Summary
قياس التنفس بقياس الكولوم مثالي لقياس معدل الأيض للكائنات الحية الدقيقة. عند تكييفه مع ذبابة الفاكهة الميلانية في الدراسة الحالية ، كان استهلاك O2 المقاس ضمن النطاق الذي تم الإبلاغ عنه للنوع البري D. melanogaster من خلال الدراسات السابقة. كان استهلاك O2 لكل ذبابة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر حجما وأقل نشاطا ، أقل بكثير من النوع البري.
Abstract
قياس التنفس الدقيق للكولوم هو طريقة مباشرة وغير مكلفة لقياس استهلاك O2 للكائنات الحية الصغيرة مع الحفاظ على بيئة مستقرة. يتكون مقياس التنفس المجهري الكولوم من غرفة محكمة الإغلاق يتم فيها استهلاك O 2 ويتم إزالة CO2 الذي ينتجه الكائن الحي بواسطة وسيط ماص. يؤدي انخفاض الضغط الناتج إلى إنتاج O 2 كهربائيا ، ويتم قياس كمية O2 المنتجة عن طريق تسجيل كمية الشحنة المستخدمة لتوليدها. في هذه الدراسة ، تم تكييف الطريقة مع ذبابة الفاكهة الميلانية التي تم اختبارها في مجموعات صغيرة ، مع حساسية الجهاز والظروف البيئية المحسنة لتحقيق ثبات عالي. تتوافق كمية O2 التي يستهلكها الذباب البري في هذا الجهاز مع تلك التي تم قياسها بواسطة الدراسات السابقة. لم يكن استهلاك O2 الخاص بالكتلة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر ومعروفة بأنها أقل نشاطا ، مختلفا عن الضوابط المتجانسة. ومع ذلك ، أدى صغر حجم طفرات CASK إلى انخفاض كبير في استهلاك O2 على أساس كل ذبابة. لذلك ، فإن مقياس التنفس الدقيق قادر على قياس استهلاك O2 في D. melanogaster ، ويمكنه التمييز بين الاختلافات المتواضعة بين الأنماط الجينية ، ويضيف أداة متعددة الاستخدامات لقياس معدلات الأيض.
Introduction
القدرة على قياس معدل الأيض أمر بالغ الأهمية لفهم كامل للكائن الحي في سياقه البيئي. على سبيل المثال ، من الضروري قياس معدل الأيض من أجل فهم دوره في العمر1 ، أو دور النظام الغذائي في التمثيل الغذائي2 ، أو عتبة الإجهاد نقص الأكسجين3.
هناك طريقتان عامتان لقياس معدل الأيض4. يقيس القياس الحراري المباشر إنفاق الطاقة مباشرة عن طريق قياس إنتاج الحرارة. يقيس القياس الحراري غير المباشر إنتاج الطاقة من خلال وسائل أخرى ، غالبا عن طريق القياس التنفسي لاستهلاك O2 (VO2) أو إنتاج CO2 أو كليهما. على الرغم من تطبيق القياس الحراري المباشر على الحرارة الخارجية الصغيرة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر5 ، إلا أن قياس التنفس أبسط تقنيا وأكثر استخداما.
تم استخدام عدة أشكال من قياس التنفس بنجاح لقياس معدل الأيض في النوع البري والمتحولة D. melanogaster وقدمت نظرة ثاقبة للتأثيرات الأيضية لدرجة الحرارة6 ، والبيئة الاجتماعية 3 ، والنظام الغذائي3،7 ، واضطرابات النمو العصبي8. تنقسم هذه إلى فئتين ، والتي تختلف اختلافا كبيرا في التكلفة والتعقيد. قياس الضغط هو أبسط وأقل تكلفة 9,10 ، حيث يتم وضع الذباب في غرفة مغلقة تحتوي على مادة ماصة CO2 والتي ترتبط عبر شعرية رقيقة بخزان السوائل. عندما يتم استهلاك O2 وامتصاص CO2 ، ينخفض الضغط في الغرفة ويتم سحب السائل إلى الشعيرات الدموية. ومن ثم، فإن حجم الشعيرات الدموية المملوء بالسائل يتناسب مع VO2. كما تم استخدام إصدارات أكثر تفصيلا ، والتي تعوض عن القوة التي يمارسها السائل في الشعيرات الدموية ، على D. melanogaster1. يتميز قياس الضغط بكونه بسيطا وغير مكلف ، ولكن لأنه حساس للضغط ، يتطلب ظروفا بيئية ثابتة. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم استبدال O2 المستهلك ، فإن الضغط الجزئي ل O2 (PO2) ينخفض تدريجيا داخل الغرف.
كما يستخدم قياس التنفس باستخدام تحليل الغاز بانتظام ل D. melanogaster. في هذه الحالة ، يتم أخذ عينات من الغازات على فترات منتظمة من غرف محكمة الغلق تحتوي على الذباب وإرسالها إلى محلل الأشعة تحت الحمراء2،6،11. يتميز هذا النوع من الأجهزة بمزايا أنه متاح تجاريا ، وهو أقل حساسية للظروف البيئية ، ويتم تحديث الغازات أثناء أخذ العينات بحيث يظل PO2 مستقرا. ومع ذلك ، يمكن أن تكون المعدات باهظة الثمن ومعقدة للعمل.
يوفر مقياس التنفس المجهري12 الكولومتري الذي تم تطويره مؤخرا بديلا غير مكلف وحساس ومستقر للأنظمة الحالية. في الممارسة العملية ، يتم وضع الكائن الحي في غرفة محكمة الإغلاق حيث يستهلك O2 ويتم إزالة ثاني أكسيد الكربون الزفير2 بواسطة مادة ماصة ، مما يؤدي إلى انخفاض صاف في ضغط الغرفة. عندما ينخفض الضغط الداخلي إلى عتبة محددة مسبقا (ON-bit) ، يتم تمرير التيار عبر مولد O2 كهربائيا ، مما يعيد الضغط إلى عتبة ثانية (عتبة OFF) توقف التحليل الكهربائي. يتناسب نقل الشحنة عبر مولد O 2 طرديا مع كمية O 2 المطلوبة لإعادة ضغط الغرفة وبالتالي يمكن استخدامه لقياس O2 الذي يستهلكه الكائن الحي4. الطريقة حساسة للغاية ، وتقيس V O2 بدقة ، ويمكن للاستبدال المنتظم ل O2 الحفاظ على PO2 عند مستوى ثابت تقريبا لساعات أو أيام.
