Summary
폐 전이의 선택적 광전환을 위한 수술 프로토콜과 함께 폐 전이에서 종양 세포 재확산을 연구한 후 3차 장기에서 재분해된 종양 세포를 식별하는 방법을 제시합니다.
Abstract
암의 전신 확산인 전이는 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 전이는 일반적으로 원발성 종양의 세포가 퍼져나가 종자 전이가 되는 단방향 과정으로 생각되지만, 기존 전이의 종양 세포도 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려진 과정을 통해 3차 부위에 새로운병변을 일으키고 재파종할 수 있습니다. 전이-전이 파종은 전이 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 이 현상의 이면에 있는 과정을 이해하는 것은 전이성 암 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.
전이에서 전이로의 파종에 대해서는 알려진 바가 거의 없는데, 이는 부분적으로 물류 및 기술적 한계 때문입니다. 전이-전이 파종에 대한 연구는 주로 염기서열 분석 방법에 의존하는데, 이는 전이-전이 파종 사건의 정확한 시기나 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 연구자에게는 실용적이지 않을 수 있습니다. 이는 전이-전이 파종 연구를 촉진하는 방법론이 부족하다는 것을 강조합니다. 이 문제를 해결하기 위해 폐 전이의 선택적 광전환을 위한 쥐 수술 프로토콜을 개발하여 폐에서 3차 부위로 재분해하는 종양 세포의 특이적 표시 및 운명 추적을 가능하게 합니다. 우리가 아는 한, 이것은 게놈 분석이 필요하지 않은 폐에서 종양 세포 재확산 및 전이-전이 파종을 연구하는 유일한 방법입니다.
Introduction
전이는 암 관련 사망의 주요 원인이다1. 전이성 암은 원발성 종양의 세포가 몸 전체로 퍼져 멀리 떨어진 장기에서 임상적으로 검출 가능한 종양으로 증식할 때 발생한다 2,3.
전이는 일반적으로 종양 세포가 원발성 종양에서 퍼져 멀리 떨어진장기를 식민지화하는 단방향 과정으로 생각되지만4 임상 및 실험적 증거가 증가함에 따라 더 복잡하고 다방향적인 과정이 작용하고 있음을 시사한다. 순환 종양 세포는 원발성 종양(아직 제자리에 있는 경우)을 재파종할 수 있으며5,6,7,8,9 기존 전이성 병소의 종양 세포는 3차 부위로 이동하여 새로운 병변을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다 10,11,12,13. 실제로, 최근 게놈 분석의 증거에 따르면 일부 전이성 병변은 원발성 종양이 아니라 다른 전이에서 발생하며, 이러한 현상은 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려져 있습니다14,15,16. 전이-전이 파종은 원발성 종양을 제거한 후에도 질병 진행을 지속시켜 전이성 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 전이에서 전이로의 파종 과정을 이해하는 것은 전이성 질환 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.
잠재적으로 심각한 임상적 영향에도 불구하고, 부분적으로 물류 및 기술적 한계로 인해 전이-전이 파종에 대해 알려진 바가 거의 없습니다. 사람을 대상으로 한 연구는 임상 샘플의 부족으로 인해 한계가 있습니다. 전이성 병변의 임상적 절제와 생검은 드물며, 겉보기에 건강해 보이는 장기의 생검도 드물며, 단일 파종된 종양 세포가 숨어 있을 수 있습니다. 즉, 인간 대상 연구는 일반적으로 원발성 종양이 아직 제자리에 있거나 이전에 절제되었지만 연구자가 여전히 사용할 수 있는 개인의 부검 샘플을 사용해서만 가능합니다. 이러한 샘플을 이용할 수 있는 경우, 암 진행에 대한 계통 분석은 염기서열 분석 방법14을 사용하여 수행되어야 한다. 그러나 일치하는 원발성 종양 및 전이의 대량 염기서열 분석은 포괄적인 계통 추적에 필요한 민감도를 가지고 있지 않습니다. 예를 들어, 하나의 병변에 대한 대량 염기서열 분석은 일치하는 병변 중 어느 것에서도 검출할 수 없는 서브클론을 드러낼 수 있습니다. 이 경우 이 서브클론의 기원을 확인할 수 없습니다. 원발성 종양 또는 다른 전이에서 검출 한계 이하의 빈도로 존재했을 수도 있고, 발견된 전이성 병변의 초기 집락화 이후에 발생했을 수도 있습니다. 단일 세포 염기서열분석은 향상된 감도를 제공하지만 높은 비용으로 인해 이 기술의 대규모 적용이 제한됩니다. 이러한 연구의 후향적 특성은 또한 일시적인 전이성 사건과 서로 다른 시점의 질병 환경에 대한 제한된 통찰력을 제공한다는 것을 의미합니다.
