA e una lunghezza d'onda di eccitazione di 880 nm. La fluorescenza è stata catturata per i canali verde e rosso utilizzando i filtri passa-banda rispettivamente 525/35 nm e 580/60 nm. Le cellule fotoconvertite e non fotoconvertite possono essere chiaramente identificate in tutti e tre i tipi di tessuto dei topi che hanno subito l'intervento chirurgico con esposizione alla luce blu (Figura 3). Come previsto, solo cellule tumorali non fotoconvertite sono state trovate nei tessuti dei topi che hanno subito l'intervento chirurgico senza esposizione alla luce blu.
Figura 1: Panoramica del protocollo chirurgico per l'intervento di fotoconversione polmonare. (A) Topo depilato posto sul palco chirurgico e fissato in posizione con nastro adesivo. (B) Una pulizia circolare di 10 mm della pelle e dei tessuti molli sopra la gabbia toracica. (C) Rottura iniziale del muscolo intercostale con forbici da micro-dissezione a bordo smussato. (D) Divaricatore chiuso inserito in un'incisione intercostale di 10 mm. (E) Divaricatore aperto che espone il tessuto polmonare. (F) Lampada di fotoconversione posizionata direttamente sopra il torace aperto del topo. (G) Sutura continua semplice che incorpora la costola su entrambi i lati dell'incisione intercostale. (H) Sutura serrata e fissata per ristabilire l'integrità della parete toracica. (I) Rimozione dell'aria dalla cavità toracica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Determinazione delle condizioni necessarie per raggiungere l'intensità di fluorescenza di picco nel canale fotoconvertito. (A) Immagini rappresentative delle metastasi polmonari esprimenti Dendra2 esposte prima dell'esposizione alla luce blu nell'illuminazione della stanza senza filtri e a basso ingrandimento (1) e alto ingrandimento (2) e alto ingrandimento nei canali FITC (3) e TRITC con illuminazione a campo largo (4). (B) Immagini a fluorescenza di una metastasi polmonare che esprime Dendra2 prima dell'esposizione alla luce blu e dopo 2 minuti, 4 minuti, 6 minuti e 8 minuti di esposizione alla luce blu, ex vivo. (C) Intensità media di fluorescenza normalizzata di una metastasi polmonare esprimente Dendra2 in funzione della durata dell'esposizione alla luce blu, ex vivo. (D) Intensità media di fluorescenza normalizzata di una metastasi polmonare che esprime Dendra2 prima e dopo 6 minuti di esposizione alla luce blu, in vivo. Barre graduate = 2 mm (A), 400 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di cellule tumorali fotoconvertite (riga in alto) e non fotoconvertite (riga in basso) trovate nel polmone controlaterale, nel cervello e nel fegato di topi sottoposti a intervento chirurgico di fotoconversione. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: Lampada LED Array da 400 nm costruita su misura.(A) spento e (B) acceso. CF = Ventola di raffreddamento, R = Riflettore, LED = LED ad alta potenza da 400 nm. Fare clic qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo articolo, descriviamo un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle cellule tumorali nel polmone. Questa tecnica consente ai ricercatori di contrassegnare selettivamente le cellule tumorali nel polmone e di monitorarne il destino reidentificandole in tutto il corpo in un secondo momento, facilitando lo studio delle metastasi da metastasi polmonari. Utilizzando questo protocollo, è stato possibile visualizzare le cellule fotoconvertite nel cervello, nel fegato e nel polmone destro non fotoconvertito di topi che avevano subito l'intervento chirurgico con fotoconversione, indicando che queste cellule si sono ridisseminate dalle metastasi polmonari fotoconvertite a questi siti terziari. Non abbiamo trovato globuli rossi negli organi dei topi che non hanno subito fotoconversione, indicando che l'autofluorescenza naturale nelle cellule non è abbastanza luminosa da essere confusa con le cellule tumorali fotoconvertite.
Un'attenta attenzione ad alcuni aspetti dell'esperimento può aumentare il tasso di successo di questa procedura. Innanzitutto, quando si generano metastasi polmonari, è necessario considerare il protocollo per la generazione di metastasi e la proteina fotoconvertibile/fotocommutabile. È stato riportato che alcune proteine fluorescenti sono immunogeniche 33,34,35,36. Pertanto, le cellule tumorali che esprimono tali proteine potrebbero non metastatizzare spontaneamente nei topi immunocompetenti. Infatti, abbiamo osservato che i tumori primari si formano sia nei topi singenico, immunocompetenti (FVB) che nei topi immunocompromessi (Rag2-/-) dopo l'iniezione ortotopica di cellule 6DT1-Dendra2. Tuttavia, le metastasi si sono sviluppate solo nei topi Rag2-/-, indicando che Dendra2 può essere in qualche modo immunogenico. I modi per superare la potenziale immunogenicità delle proteine fluorescenti per generare metastasi polmonari includono l'uso di un topo immunocompromesso, la generazione di metastasi tramite iniezione nella vena caudale, l'utilizzo di una diversa proteina fotoconvertibile/fotocommutabile o l'utilizzo di un animale transgenico in cui la proteina fotoconvertibile/fotocommutabile è geneticamente codificata in modo che i topi siano tollerati alla proteina37. Devono essere considerate anche l'intensità e la stabilità del segnale fluorescente nel canale fotoconvertito. Per molte proteine fotoconvertibili/fotocommutabili, il segnale nel canale fotoconvertito diminuisce nel tempo man mano che la proteina viene degradata e diluita con la divisione cellulare. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che Dendra2 legato all'H2B fotoconvertito può essere rilevato in modo affidabile per 7 giorni nelle cellule in divisione e 16 giorni nelle cellule non in divisione38,39. Collegare la proteina fotoconvertibile a una proteina con un basso tasso di turnover può prolungare l'emivita del segnale fotoconvertito. I metodi per la risoluzione dei problemi del modello di metastasi polmonari devono dipendere dall'obiettivo della ricerca e dal tipo di cellula tumorale utilizzata.