يستخدم مقياس التنفس المجهري الكولوم المستخدم في هذه الدراسة مستشعرا إلكترونيا متعدد الوسائط (الضغط ودرجة الحرارة والرطوبة). يتم تشغيل المستشعر بواسطة متحكم دقيق يكتشف التغيرات الصغيرة في الضغط وينشط جيل O2 عند الوصول إلى عتبة الضغط المنخفض12. يتم تجميع هذا الجهاز من خارج أجزاء الرف ، ويمكن استخدامه مع مجموعة متنوعة من الغرف والبيئات التجريبية ، وقد تم استخدامه بنجاح لفحص تأثيرات كتلة الجسم ودرجة الحرارة على خنفساء Tenebrio molitor. في الدراسة الحالية ، تم تكييف مقياس التنفس الدقيق لقياس استهلاك O2 في D. melanogaster ، الذي يحتوي على ما يقرب من 1 ٪ من كتلة T. molitor. تمت زيادة حساسية الجهاز عن طريق تقليل عتبة تنشيط جيلO 2 ، وتم تعزيز الاستقرار البيئي من خلال إجراء تجارب في حمام مائي يتم التحكم في درجة حرارته والحفاظ على الرطوبة داخل الغرف عند أو بالقرب من 100٪.
بروتين CASK (بروتين سيرين كيناز المعتمد على الكالمودولين) ، وهو جزء من عائلة كينازات غوانيلات المرتبطة بالغشاء (MAGUK) ، هو سقالة جزيئية في مجمعات متعددة البروتينات مختلفة ، وترتبط الطفرات في CASK باضطرابات النمو العصبي لدى البشر وفي D. melanogaster13,14. متحولة D. melanogaster قابلة للحياة ، CASKΔ18 ، تعطل نشاط الخلايا العصبية الدوبامينية 15 وتقلل من مستويات النشاط بأكثر من 50٪ مقارنة بالضوابط الخلقية14,16. بسبب انخفاض مستويات نشاط طفرات CASK ودور الكاتيكولامينات في تنظيم عملية التمثيل الغذائي17 افترضنا أن معدل الأيض القياسي ، وبالتالي استهلاك O2 ، سينخفض بشكل كبير مقارنة بالضوابط.
تم قياس استهلاك O2 في CASKΔ18 ومتجانساتها البرية ، w (ex33). تم وضع مجموعات من الذباب في غرف قياس التنفس ، وتم قياس استهلاك O 2 ، وتم حساب استهلاك O2 والتعبير عنه على أساس الكتلة الخاصة ولكل ذبابة. سجل الجهاز VO2 في الذباب البري الذي كان متسقا مع الدراسات السابقة ، ويمكن أن يفرق بين استهلاك O2 لكل ذبابة من النوع البري والذباب الطافر CASK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الذباب والجمع
- الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية في قوارير ضيقة تحتوي على طعام ذبابة الفاكهة القياسية.
ملاحظة: يجب أن يشتمل حجم العينة لكل نمط وراثي على تسع نسخ متماثلة على الأقل ، تتكون كل منها من غرفة قياس تنفس واحدة تحتوي على 15-25 ذبابة ، تم إعدادها على النحو المبين أدناه. - نقل الذباب كل 2-3 أيام.
- تخدير الذباب باستخدام CO2 ، وجمع مجموعات من 15-25 ذكرا من كل نمط وراثي ، ووضع كل مجموعة في قوارير طعام طازجة غير مخبوزة.
ملاحظة: تم استخدام الذكور لتقليل التباين بسبب الحالة الإنجابية. تنطبق الطريقة على كلا الجنسين. - اسمح للذباب بالتعافي عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
ملاحظة: بحلول وقت التجربة ، يجب أن يكون عمر الذباب 1-4 أيام. يمكن ضبط وتيرة المجموعات الموضحة في الخطوة 1.3 لتضييق النطاق العمري للذباب.
2. إعداد وتجميع غرفة مقياس التنفس
- قم بتشغيل الحمام المائي واضبطه على درجة الحرارة المطلوبة للتجربة.
ملاحظة: أجريت التجارب أدناه عند 25 درجة مئوية باستخدام أنابيب شلينك سعة 50 مل كغرف. يجب تجميع المكونات كما هو موضح في الأشكال 1 أ و 1 ب و 1 ج. - نظف الوصلات الزجاجية الأرضية للغرف ومقابس المستشعر جيدا عن طريق رش 70٪ من الإيثانول على منديل المختبر (وليس مباشرة على المفصل) ومسح الغبار والشحوم القديمة من قابس المستشعر (الشكل 1 أ). امسح الإيثانول بمسح مختبر جديد.
- ضع قطعة 1 سم من لفائف القطن المنقوعة في الماء النقي في قاع الحجرة لتثبيت الرطوبة.
- أضف كمية كافية من الماء (~ 0.5 مل) لتشكيل بركة صغيرة في الجزء السفلي من لفة القطن.
- امسح أي ماء انسكب على مفصل الغرفة.
- انقل الذباب إلى أنابيب البولي بروبلين الموسومة باستخدام قمع.
- قم بتوصيل الأنبوب بلفافة قطنية.