동물 모델에서, 최근의 기술 발전은 이제 높은 공간 및 시간 해상도 17,18,19,20을 갖는 전향적 계통발생 매핑을 가능하게 한다. 이러한 기술은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 활용하여 시간이 지남에 따라 축적되는 유전 가능한 돌연변이인 진화하는 바코드로 세포를 엔지니어링합니다. 염기서열분석 시 각 세포의 계통은 바코드 17,18,19,20의 돌연변이 프로파일을 기반으로 추적할 수 있습니다. 실제로, 이러한 기술은 이미 전이-전이 파종을 매핑하는 데 사용되고 있습니다. 최근 논문에서 Zhang 등은 뼈 전이의 유방암 및 전립선암 세포가 뼈에서 재확산되어 여러 장기의 2차 전이를 종자한다는 것을 입증했습니다21.
이러한 새로운 방법은 암 진행에 대한 상세한 고해상도 계통발생 지도를 생성할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있지만, 전이에서 전이로의 파종 사건의 정확한 시기와 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 사람들에게는 매우 비실용적입니다. 이러한 지식 격차를 해소하는 것은 전이성 암에 대한 이해와 치료를 개선하는 데 매우 중요하지만 이러한 연구를 촉진하는 기술이 눈에 띄게 부족합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 우리는 최근에 전이 부위(폐)에서 광변환을 통해 종양 세포를 특이적으로 표시한 후 3차 장기에서 재식별할 수 있는 새로운 기술을 개발하여 여기에 제시합니다. 이 기술을 사용하여 우리는 최근 유방암 세포가 폐 전이와 종자 3차 장기에서 재증식한다는 것을 보여주었다13. 이 기술은 또한 좁은 창 내에서 재확산 사건의 타이밍을 결정하고 재확산된 종양 세포를 정량화하는 데 사용할 수 있으며, 재확산된 세포의 유기 영양성 및 재확산을 촉진/방지하는 요인에 대한 연구를 용이하게 합니다.
하나의 형광 단백질을 다른 형광 단백질로 영구적으로 대체하는 광변환 및 국소 유도 cre/lox 시스템은종양 세포를 표시하고 추적하는 데 이전에 사용되었지만, 우리가 아는 한, 종양 세포의 시공간 표시에 대한 접근 방식은 가장 흔한 14가지 암 중 하나로 진단된 남성과 여성에게 가장 흔한 전이 부위 중 하나인 폐를 표적으로 삼도록 최적화되지 않았습니다24. 모든 암세포 유형과 폐 전이 생성을 위한 모든 프로토콜을 당사 절차와 함께 사용할 수 있으므로 전이 연구자에게 광범위하게 유용합니다. 폐 전이를 생성하는 데 사용되는 모든 암세포는 광전환 또는 광전환 가능한 단백질을 발현해야 하며, 연구자들은 특정 필요와 자원에 따라 사용할 단백질을 선택할 수 있습니다. 이 연구에서는 히스톤 H2B에 태그된 광변환 가능한 녹색-적색 형광 단백질 Dendra2(6DT1-Dendra2 세포)25를 안정적으로 발현하는 6DT1 유방암 세포를 사용했습니다. 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 세포를 암컷 Rag2-/- 마우스의 네 번째 유방 지방 패드에 주입했습니다. 원발성 종양은 주사 후 12일에서 16일 사이에 만져질 수 있었고 실험 기간 동안 절제되지 않았습니다. 자발적 폐 전이는 종양 세포 주입 후 19일에서 26일 사이에 발생했습니다. 광전환 수술은 종양 세포 주입 후 26일에서 29일 사이에 수행되었습니다. 마우스는 폐 전이 부담으로 인해 수술 후 72시간 이내에 희생되었습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
수술 전에 광전환/광전환 단백질을 발현하는 암세포를 사용하여 마우스에서 폐 전이를 생성해야 합니다. 폐 전이 생성에 대한 몇 가지 프로토콜이 발표되었습니다 26,27,28.