In secondo luogo, è importante programmare correttamente l'intervento chirurgico in base al modello di malattia di interesse. Coloro che lavorano con modelli di malattia con metastasi polmonari a crescita rapida possono avere un lasso di tempo limitato in cui eseguire l'intervento chirurgico prima che i topi diventino troppo sopraffatti dal carico tumorale per riprendersi dall'intervento chirurgico e/o sopravvivere alla quantità di tempo desiderata dopo l'intervento chirurgico. Una comprensione approfondita della sequenza temporale del modello di malattia, nonché l'uso di strategie di imaging non invasive come la micro tomografia computerizzata, possono aiutare a cronometrare questa procedura.
In terzo luogo, il taglio involontario dei vasi principali durante la rimozione dei tessuti molli può causare un sanguinamento eccessivo, con conseguente scarsa visibilità del campo operatorio e/o dissanguamento, come descritto in precedenza40. Evitare i vasi grandi e utilizzare una penna cauterizzante durante l'intervento chirurgico può prevenirlo. In quarto luogo, quando si inserisce e si rimuove il divaricatore, è fondamentale mantenere sempre le lame del divaricatore parallele alla parete toracica. Inclinare le lame verso il polmone aumenta il rischio di danni polmonari e inclinare le lame verso la parete toracica aumenta il rischio di rompere la parete toracica in altre aree. Se l'inserimento o la rimozione del divaricatore in parallelo non sembra possibile, è possibile utilizzare le forbici per microdissezione a bordo smussato per aumentare leggermente la lunghezza dell'incisione intercostale prima di provare a inserire/rimuovere nuovamente il divaricatore. Infine, è necessario prestare attenzione per garantire che la gabbia toracica sia completamente richiusa al termine dell'intervento. Quando si suturano le costole, la sutura deve essere iniziata ~ 1 mm prima dell'inizio dell'incisione e terminata ~ 1 mm dopo. Questo aiuta a evitare aperture residue alle estremità dell'incisione. Inoltre, fai attenzione a tirare e legare la sutura abbastanza stretta da eliminare lo spazio tra le costole, ma non così stretta da strappare i muscoli intercostali adiacenti e creare ulteriori brecce. Se non è possibile richiudere la cavità toracica, il topo deve essere sacrificato umanamente durante l'intervento, poiché avrà grandi difficoltà o non sarà in grado di respirare da solo quando la ventilazione meccanica viene interrotta.
La sorgente luminosa e la metodologia esatta per la fotoconversione possono variare da un laboratorio all'altro. È possibile utilizzare qualsiasi fonte di luce e metodologie sicure, coerenti e appropriate per il modello. Ad esempio, la fotoconversione può essere eseguita trasferendo il topo su uno stereoscopio o su un altro microscopio in grado di emettere luce della lunghezza d'onda e dell'intensità necessarie per la fotoconversione sul polmone esposto. Utilizziamo una lampada a diodi emettitori di luce da 400 nm impostata sulla massima intensità per fotoconvertire le metastasi polmonari che esprimono Dendra2 (Figura supplementare S1). Per sostenere la lampada sopra il mouse e garantire che la lampada sia posizionata alla stessa distanza sopra ogni mouse, abbiamo tagliato un'apertura di 6,5 x 6,5 cm sul fondo di una scatola di cartone aperta (18,4 cm (L) x 13,2 cm (L) x 7,3 cm (A)). Posizioniamo la scatola capovolta sopra il mouse e appoggiamo la lampada di 8,5 x 8,5 cm sul ritaglio di 6,5 x 6,5 cm (Figura 1F), in modo che la lampada sia supportata e la luce blu possa raggiungere il tessuto polmonare esposto.
È importante notare che alcuni aspetti di questo protocollo, tra cui la chirurgia e l'uso di anestetici, possono alterare la cinetica di disseminazione e la capacità delle cellule tumorali 41,42,43,44. Pertanto, è necessario utilizzare controlli adeguati per garantire che i risultati non siano confusi dalla procedura.
Il limite principale di questa tecnica è che solo le metastasi sulla porzione esposta del polmone andranno incontro a fotoconversione. Pertanto, non tutte le cellule tumorali che si ridisseminano dal polmone saranno fotoconvertite e qualsiasi quantificazione delle cellule ridisseminate sarà relativa. Nonostante questa limitazione, questa tecnica può ancora fornire preziose informazioni sulla ridisseminazione delle cellule tumorali, compresa la determinazione se e quando avviene, cosa la promuove o la previene e l'organotropismo delle cellule ridisseminate. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima tecnica che consente la marcatura selettiva e il monitoraggio del destino delle cellule tumorali nel polmone. In conclusione, questo protocollo descrive una nuova tecnica che può essere utilizzata per facilitare e migliorare lo studio della ridisseminazione delle cellule tumorali e della semina da metastasi a metastasi senza analisi genomica. Il targeting delle metastasi polmonari rende la procedura utile e rilevante per i ricercatori sulle metastasi che studiano la maggior parte dei principali tipi di cancro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Wade Koba per la sua assistenza con la micro tomografia computerizzata (S10RR029545), Vera DesMarais e Hillary Guzik dell'Analytical Imaging Facility per la loro formazione e assistenza con la microscopia, l'Einstein Montefiore Cancer Center, il National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), il Gruss Lipper Biophotonics Center, l'Integrated Imaging Program for Cancer Research, una borsa di studio post-dottorato Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) e un premio per lo sviluppo della carriera METAvitor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