ملاحظة: تتكون الأنابيب من أنبوب اختبار بولي بروبيلين سعة 5 مل ، مشذب إلى 5.5 سم في الطول ومثقوب بسكين ساخن للسماح بالتبادل الحر للهواء مع غرفة التجربة. من المعروف أن تخدير CO2 يسبب تشوهات التمثيل الغذائي ، لذلك يتم نقل الذباب بدون تخدير مما يتطلب مزيدا من العناية لتجنب فقدان الذباب.
- قم بتوصيل الأنبوب بلفافة قطنية.
- أضف أنبوبا واحدا جيد التهوية مع الذباب في كل حجرة لقياس التنفس (فوق القطن المبلل).
- املأ خراطيش جير الصودا (4-5 كريات لكل أنبوب) وضعها في الجزء العلوي من الأنبوب الذي يحتوي على الذباب داخل الغرفة.
ملاحظة: تتكون خراطيش الجير الصودا من أنابيب طرد مركزي سعة 800 ميكرولتر مثقبة 4-5 مرات باستخدام مثقاب كهربائي. - املأ مولدات O2 بمحلول كبريتات النحاس المشبع (CuSO4) تحت مستوى فتحات التهوية
ملاحظة: تتكون مولدات O2 من أنابيب طرد مركزي ذات غطاء لولبي مع 4 ثقوب محفورة أسفل الخيوط. يتم لحام أقطاب البلاتين (Pt) والنحاس (Cu) بموصل ثنائي السنون ، ويتم إدخالها في ثقوب محفورة في الغطاء ، ويتم لصقها بالإيبوكسي. يولد التحليل الكهربائي ل CuSO4 O2 الذي يستهلكه الكائن التجريبي. CuSO4 سام لللافقاريات ، وتجنب الانسكابات أو التسرب ونظف على الفور. - قم بتوصيل مولد O2 المملوء بموصل ثنائي السنون على قابس المستشعر.
ملاحظة: يجب أن يتصل الكاثود النحاسي بالإخراج السالب لوحدة التحكم وأنود البلاتين بالسلك الموجب. ستؤدي الاتصالات المعكوسة إلى فشل التجربة. - ضع قطعتين صغيرتين من شحم السيليكون الشفاف على جوانب متقابلة من المفصل الزجاجي الأرضي لقابس المستشعر.
- أدخل القابس في الحجرة وقم بتدوير القابس (أو الحجرة) بضغط معتدل لنشر الشحوم في المفصل.
- امسح الشحوم الزائدة بمسح المختبر.
- قم بتثبيت مثبتات Keck البلاستيكية على المفاصل لتثبيت المقابس في الغرف. يجب أن تبدو الغرفة المجمعة مثل الشكل 1C.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لعدد الغرف المستخدمة لتجربة اليوم.
ملاحظة: عدد الغرف التي يمكن تسجيلها محدود بعدد الغرف ووحدات التحكم ومدخلات USB المتوفرة على الكمبيوتر. بالنسبة للتجارب الحالية ، تم تشغيل سبع غرف بشكل متواز. يجب مطابقة الذباب التجريبي مثل الطفرات مع الضوابط المناسبة. يجب تضمين غرفة تم إنشاؤها بشكل مماثل ولكن بدون ذباب في كل تجربة كعنصر تحكم في التباين البيئي. يجب تدوير الغرف التي تحتوي على علاجات مختلفة (متحولة ، برية ، حظر طيران) بين التجارب. - ضع الغرف المجمعة في رف في حمام مائي مع فتح محبس (الشكل 1E).
ملاحظة: لتجنب اختلاف الساعة البيولوجية ، تم وضع الغرف في الحمام بين الساعة 9:30 و 9:50 صباحا لجميع التجارب الموضحة هنا. - اترك محبس الإغلاق مفتوحا (حافظ على المقبض موازيا لمحبس المحابس).
ملاحظة: احرص على عدم السماح للماء بدخول المحبس. - اسمح للغرف بالتوازن مع فتح محبس لمدة 30 دقيقة تقريبا.
ملاحظة: أثناء توازن الحجرة ، قم بتوصيل الإلكترونيات وإعداد الحصول على البيانات كما هو موضح أدناه.
3. إعداد وحدات التحكم والكمبيوتر
- تأكد من أن المفاتيح التي تزود مولدات O2 بالتيار في وضع إيقاف التشغيل (بعيدا عن الموصل ؛ الشكل 1 د).
- قم بتوصيل كل صندوق وحدة تحكم بمنفذ ناقل تسلسلي عالمي (USB) متوفر.
ملاحظة: بناء وبرمجة وحدات التحكم الموصوفة في مكان آخر12. - قم بتوصيل وحدات التحكم بغرف مقياس التنفس باستخدام كابلات ذات 6 موصلات.
- تأكد من أن شاشات الصمام الثنائي العضوي الباعث للضوء (OLED) لوحدات التحكم (الشكل 1D) تعرض المعلمات البيئية.
- قم بتشغيل مولدات O2 لفترة وجيزة باستخدام المفتاح الموجود على وحدة التحكم (الشكل 1D).
- إذا زادت القيمة الحالية من صفر إلى ما بين 35 و 55 مللي أمبير ، فإن وحدة التحكم والغرفة جاهزتان للتجارب.
- تحديد منافذ COM التي تستخدمها وحدات التحكم، كما هو موضح أدناه.,
- انقر فوق رمز ابدأ في Microsoft Windows.
- انقر فوق رمز الإعدادات .
- انقر فوق البلوتوث والأجهزة.
- تأكد من ظهور وحدات التحكم ومنافذ COM الخاصة بها في قائمة الأجهزة.
- افتح PuTTY على سطح المكتب وقم بإعداد ملف سجل لكل قناة من مقياس التنفس كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: PuTTY هو عميل shell و telnet آمن مجاني يستخدم لنقل البيانات إلى الكمبيوتر عبر منافذ COM.- حدد منفذ COM لوحدة تحكم عن طريق كتابة رقم المنفذ في مربع "الخط التسلسلي" (الشكل 2A).
- انقر فوق تسجيل.
- حدد الإخراج القابل للطباعة في "تسجيل الجلسة" (الشكل 2 ب).