1. 수술 준비
- 마우스 준비(제모 및 삽관), 수술 및 회복을 위한 고유한 작업 영역을 준비합니다.
- 오토클레이브의 모든 수술 기구를 멸균합니다.
참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 핫 비드 멸균기를 사용하여 후속 절차를 위해 기구를 다시 멸균할 수 있습니다. - 가열된 수술 플랫폼을 켜고 37-40°C에 도달하여 안정화되도록 합니다.
- 5% 이소플루란으로 마취를 유도한 후 이소플루란을 3%로 낮춘다. 마취 적합성을 평가하기 위해 시술 전반에 걸쳐 주기적으로 발가락 꼬집기 검사를 수행합니다.
- 마취된 쥐를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다. 왼쪽 가슴/옆구리 몸통의 털( 그림 1A 참조)을 해당 부위에 제모 크림을 발라 제거합니다. 거즈나 종이 타월을 물에 적셔 머리카락과 제모 크림을 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락이 제거될 때까지 필요에 따라 반복합니다.
알림: 피부를 손상시킬 수 있으므로 제모 크림을 마우스에 20초 이상 두지 마십시오. - 22G 카테터 바닥 위 ~3mm의 이중 매듭을 2-0 실크 봉합사로 묶습니다. 2인치 길이의 꼬리를 남겨 둡니다.
- 앞서 설명한 대로 이 카테터로 마우스를 삽관합니다29,30. 성공적인 삽관을 확인하려면 팽창 전구를 카테터 끝에 부착하고 부드럽게 짜십시오.
알림: 성공적으로 삽관된 마우스는 구근 압착으로 양측 흉부 상승을 경험하게 됩니다. - 삽관 카테터를 제자리에 고정하기 위해 이중 매듭으로 쥐의 주위에 2-0 실크 봉합사를 단단히 고정합니다.
2. 폐를 노출시키는 수술
알림: 수술 필드의 오염을 방지하기 위해 후드 또는 층류 캐비닛에서 광변환을 포함한 수술의 모든 단계(그림 1)를 수행합니다.
- 소독 비누로 손을 씻고 새 멸균 장갑을 착용하십시오.
참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 비멸균 장갑도 사용할 수 있습니다. 비멸균 장갑은 알코올 기반 소독제로 소독하는 것이 좋습니다. - 부프레노르핀 0.1mg/kg(0.03mg/mL)을 준비하고 진통을 위해 피하 주사합니다.
참고: 국소 통증 차단제 및 비스테로이드성 항염증제를 포함한 복합 진통제는 관심 있는 생물학을 방해하지 않을 것으로 예상되는 경우 부프레노르핀과 함께 사용해야 합니다. - 각막 손상을 방지하기 위해 양쪽 쥐 눈에 안과 연고를 바릅니다.
- 가열된 수술 플랫폼의 오른쪽 측면 욕창 위치에 마우스를 놓습니다.
- 인공호흡기를 삽관 카테터에 연결합니다. 카테터를 약간만 움직여도 카테터 배치를 방해하고 환기가 잘 되지 않을 수 있으므로 카테터를 안정적으로 유지하도록 주의하십시오.
- 안정적이고 인공호흡기로 제어되는 양측 흉부의 상승 및 하강을 관찰합니다.
- 라벨링 테이프로 팔다리를 수술 플랫폼에 고정합니다. 쥐의 등을 따라 다른 테이프를 붙이고 등쪽 피부와 털을 수술 플랫폼에 고정하여 수술 부위를 안정화합니다(그림 1A).
- 멸균된 수술 기구를 엽니다.
- 클로르헥시딘 용액을 쥐의 피부에 도포하여 수술 부위를 소독합니다.
- 흉골 왼쪽 ~7mm, 늑골하 가장자리 ~7mm 위 영역을 식별합니다. 집게로 이 부위의 피부를 들어 올리고 날카로운 미세 해부 가위를 사용하여 ~10mm의 원을 절개하고 피부만 자르도록 주의합니다.
- 흉곽 위의 연조직을 제거합니다(그림 1B). 소작 펜으로 양쪽 끝의 주요 혈관을 소작합니다.