- ضمن اسم ملف السجل، انقر فوق استعراض.
- في المجلد الذي تختاره ، قم بإنشاء اسم ملف يحتوي على معلومات وصفية (على سبيل المثال ، التاريخ والأنواع ورقم منفذ COM).
- انقر على حفظ.
- انقر فوق فتح. سيتم فتح نافذة تعرض البيانات المحددة بفواصل التي يتم تسجيلها (الشكل 2C).
- كرر ذلك مع جميع وحدات التحكم الأخرى المستخدمة في التجربة. سيظهر الإدخال إلى كل منفذ COM كنافذة منفصلة (الشكل 2D).
4. تشغيل التجارب
- بمجرد توازن الغرف لمدة 30 دقيقة ، قم بإغلاقها عن طريق إغلاق المحبس.
- قم بتغطية الحمام والغرف بصندوق رغوة البوليسترين للحفاظ على بيئة مستقرة.
- السماح لتحقيق التوازن لمدة ساعة أخرى.
- قم بتشغيل التيار إلى مولد O2 لكل غرفة باستخدام المفتاح الموجود في صندوق التحكم.
- بمجرد تنشيط مولدات O2 ، تأكد من زيادة الضغط إلى ضغط إيقاف التشغيل مسبقا.
ملاحظة: تم استخدام 1017 هيكتوباسكال ، وهو أعلى بقليل من الضغط الجوي ، كضغط "OFF" في هذه السلسلة من التجارب. ستشير العودة إلى الضغط المحيط إلى تسرب الغاز من الغرف. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح باستخدام نفس الضغط عبر التجارب بغض النظر عن الضغط الجوي المحيط. كان ضغط "ON" 1016 hPa ، مما يعني أن الضغط يحتاج فقط إلى انخفاض 1 hPa قبل تنشيط مولد O2 . هذا يوفر حساسية كافية لقياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة. بمجرد ضغط الغرفة إلى إعداد "OFF" ، يجب أن ينخفض التيار إلى الصفر. - دع التجربة تستمر لمدة 3 ساعات أو أكثر.
ملاحظة: يمكن أن يسمح ارتفاع VO2 في درجات حرارة مرتفعة بأوقات تجربة أقصر. راقب من حين لآخر للتأكد من أن المعدات تعمل ولكن تجنب النشاط المفرط بالقرب من الغرف التي قد تؤثر على استقرار درجة الحرارة.
5. الانتهاء من التجربة
- قم بإيقاف تشغيل مولدات O2 على جميع وحدات التحكم.
ملاحظة: قم أولا بتجنب تشغيل مولدات O2 أثناء فتح الغرف. - افتح المحبس لفتح الغرف.
- اترك نوافذ PuTTY مفتوحة لمدة 5-15 دقيقة أخرى لتوفير خط أساس نهائي.
- أغلق نافذة PuTTY لكل وحدة تحكم ، مع إنهاء التسجيلات.
ملاحظة: انتهت جميع التجارب بين الساعة 4:50 و 5:10 مساء. - افصل المستشعرات عن الكابلات.
- انقل الغرف إلى الرف الجاف.
- قم بإزالة مقابس المستشعر واحدة تلو الأخرى من الغرف.
- افصل مولدات O2 وضعها في رف الأنبوب.
- امسح الشحوم من قابس المستشعر واحتفظ بها في الحامل.
- تنظيف الشحوم من وصلات الغرفة وإزالة الأنابيب مع الذباب والجير الصودا.
- تخدير الذباب في كل أنبوب باستخدام CO2 ، واضغط على قارب وزن ووزن على ميزان دقيق.
- سجل وزن وعدد الذباب لكل أنبوب.
- تخلص من الذباب أو ضعه جانبا لإجراءات إضافية.
- تفريغ الجير الصودا من الخراطيش في حاوية النفايات.
- افتح مولد O2 وتخلص من محلول CuSO4 في حاوية النفايات.
- شطف الأقطاب الكهربائية والأنبوب بالماء النقي.
- ضع رفوف الأنبوب للتجفيف.
6. تحليل بيانات تحويل الرسوم
- استيراد البيانات كنص مفصول بفواصل إلى جدول بيانات، بحيث يشتمل كل سجل على ورقة عمل منفصلة.
- سجل بيانات التيار والوقت لكل نبضة من مولد O2 . بدءا من النبضة الأولى بعد ضغط الغرفة ، سجل وقت البدء ووقت الانتهاء (كأرقام صفوف) لكل نبضة حالية. هذا هو رقم الصف عندما يتجاوز التيار الصفر (عادة إلى حوالي 45-50 مللي أمبير) إلى الصف الأخير الذي يزيد عن الصفر.
- قم بعمل جدول على ورقة العمل لتسجيل البيانات التالية:
- متوسط سعة التيار أثناء النبضة: = AVERAGE ([الصف الأول من النبض]: [الصف الأخير من النبضة]) لكل نبضة (من العمود الحالي).
- مدة النبض: ([الصف الأخير من النبض] - [الصف الأول من النبضة [-صف واحد]])/1000 لكل نبضة (من الوقت بالمللي ثانية العمود).
- إجمالي وقت التجربة: [الوقت في بداية النبضة الأخيرة] - [الوقت في نهاية النبضة الأولى بعد ضغط الغرفة] (من عمود الوقت بالدقائق).
- ثم احسب نقل الشحنة (Q) لكل نبضة (متوسط المدة الحالية X)
- اجمع الشحنة من جميع النبضات لحساب إجمالي الشحن (Qtot).
7. تحليل استهلاك O2
- قم بإعداد جدول بيانات جديد لجميع البيانات وأدخل أو احسب ما يلي لكل غرفة:
- Qtot (إجمالي الرسوم)
- الشامات (= س ÷ 96485 × 4)
- مل O2 (= مول × 22413 مل / مول)
- إجمالي الوقت (من تحليل البيانات أعلاه)
- مل دقيقة -1 (= مل O2 ÷ الوقت الإجمالي)
- الوزن بالجرام (الذباب المخدر ووزنه يقاس بعد التجربة)
- مل دقيقة-1 g-1 (= مل دقيقة-1 وزن ÷ بالجرام)
- مل / ساعة / ز (× أعلاه 60)
- ملغم / ذبابة (= وزن الذباب ÷ عدد الذباب)
- μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ عدد الذباب).
- جدولة البيانات لكل علاج (النمط الجيني ، على سبيل المثال)
- قارن بين العلاجات باستخدام ANOVA أو t-test أو Mann-Whitney u-test 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض الضغط ومخرجات التيار لوحدة التحكم في مقياس التنفس لغرفة واحدة في تجربة واحدة في الشكل 3 أ. ضغطت النبضة الأولى الطويلة الحالية على الغرفة من الضغط المحيط (حوالي 992 هيكتوباسكال) إلى عتبة إيقاف التشغيل المحددة مسبقا البالغة 1017 هيكتوباسكال. عندما استهلك الذباب O 2 وتم امتصاص CO 2 ، انخفض الضغط ببطء حتى وصل إلى عتبة ON البالغة 1016 hPa ، والتي نشطت التيار من خلال مولد O2. في المثال الموضح، متوسط سعة كل نبضة هو 50.1 mA، والمدة 16.1 s، مما ينتج عنه نقل شحنة يبلغ حوالي 0.81 كولوم (C) لكل نبضة. كان إجمالي نقل الرسوم لهذه الغرفة 3.28 درجة مئوية خلال وقت إجمالي قدره 240.0 دقيقة. باستخدام الحسابات الموضحة في الإجراءات مع كتلة وعدد الذباب (23 ذبابة تزن 14.9 مجم إجمالا) ، كان استهلاك O 2 للمجموعة في هذه الغرفة 3.19 مل h-1 g-1 أو 2.07 μL h-1 fly-1.
يمكن إعداد الجهاز بسهولة ، مع الحد الأدنى من التدريب ، ويعمل بشكل موثوق للعديد من دورات التجميع والإغلاق. ومع ذلك ، يجب صيانة المعدات وتفتيشها بانتظام ، ويجب التحكم في الظروف التجريبية بعناية. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي فقدان الختم المحكم ، بسبب فشل المفصل أو المحبس ، إلى دورات ضغط سريعة وارتفاع كبير في VO2 (الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تظل درجة الحرارة والرطوبة مستقرة داخل الغرفة. إذا انخفضت درجة الحرارة أو الرطوبة ، تفسير انخفاض الضغط الناتج بشكل خاطئ على أنه استهلاك O2 . على العكس من ذلك ، فإن الانجراف التصاعدي في درجة الحرارة أو الرطوبة سيقاوم انخفاض الضغط الناجم عن استهلاك O2 ، ويقلل أو يزيل إشارة VO2 بشكل مصطنع (الشكل 3C).
تم استخدام الطريقة لاختبار VO2 من طفرات CASK Δ18 ، والتي تم إنشاؤها عن طريق الاستئصال غير الدقيق لعنصر قابل للنقل من موضع CASK 14 ، والذي يتم فيه تقليل الحركة بشكل كبير14,16. في الضوابط من النوع البري w(ex33)، الناتجة عن الاستئصال الدقيق للعنصر القابل للنقل، كان متوسط استهلاك O2 الخاص بالكتلة 3.65 ± 0.24 mL·g-1·h-1 (n = 16 غرفة; الشكل 4 أ).
على الرغم من انخفاض حركتها بشكل واضح ، كان VO2 من طفرات CASKΔ18 أقل قليلا ولكن ليس بشكل ملحوظ من الضوابط (متوسط ± s.e.m. = 3.23 ± 0.13 mL · g-1 · h-1 ؛ n = 11 مجموعة ؛ P = 0.08 اختبار مان ويتني u).
نظرا لأن صحة التعبير عن معدل الأيض من حيث كتلة الجسم قد تم التشكيك فيها18 ، فقد تم تحليل استهلاك O2 أيضا على أساس كل ذبابة (الشكل 4B). باستخدام هذا التحليل ، تم تقليل VO2 بشكل كبير في CASKΔ18 مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري (ex33: 2.22 ± 0.13 μL · fly-1 · h-1; البرميلΔ18: 1.58 ± 0.10 ميكرولتر · ذبابة -1 · ساعة -1 ؛ P = 0.0003 ، اختبار مان ويتني u). ومع ذلك ، كان متوسط كتلة ذباب CASKΔ18 أقل بنسبة >20٪ من متوسط كتلة الضوابط ex33 (الشكل 4C ؛ ex33 0.61 ± 0.01 mg; برميلΔ18 0.51± 0.02 ملغ. P = 0.0005 ، Mann-Whitney u-test) ، وبالتالي فإن الفرق في معدل الأيض بين الأنماط الجينية ربما يرجع إلى الاختلاف في أحجامها.