참고: 피부의 10mm 원형 절개 아래에 있는 모든 연조직을 절제하는 것 외에도 주변에서 일부 비근육 연조직을 추가로 제거하면 시술의 향후 단계가 용이합니다. - 한 손으로 집게를 사용하여 6번째 또는 7번째 갈비뼈를 들어 올립니다. 다른 손으로는 뭉툭한 미세 해부 가위의 단일 날(흉벽과 평행하게 기울어지고 둥근 모서리가 아래를 향함)을 사용하여 6번째 또는 7 번째늑간근 을 조심스럽게 뚫어 흉강으로 들어갑니다(그림 1C). 필요에 따라 가위를 부드럽게 돌리고 늑간 공간을 ~10mm 절개하도록 자르고 폐 조직을 만지거나 갈비뼈가 잘리지 않도록 주의합니다.
- 늑간 절개 부위로 압축 공기를 섬세하게 배출하여 폐와 흉벽 사이의 공간을 늘립니다. 먼저 손목이나 손으로 공기를 배출하여 적절한 유동 강도를 찾고 노즐의 이물질을 제거한 다음 절개 부위에서 짧은 분사로 폐 손상을 방지합니다.
- 한 손으로 집게를 사용하여 6번째 또는 7번째 갈비뼈를 들어 올립니다. 다른 손으로 견인기를 닫은 상태로 늑간 절개부에 삽입합니다. 견인기의 날이 흉벽과 평행이 되도록 방향을 잡고 폐 자체에 닿지 않도록 주의합니다(그림 1D).
- 견인기가 제자리에 있으면 손잡이를 천천히 풀어 견인기가 열리고 폐가 노출되도록 합니다(그림 1E). 그림 2A 는 광시야 조명을 사용하는 동안 육안으로 보이는 모습과 FITC(녹색, 비광변환) 및 TRITC(적색, 광변환) 형광 채널에서 광변환 전에 노출된 폐 전이의 대표적인 이미지를 보여줍니다.
3. 폐 전이 광변환
참고: 다음 단계에 대한 자세한 내용 및 변형은 토론에서 찾을 수 있습니다.
- 건조를 방지하기 위해 37°C로 데운 멸균 PBS 2-3방울을 노출된 폐 조직에 부드럽게 바릅니다.
- 작은 컷아웃이 있는 멸균 알루미늄 호일 조각을 마우스 위에 놓습니다. 노출된 폐 조직 바로 위에 컷아웃을 배치하고 흉부의 열린 부분과 몇 밀리미터의 주변 연조직 및 피부만 노출되도록 크기를 조정하여 노출된 폐만 광변환되도록 합니다.
- 마우스와 알루미늄 호일 위에 컷아웃이 있는 상자를 놓습니다. 컷아웃이 노출된 폐 바로 위에 있는지 확인하십시오.
- 광변환 램프를 상자의 컷아웃 바로 위에 놓습니다(그림 1F).
- 광변환 램프를 켜고 노출된 폐 조직을 6분 동안 계속 비추십시오.
알림: 인공호흡기의 생리학적 모니터링 프로그램을 사용하여 마우스의 활력 징후를 모니터링합니다. - 광변환 후 램프를 끄고 마우스에서 램프, 상자 및 알루미늄 호일 마스크를 제거합니다.
4. 흉벽 봉합 절차
- 2.13단계를 반복하여 흉벽에서 폐를 분리합니다.
- 견인기 손잡이를 조심스럽게 잡고 꽉 쥐어 블레이드를 닫습니다.
- 닫힌 견인기를 늑간 공간 밖으로 밀어내고 폐 조직을 만지지 않도록 주의합니다.
- 5-0 실크 봉합사를 사용하여 절개 부위 양쪽에 갈비뼈를 통합하는 간단한 연속 봉합사 패턴으로 늑간 절개 부위를 봉합합니다(그림 1G). 봉합사를 단단히 당겨 상처 가장자리가 정립되도록 하고 흉벽의 무결성을 다시 설정합니다(그림 1H). 늑간 근육이 찢어질 수 있으므로 봉합사를 과도하게 조이지 않도록 주의하십시오.
- 봉합사의 양쪽 끝을 4번 매듭을 지어 봉합사를 고정합니다. 봉합사 꼬리를 가능한 한 매듭에 가깝게 자릅니다.
- 수술용 스테이플로 피부를 닫으십시오.
- 28G 바늘이 부착된 1mL 인슐린 주사기로 흉강에서 과도한 공기를 제거합니다. 시포이드 돌기를 촉각적으로 찾고 바늘을 바로 아래에 삽입하고 왼쪽 어깨 쪽으로 전진하여 횡격막을 통해 흉강으로 들어갑니다. 주사기를 ~1mL로 다시 뺍니다. 마우스에서 바늘을 제거하고 주사기에서 공기를 배출합니다. 이 과정을 3-4회 반복합니다.