الشكل 1: إعداد مقياس التنفس . (أ) رسم تخطيطي لقابس المستشعر (أعلاه) وغرفة 50 مل (تتكون من أنبوب شلينك سعة 50 مل أدناه) قبل التجميع. لاحظ مواقع المفاصل الزجاجية الأرضية 19/22 التي ستربط الغرفة وقابس المستشعر ، والتي يجب تنظيفها قبل كل تجربة. يشار أيضا إلى المحبس ، وهو أمر ضروري لفتح أو ختم الغرفة. (ب) رسم تخطيطي للغرفة والمكونات ، مجمعة وجاهزة للتجربة ، يظهر: لفة قطن مبللة ، أنبوب بولي بروبلين يحتوي على ذباب ، موصول بسدادة قطنية ، خرطوشة صودا جير ، ومولد O2 مملوء ب CuSO4. (ج) صورة فوتوغرافية للغرفة المجمعة. مشبك Keck الذي يثبت القابس بالحجرة محجوب جزئيا بواسطة مشبك الحامل الدائري الذي يحمل الحجرة. (د) صورة لوحدة التحكم تظهر التيار المتحكم في المفتاح من خلال مولد O2 ونافذة لعرض شاشة OLED. (ه) غرف مجمعة في حمام مائي. تظهر سبع غرف ، ثلاثة منها تحتوي على طفرات ، وثلاث مع عناصر تحكم برية ، وغرفة واحدة تحتوي على جميع المكونات باستثناء الذباب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد الحصول على البيانات. (أ) واجهة PuTTY لاختيار المنفذ التسلسلي للحصول على البيانات. تم اختيار COM3 ، بمعدل BAUD 9600 لمطابقة إخراج وحدة التحكم. (ب) واجهة PuTTY لإعداد ملف السجل. يتم تحديد "إخراج قابل للطباعة" لتمكين تسجيل البيانات إلى ملف نصي ، ويتم تحديد مجلد البيانات باستخدام الزر "استعراض" ، ويتم إنشاء اسم ملف. (ج) ملف سجل PuTTY أثناء التجربة. يتم الحصول على البيانات مرتين تقريبا في الثانية ، ويحتوي كل سطر على المعلومات التالية المحددة بفواصل: رقم المستشعر ، والوقت (مللي ثانية) منذ بداية الاستحواذ ، ودرجة حرارة الغرفة (درجة مئوية) ، وضغط الغرفة (hPa) ، والرطوبة (النسبة المئوية النسبية) ، والتيار (mA). (د) تسجيل البيانات أثناء تجربة نموذجية ، مع سبع نوافذ للغرف التجريبية ، بالإضافة إلى قناة واحدة تسجل درجة حرارة الحمام ودرجة حرارة الهواء المحيط والضغط والرطوبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات من مقياس التنفس الصغرى. (أ) الضغط (الخط الرمادي، المحور الأيسر) والتيار عبر مولد O2 (الخط الأسود، المحور الأيمن) في حجرة واحدة لقياس التنفس تحتوي على 23 ذبابة w(ex33). في البداية ، يلزم وجود نبضة تيار طويلة للضغط على الغرفة من ~ 992 هيكتوباسكال إلى عتبة إيقاف 1017 هيكتوباسكال. عندما استهلك الذباب O 2 ، انخفض الضغط حتى وصل إلى عتبة ON البالغة 1016 hPa ، والتي نشطت التيار من خلال مولد O2 ، الذي أعاد ضغط الغرفة إلى 1017 hPa. تكررت العملية ست مرات في هذه التجربة. (ب) مثال على غرفة متسربة ناتجة عن محبس تالف، مأخوذة من سلسلة مختلفة من التجارب. فشلت الغرفة في الحفاظ على الضغط (الخط الرمادي) ، مما أدى إلى دورة مستمرة للتيار الإلكتروليتي (الخط الأسود). لاحظ جدولا زمنيا مختلفا عن اللوحة A. (C) تأثير الانجراف في الرطوبة. O2 كان من المفترض أن ينتج استهلاك خنفساء سيدة 20 مجم (تقارب Hippodamia) في الغرفة نمطا دائريا من الضغط مشابها للشكل 3A ، لكن الزيادة المطردة في الرطوبة (الخط الأسود) تسببت في زيادة مصطنعة في ضغط الغرفة (الخط الرمادي) الذي أخفى VO2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: البيانات الكمية من النوع البري والطافر CASK D. melanogaster. (أ) VO2 خاص بالكتلة للذباب البري (w (ex33)) والطافر (CASKΔ18). في جميع المؤامرات ، تشير قيعان وقمم الصناديق إلى الربعين الأول والثالث ، على التوالي ، وتشير الشعيرات إلى القيم القصوى ، وترد أحجام العينات (عدد الغرف ، كل منها يحتوي على 17-24 ذبابة) بين قوسين فوق الأنماط الوراثية. لا يختلف ذباب CASK Δ18 بشكل إحصائي عن ex33 (الوسيط: ex33: 3.420 mL · g-1 · h-1 ، CASKΔ18: 3.029 mL · g-1 · h-1 ؛ p = 0.08 Mann-Whitney u-test). (ب) ذبابة محددةV O2. استهلك ذبابالبرميل Δ18أقل بكثير من O 2 (متوسط 1.650 مل · ذبابة -1 · ح -1) من w (ex33) (2.078 مل · ذبابة -1 · ح -1 ؛ p = 0.0003 ، اختبار مان ويتني U ؛ تشير الأهمية إلى العلامات النجمية). (C) اختلفت الكتلة بين CASKΔ18 والنمط البري (الوسيط: 0.526 مجم ، ex33: 0.623 مجم ؛ p = 0.0005 ، اختبار مان ويتني u ؛ الدلالة المشار إليها بالعلامات النجمية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. مسح بيانات قياس التنفس ذبابة الفاكهة من الذباب البري عند 25 درجة مئوية. مع استثناء واحد18 ، تقتصر الدراسات على تلك التي تقيس استهلاك O2 . في معظم الحالات ، كان من الضروري تقدير VO2 من الرسوم البيانية ، ويتم توفير أرقام الأرقام من الأوراق الأصلية. على الرغم من أن جميع الأنماط الجينية كانت تعتبر "من النوع البري" ، إلا أن المصادر وطرق الانتشار اختلفت. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوضح الإجراء أعلاه قياس استهلاك O2 في D. Melanogaster باستخدام مقياس التنفس المجهري الكولومتري الإلكتروني. كانت البيانات الناتجة عن استهلاك O2 في D. melanogaster من النوع البري ضمن النطاقات الموصوفة في معظم المنشورات السابقة باستخدام طرق متنوعة (الجدول 1) على الرغم من أنها أقل إلى حد ما من تلك التي أبلغ عنها الآخرون 3,6.