알림: 내부 장기에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오. 또한 더 큰 부피의 주사기를 사용하여 한 번에 모든 공기를 제거하려고 하는 것보다 1mL 주사기를 사용하고 절차를 3-4회 반복하는 것이 중요합니다. 더 큰 부피의 주사기를 사용하면 흉강의 진공이 너무 커져 폐 조직이 팽창하고 손상될 수 있습니다. - 이소플루란을 끕니다.
- 쥐가 깨어날 기미가 보일 때까지 100% 산소로 환기를 계속하십시오.
- 쥐가 깨어날 기미가 보이면 인공호흡기에서 삽관 카테터를 분리하고 주변의 봉합사를 자른 다음 쥐를 발관합니다.
- 마우스의 테이프를 풀고 열 램프 아래 ~2피트에 위치한 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오. 쥐가 호흡 곤란이나 움직임 부족의 징후를 보이면 5% 이소플루란으로 5분 동안 마취하고, 발가락을 꼬집을 때 반사 신경이 사라지는 것을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시킵니다.
- 쥐가 마취에서 완전히 깨어나 움직이기 시작하면 부프레노르핀 0.1mg/kg을 추가로 준비하고 수술 후 진통을 위해 피하 주사합니다.
- 수술 후에는 쥐가 개별적으로 수용되었는지 확인하십시오. 식수에 항생제(엔로플록사신, 최종 농도 0.4mg/mL)를 제공합니다.
- 수술 후 3일 동안은 하루에 두 번 마우스에 통증의 징후가 있는지 확인하십시오. 통증 관리를 위해 4-6시간마다 0.1mg/kg 부프레노르핀(0.03mg/mL)을 피하 투여합니다. 쥐가 감염, 부동성 또는 호흡 곤란의 징후를 보이면 안락사시킵니다. 3일째 이후에는 하루에 한 번 마우스를 확인할 수 있습니다.
5. 시료 처리 및 조직 투명화를 이용한 광변환 세포 검출
- 광전환 수술 후 3 내지 5일(또는 원하는 기간) 사이에, 마우스를 5% 이소플루란으로 마취하고, 유도 후 이소플루란을 5%에서 2.5%로 감소시키고, 발가락 꼬집음 시 반사의 손실을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 10mL의 실온 PBS로 말단 심경 관류를 수행한 후, 앞서 설명한 바와 같이 4% 파라포름알데히드 10mL를 4°C로 냉각시킨다31.
- 관심 장기를 수집하고 앞서 설명한 대로 광학적으로 투명하게 합니다31.
- 앞서 설명한 대로 광시트 현미경으로 투명화된 조직을 이미지화합니다31. 또는 투명화된 조직을 유리 바닥 접시에 넣고 FITC 및 TRITC 채널의 이미지를 배치하여 컨포칼, 회전 디스크 또는 다광자 현미경을 사용하여 녹색(비광변환) 및 적색(광변환) 세포를 시각화합니다.
6. 시료 처리 및 조직 분해를 이용한 광변환 세포 검출
- 5분 동안 5% 이소플루란으로 마우스를 마취하고, 발가락 꼬집음 시 반사 손실을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 광변환 후 3-5일 후에 자궁 경부 탈구를 통해 희생합니다.
- 앞서 설명한 대로 관심 기관을 수집하고 소화합니다13.
- 소화된 조직을 도금하고 인큐베이터에 넣어 앞서 설명한 대로 하룻밤 동안 부착합니다13.
- 다음 날, FITC 및 TRITC 채널에서 도금된 세포를 이미지화하여 앞서 설명한 대로 녹색(비광변환) 및 적색(광변환) 세포를 시각화합니다13.