تناولت الخطوات الحاسمة الشرطين المطلقين للطريقة: الختم المحكم والاستقرار البيئي. يعد الحفاظ على بيئة محكمة أمرا بسيطا ولكنه يتطلب عناية. قوارير وأنابيب Schlenk مناسبة بشكل مثالي كغرف قياس التنفس. يتجنب البناء الزجاجي نفاذية الغاز الموجودة في العديد من أنواع البلاستيك19 ، وهو أمر بالغ الأهمية بشكل خاص في التجارب المطولة. تسمح الوصلات القياسية بوصلات محكمة الغلق مع المقابس التي تحتوي على المستشعرات والوصلات الإلكترونية. توفر محبس الإغلاق موانع تسرب موثوقة ويمكن فتحها أو إغلاقها حسب الحاجة أثناء التجارب. لضمان الأختام محكمة الغلق لكل تجربة ، تم فحص محبس ، وتم تنظيف المفاصل جيدا ، وتم تطبيق كميات حكيمة من شحم السيليكون النظيف ، وتم تأمين المفاصل بمشابك Keck.
حساسية الطريقة محدودة باستقرار درجة الحرارة والرطوبة داخل الغرفة. ستؤدي التغييرات في أي من المعلمتين إلى تقلبات الضغط التي تتداخل مع إشارة VO2 . يوفر استخدام الغرفة البيئية12 أو حمام مائي متداول تحكما أكثر استقرارا في درجة الحرارة. وقد أظهرت الأعمال السابقة التي قام بها آخرون أن الطريقة يمكن أن تقيس استهلاك O2 عند مستوى nmol · h-1 عندما تم الحفاظ على درجة الحرارة في حدود ±0.01 درجة مئوية20. لتحقيق الاستقرار في الرطوبة ، حافظت قطع القطن المغمورة في الماء على الرطوبة بنسبة 100٪ تقريبا. تم السماح لدرجة الحرارة والرطوبة بالاستقرار لمدة 90 دقيقة على الأقل قبل ضغط الغرف باستخدام O2 المتولد كهربائيا وبدأت التسجيلات. تضمنت جميع التجارب غرفة واحدة تم تجميعها مع جميع المكونات ولكنها لم تحتوي على ذباب ، من أجل مراقبة الظروف البيئية.
تعمل المراقبة المستمرة لدرجة الحرارة والضغط والرطوبة بانتظام على تبسيط استكشاف الأخطاء وإصلاحها إلى حد كبير. على سبيل المثال ، تم اكتشاف وتصحيح V O2 الظاهر الظاهر بشكل مصطنع الناجم عن محبس تالف (الشكل 3B) أو الخسارة الواضحة ل VO2 بسبب رطوبة الغرفة غير المستقرة (الشكل 3C).
يتميز مقياس التنفس المجهري الكولوم الموصوف هنا بالعديد من المزايا. أولا ، إنه غير مكلف نسبيا ، بتكلفة إجمالية تقريبية تبلغ 100 دولار لكل قناة (تشمل الغرفة والمستشعر ووحدة التحكم). ثانيا ، نظرا لأن كل قناة تحصل على البيانات وتنقلها بشكل مستقل ، فإن النظام قابل للتطوير ، حيث يقتصر عدد الغرف فقط على حجم وحدة التحكم البيئية (حمام مائي أو غرفة بيئية) وعدد منافذ USB المتاحة في الكمبيوتر (قابلة للتوسيع بشكل عام إلى >100). أيضا ، نظرا لأن الغرف وأجهزة التحكم مستقلة ، فإن فشل أي منها لن يؤثر على الآخرين. ثالثا ، يمكن إعادة برمجة وحدات التحكم بسهولة للتكيف مع الضغط المحيط أو لضبط الحساسية حسب الحاجة. فيما يتعلق بهذا ، يتم ضبط الضغط داخل الغرف على قيمة ثابتة ، لذلك سيكون الضغط التجريبي ثابتا عبر التجارب بغض النظر عن الضغط الجوي المحيط. رابعا ، يسمح التدفق المستمر للبيانات المتعلقة بالوقت ودرجة الحرارة والضغط والرطوبة والتيار بتحليل مفصل لهذه المعلمات لكل غرفة ، مما يسهل استكشاف الأخطاء وإصلاحها أو تحليل التغيرات الزمنية في VO2 في تجارب أطول. أخيرا ، يمكن الحفاظ على الظروف البيئية داخل الغرفة عند مستوى ثابت لعدة ساعات أو أيام ، لأنه يتم استبدال O2 المستهلك باستمرار. في الدراسة الحالية ، تذبذب ضغط الغرفة من 1016 إلى 1017 hPa ، وهو أقل من 0.1٪ ، مع اختلاف الناتج في PO2 أقل من 0.5٪. استنادا إلى كمية CuSO4 في كل مولد O 2 ، والذي يمكن أن يولد 28 مل من O2 ، ومتوسط VO2 لمجموعات الذباب في هذه الدراسة ، 1.15 مل / يوم (المتوسط = 21.8 ذباب لكل غرفة)، يمكن دراسة معدل الأيض لمدة تصل إلى 24 يوما في المرة الواحدة. بافتراض أن الذباب قد تم تزويده بالتغذية الكافية ، فهذا يعني أنه يمكن دراسة التمثيل الغذائي بشكل مستمر لمعظم عمر الذبابة.