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Representative Results
이 프로토콜에 설명된 수술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 간단히 말해서 쥐를 마취하고 왼쪽 흉부에서 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 마우스를 삽관하고 환기시켜 흉강이 열려 있는 동안 마우스가 산소를 공급받을 수 있도록 합니다. 흉곽을 노출시키기 위해 연조직을 제거하고 6번째 또는 7번째 늑간근을 절개합니다. 늑간 틈새에 견인기를 삽입하고 방출하여 인접한 갈비뼈를 벌리고 왼쪽 폐와 그 위에 광전환 가능한 전이를 노출시킵니다. 그런 다음 폐와 전이를 청색광에 노출시켜 노출된 병변을 광변환합니다. 광변환 후 견인기를 제거하고 갈비뼈를 다시 봉합하고 그 위에 놓인 피부를 닫습니다. 마지막으로, 흉강에서 과도한 공기를 제거하여 폐에 가해지는 압력을 완화하고 쥐가 독립적이고 자발적인 호흡을 재개할 수 있도록 합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 다양한 광전환성/광전환성 단백질에 적용할 수 있습니다. 광변환된 세포가 광변환된 채널에서 최대 형광 강도에 도달하도록 하면 다른 장기에서 쉽게 식별할 수 있습니다. 광변환 후 최대 형광 강도를 달성하는 데 필요한 조건은 사용되는 광변환 가능한 단백질 및 광변환에 사용되는 빛의 강도와 같은 실험의 다른 측면에 따라 달라질 수 있으므로 경험적으로 결정해야 합니다. 그림 2B,C는 생체 외 샘플에서 청색광에 노출되는 지속 시간의 함수로서 FITC(비광변환) 및 TRITC(광변환) 채널 모두에서 형광 강도가 어떻게 변했는지 보여줍니다. 우리는 청색광에 6분 동안 노출되면 광변환 채널에서 가장 밝은 신호가 생성되고 추가 노출이 광표백으로 이어진다는 것을 확인했습니다. 그런 다음 생체 내에서 6분 동안 청색광에 노출되기 전과 후의 두 채널에서 형광 강도를 측정하여 유사한 결과를 얻었습니다(그림 2D).
다음으로, 광변환 램프를 켠 상태(실험군)와 그렇지 않은(대조군) 이 수술을 받은 마우스에서 뇌, 간 및 광변환되지 않은 우폐를 채취했습니다. 조직을 앞서 기술한바와 같이 광학적으로 투명화하고, 유리 바닥 접시에 놓고, 25x 1.0 NA 대물 렌즈 및 880nm의 여기 파장을 사용하여 맞춤형 다광자 현미경(32 )에서 이미징하였다. 형광은 각각 대역 통과 필터 525/35 nm 및 580/60 nm를 사용하여 녹색 및 적색 채널에 대해 캡처되었습니다. 광변환 세포와 비광변환 세포는 청색광에 노출된 상태에서 수술을 받은 마우스의 세 가지 조직 유형 모두에서 명확하게 식별될 수 있었습니다(그림 3). 예상했던 대로, 청색광에 노출되지 않고 수술을 받은 쥐의 조직에서는 광전환되지 않은 종양 세포만 발견되었습니다.
그림 1: 폐 광전환 수술을 위한 수술 프로토콜의 개요. (A) 제모된 마우스를 수술 단계에 놓고 제자리에 테이프로 붙입니다. (B) 흉곽 위의 피부와 연조직을 10mm 원형으로 청소합니다. (C) 뭉툭한 미세 해부 가위로 늑간 근육의 초기 침입. (D) 10mm 늑간 절개부에 삽입된 폐쇄형 견인기. (E) 폐 조직을 노출시키는 개방형 견인기. (F) 광변환 램프는 마우스의 열린 흉부 바로 위에 있습니다. (G) 늑간 절개 양쪽에 갈비뼈를 통합하는 단순 연속 봉합. (H) 흉벽 무결성을 재건하기 위해 봉합사를 조이고 고정합니다. (I) 흉강에서 공기 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광변환 채널에서 피크 형광 강도를 달성하는 데 필요한 조건 결정. (A) 광시야 조명이 있는 FITC(3) 및 TRITC 채널(4)에서 필터 없이 실내 조명에서 저배율(1) 및 고배율(2)에서 청색광에 노출되기 전에 노출된 Dendra2 발현 폐 전이의 대표 이미지. (B) 청색광 노출 전과 청색광 노출 2분, 4분, 6분, 8분 후의 Dendra2 발현 폐 전이의 형광 이미지, 생체 외. (C) Dendra2 발현 폐 전이의 정규화된 평균 형광 강도는 생체 외에서 청색광에 노출된 기간의 함수입니다. (D) 생체 내에서 청색광에 노출된 후 6분 전후에 Dendra2 발현 폐 전이의 정규화된 평균 형광 강도. 스케일 바 = 2mm(A), 400μm(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 광변환 수술을 받은 마우스의 반대쪽 폐, 뇌 및 간에서 발견된 광변환(윗줄) 및 비광변환된(아랫줄) 종양 세포의 대표 이미지. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 맞춤형 400nm LED 어레이 램프.(A) 꺼짐 및 (B) 켜짐. CF = 냉각 팬, R = 리플렉터, LED = 고출력 400nm LED. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에서는 폐에서 종양 세포의 선택적 광변환을 위한 수술 프로토콜을 설명합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 폐의 종양 세포를 선택적으로 표시하고 나중에 전신에서 종양 세포를 재식별하여 폐 전이에서 전이 연구를 용이하게 함으로써 그 운명을 추적할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 광변환 수술을 받은 마우스의 뇌, 간 및 광변환되지 않은 오른쪽 폐에서 광전환 세포를 시각화할 수 있었으며, 이는 이러한 세포가 광변환된 폐 전이에서 이러한 3차 부위로 재분해되었음을 나타냅니다. 광변환을 거치지 않은 쥐의 장기에서는 적혈구가 발견되지 않았는데, 이는 세포의 자연적인 자가형광이 광전환된 종양 세포와 혼동될 만큼 밝지 않다는 것을 나타낸다.