في الوقت الحاضر ، تستند معظم دراسات التمثيل الغذائي في D. melanogaster على تحليل الغاز أو قياس الضغط. تتميز الطرق التي تعتمد على تحليل الغاز ، مثل مقاييس التنفس بوقف التدفق والتدفق المستمر2،3،6 ، بأن الطريقة راسخة وأن المعدات متاحة تجاريا. ومع ذلك ، فإنها تتطلب معدات باهظة الثمن ومعقدة ، بما في ذلك المشعبات وأجهزة استشعار التدفق الجزيئي لتنظيم التدفق ، وأجهزة تحليل الغاز لقياس تركيزات الغاز. بدلا من ذلك ، فإن أجهزة قياس الضغطالبسيطة 9 أقل تكلفة بكثير. في أبسط أشكالها ، التي يشيع استخدامها ل D. melanogaster ، يتم تخدير الذباب ووضعه في غرفة صغيرة تحتوي على مادة ماصة CO2 والتي يتم توصيلها بخزان سائل بواسطة أنبوب شعري. عندما يتم استهلاك O2 ، ويتم امتصاص CO2 الناتج ، ينخفض الضغط في الغرفة ، مما يسحب السائل إلى الأنبوب الشعري. ثم يتناسب ارتفاع السائل مع كمية O2 المستهلكة. نظرا لعدم استبدال O2 المستهلك أثناء التجربة ، ينخفض PO2 باستمرار على مدار التجربة. على الرغم من أن التجارب الروتينية قد لا تقلل من P O2 بما يكفي للتأثير سلبا على V O2 ، إلا أن التجارب المطولة أو التجارب في درجات حرارة مرتفعة يمكن أن تستنفد O2 وتصل إلى P O2 الحرج الذي ينخفض فيه V O2 بشكل حاد3. هناك مشكلة أخرى وهي أن وزن المائع في الشعيرات الدموية يؤثر بقوة هابطة ، مما يقلل من ارتفاع المائع بما يتناسب مع القوة المؤثرة لأسفل ، مما يؤدي إلى أخطاء محتملة. تم وصف طرق التعويض عن هذا التأثير 4,21 ، ولكنها مرهقة وليست مستخدمة على نطاق واسع. أشارت المقارنة المباشرة لتحليل الغاز وقياس الضغط إلى أن الطريقتين أنتجت نتائج مختلفة بشكل كبير ، لكن المؤلفين لم يتمكنوا من تقديم تفسير مرض للازدواجية22.
على الرغم من مزاياه ، فإن مقياس التنفس المجهري الكولوم له أيضا قيود. أولا ، على عكس بعض أنظمة تحليل الغاز المتوقف ، فهو غير متوفر تجاريا. من السهل الحصول على المكونات وليس التصميم ولا البرمجة معقدة ، ولكن من المحتمل أن يكون البناء أكثر تعقيدا من أنظمة قياس الضغطالبسيطة 9. ثانيا ، يجب أن يتضمن الحصول على بيانات دقيقة دورات متعددة لتوليد O2 ، لذلك يجب أن تستمر كل تجربة لعدة ساعات. وينطبق هذا أيضا على التجارب التي تستخدم قياس الضغط. أخيرا ، مرة أخرى مثل قياس الضغط ، يجب أن تكون درجة الحرارة والرطوبة داخل الغرف مستقرة. ومع ذلك ، فإن مقياس التنفس المجهري الكولوم يوفر أرضية وسطى فيما يتعلق بالتكلفة والتعقيد ، وهو قوي وموثوق به بمجرد تجميعه ، ويقيس استهلاك O2 بدقة.
تظهر التجارب مع طفرات CASKΔ18 نتائج سلبية (VO2 خاصة بالكتلة) ونتائج إيجابية (VO2 خاص بالذباب). إذا كان الانخفاض بنسبة >50٪ في المشي من طفرات CASKΔ18ناتجا عن عملية التمثيل الغذائي للخطر ، فقد يكون من المتوقع أن يتم تقليل VO2 بمقدار مماثل. ومع ذلك ، كان التغيير في استهلاك O2 الخاص بالكتلة متواضعا (انخفاض بنسبة 9.6٪ في متوسط VO2) ، وليس ذا دلالة إحصائية. تتوافق هذه النتيجة السلبية مع طفرات CASKΔ18 التي تتمتع بالتمثيل الغذائي الطبيعي نسبيا ، مع النمط الظاهري السلوكي الناتج عن انخفاض محرك الحركة الحركية. على الرغم من أنه من الممكن أن تفتقر الطريقة إلى الحساسية الكافية ، إلا أن انخفاض VO2 الناجم عن اختلاف صغير نسبيا في الحجم (انخفاض بنسبة 15.5٪ في الكتلة المتوسطة) كان مهما للغاية.
يرتبط المشي بزيادة كبيرة في إنفاق الطاقة 5,23 ، فلماذا يعتبر VO2 طبيعيا نسبيا في طفرات CASK؟ من الممكن أن الاستمالة المفرطة في طفرات CASK16 يمكن أن توازن الانخفاض في المشي ، أو أن النمط الظاهري للمشي يكون أقل وضوحا عندما يتم اختبار الذباب في مجموعات في أنابيب صغيرة ، لكن هذه الفرضيات تنتظر التحقق التجريبي. ومع ذلك ، فإننا نستنتج أن الطفرات في موضع CASK ليس لها تأثيرات قوية ومباشرة على التمثيل الغذائي ، وأن مقياس التنفس المجهري الكولوم هو أداة فعالة لدراسة التمثيل الغذائي في D. melanogaster.
نظرا لأن هذا الجهاز يتم بناؤه بسهولة من المكونات الشائعة ، فإنه يقيس استهلاك O2 بدقة ، وهو محمول للغاية ، ويمكن استخدامه في أي بيئة ذات درجة حرارة ثابتة ، وقد تم استخدامه مع كائنات صغيرة مثل 0.5 ملغ من الذباب (الدراسة الحالية) وكبيرة مثل 500 ملغ من العقارب (DJS غير منشورة) ، فإنه يضيف أداة متعددة الاستخدامات لدراسة التمثيل الغذائي للكائنات الحية المتنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتورة ليندا ريستيفو في جامعة أريزونا على اقتراحها اختبار استهلاك O2 من طفرات CASK ولإرسال طفرات CASK وضوابطها الملائمة. تم توفير رسوم النشر من قبل صندوق إعادة الاستثمار الإداري من قسم الأحياء في جامعة كوليدج بارك. تم توفير المساحة وبعض المعدات من قبل الجامعات في Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