실험의 특정 측면에 세심한 주의를 기울이면 이 절차의 성공률을 높일 수 있습니다. 첫째, 폐 전이를 생성할 때 전이 생성 및 광전환/광전환 가능한 단백질에 대한 프로토콜을 고려해야 합니다. 일부 형광 단백질은 면역원성 33,34,35,36인 것으로 보고되었습니다. 따라서, 이러한 단백질을 발현하는 암세포는 면역능력이 있는 마우스에서 자발적으로 전이되지 않을 수 있다. 실제로, 우리는 6DT1-Dendra2 세포의 orthotopic 주입시 syngeneic, immunocompetent (FVB) 마우스와 immunocompromised (Rag2-/-) 마우스 모두에서 원발성 종양이 형성되는 것을 관찰했습니다. 그러나 전이는 Rag2-/- 마우스에서만 발생했으며, 이는 Dendra2가 어느 정도 면역원성일 수 있음을 나타냅니다. 폐 전이를 생성하기 위해 형광 단백질의 잠재적 면역원성을 극복하는 방법은, 면역저하된 마우스를 사용하는 것, 꼬리 정맥 주입을 통해 전이를 생성하는 것, 다른 광전환가능/광전환가능 단백질을 사용하는 것, 또는 광전환가능/광전환가능 단백질이 유전적으로 암호화되어 마우스가 단백질에 대해 내성화되도록 하는 형질전환 동물을 사용하는 것을 포함한다37. 광변환 채널에서 형광 신호의 강도와 안정성도 고려해야 합니다. 많은 광변환/광전환 가능 단백질의 경우, 단백질이 세포 분열로 분해되고 희석됨에 따라 광변환 채널의 신호는 시간이 지남에 따라 감소합니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 광변환 된 H2B 결합 Dendra2가 분열 세포에서 7 일, 비 분열 세포에서 16 일 동안 안정적으로 검출 될 수 있음을 보여주었습니다38,39. 광전환 가능한 단백질을 회전율이 낮은 단백질에 연결하면 광전환 신호의 반감기를 연장할 수 있습니다. 폐 전이 모델의 문제를 해결하는 방법은 연구 목적과 사용 중인 암세포 유형에 따라 달라져야 합니다.
둘째, 관심 질환 모델에 따라 수술 시기를 적절하게 맞추는 것이 중요합니다. 빠르게 성장하는 폐 전이가 있는 질병 모델을 연구하는 사람들은 마우스가 종양 부담에 너무 압도되어 수술 후 회복 및/또는 수술 후 원하는 시간 동안 생존하기 전에 수술을 수행할 수 있는 제한된 기간을 가질 수 있습니다. 질병 모델 타임라인에 대한 철저한 이해와 마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 같은 비침습적 이미징 전략의 사용은 이 절차의 타이밍을 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다.
셋째, 연조직 제거 중 주요 혈관을 부주의하게 절단하면 과다 출혈이 발생하여 수술 부위의 시야가 나빠지거나 앞서 설명한 바와 같이 출혈이 발생할 수 있다(40). 수술 중 주요 혈관을 피하고 소작 펜을 사용하면 이를 예방할 수 있습니다. 넷째, 견인기를 삽입하고 제거할 때 견인기 날을 항상 흉벽과 평행하게 유지하는 것이 중요합니다. 칼날을 폐 쪽으로 비스듬히 기울이면 폐 손상의 위험이 높아지고, 흉벽 쪽으로 칼날을 비스듬히 기울이면 다른 부위의 흉벽을 뚫을 위험이 높아집니다. 견인기를 평행하게 삽입하거나 제거하는 것이 불가능해 보이면 뭉툭한 가장자리 미세 절개 가위를 사용하여 견인기를 다시 삽입/제거하기 전에 늑간 절개 길이를 약간 늘릴 수 있습니다. 마지막으로, 수술이 끝날 때 흉곽이 완전히 다시 밀봉되도록 주의를 기울여야 합니다. 갈비뼈를 다시 봉합할 때 절개 시작 ~1mm 전에 봉합을 시작하고 ~1mm 후에 끝내야 합니다. 이렇게 하면 절개 끝에 남은 구멍을 방지하는 데 도움이 됩니다. 또한 갈비뼈 사이의 공간을 없애기 위해 봉합사를 충분히 당기고 묶되 봉합사가 인접한 늑간 근육을 찢고 추가 균열을 만들 정도로 꽉 조이지 않도록 주의하십시오. 흉강을 다시 봉합할 수 없는 경우, 기계적 환기가 중단되면 마우스가 큰 어려움을 겪거나 스스로 숨을 쉴 수 없게 되므로 수술 중에 마우스를 인도적으로 희생시켜야 합니다.
광원과 광변환의 정확한 방법은 실험실마다 다를 수 있습니다. 모델에 안전하고 일관되며 적합한 모든 광원과 방법론을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 광변환은 마우스를 노출된 폐 상에 광변환에 필요한 파장 및 강도의 빛을 비출 수 있는 입체경 또는 다른 현미경으로 전달함으로써 수행될 수 있다. Dendra2 발현 폐 전이를 광변환하기 위해 최고 강도로 설정된 맞춤형 400nm 발광 다이오드 어레이 램프를 사용합니다(보충 그림 S1). 마우스 위의 램프를 지지하고 램프가 각 마우스 위의 동일한 거리에 배치되도록 상단이 열린 판지 상자 바닥에 6.5 x 6.5cm의 구멍을 자릅니다(18.4cm(L) x 13.2cm(W) x 7.3cm(H)). 상자를 마우스 위에 거꾸로 놓고 8.5 x 8.5cm 램프를 6.5 x 6.5cm 컷아웃(그림 1F) 위에 올려 램프가 지지되고 청색광이 노출된 폐 조직에 도달할 수 있도록 합니다.
수술 및 마취제의 사용을 포함하는 이 프로토콜의 일부 측면은 종양 세포의 확산 동역학 및 용량을 변화시킬 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다(41,42,43,44). 따라서 결과가 절차로 인해 혼동되지 않도록 적절한 제어를 사용해야 합니다.
이 기술의 주요 한계는 폐의 노출된 부분의 전이만 광변환을 거친다는 것입니다. 따라서 폐에서 재분해되는 모든 종양 세포가 광전환되는 것은 아니며 재분해된 세포의 정량화는 상대적입니다. 이러한 한계에도 불구하고 이 기술은 종양 세포 재확산의 발생 여부와 시기, 촉진 또는 예방, 재확산 세포의 유기 영양성을 결정하는 것을 포함하여 종양 세포 재확산에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리가 아는 한, 이것은 폐에 있는 종양 세포의 선택적 마킹 및 운명 추적을 가능하게 하는 최초의 기술입니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 게놈 분석 없이 종양 세포 재확산 및 전이-전이 파종 연구를 촉진하고 향상시키는 데 사용할 수 있는 새로운 기술을 설명합니다. 폐 전이를 표적으로 삼는 이 시술은 대부분의 주요 암 유형을 연구하는 전이 연구자에게 유용하고 관련성이 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(S10RR029545)에 도움을 준 Wade Koba, 현미경 검사에 대한 교육과 지원을 제공한 Analytical Imaging Facility의 Vera DesMarais 및 Hillary Guzik, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute(P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, 암 연구를 위한 통합 이미징 프로그램, Henry Wellcome 경 박사후 연구원(221647/Z/20/Z) 및 METAvivor 경력 개발 상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
