Summary
La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O2 misurato era all'interno dell'intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O2 per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.
Abstract
La microrespirometria coulometrica è un metodo semplice ed economico per misurare il consumo di O2 di piccoli organismi mantenendo un ambiente stabile. Un microrespirometro coulometrico è costituito da una camera ermetica in cui l'O 2 viene consumato e la CO2 prodotta dall'organismo viene rimossa da un mezzo assorbente. La diminuzione di pressione risultante innesca la produzione elettrolitica di O 2 e la quantità di O2 prodotta viene misurata registrando la quantità di carica utilizzata per generarlo. Nel presente studio, il metodo è stato adattato a Drosophila melanogaster testato in piccoli gruppi, con la sensibilità dell'apparato e le condizioni ambientali ottimizzate per un'elevata stabilità. La quantità di O2 consumata dalle mosche selvatiche in questo apparato è coerente con quella misurata da studi precedenti. Il consumo di O2 specifico per la massa da parte dei mutanti CASK, che sono più piccoli e noti per essere meno attivi, non era diverso dai controlli congeniti. Tuttavia, le piccole dimensioni dei mutanti CASK hanno portato a una significativa riduzione del consumo di O2 su base per mosca. Pertanto, il microrespirometro è in grado di misurare il consumo di O2 in D. melanogaster, è in grado di distinguere modeste differenze tra i genotipi e aggiunge uno strumento versatile per misurare i tassi metabolici.
Introduction
La capacità di misurare il tasso metabolico è fondamentale per una comprensione completa di un organismo nel suo contesto ambientale. Ad esempio, è necessario misurare il tasso metabolico per comprendere il suo ruolo nella durata della vita1, il ruolo della dieta nel metabolismo2 o la soglia per lo stress ipossico3.
Esistono due approcci generali per misurare il tasso metabolico4. La calorimetria diretta misura il dispendio energetico direttamente misurando la produzione di calore. La calorimetria indiretta misura la produzione di energia con altri mezzi, spesso attraverso la misurazione respirometrica del consumo di O 2 (V O2), della produzione di CO2 o di entrambi. Sebbene la calorimetria diretta sia stata applicata a piccoli ectotermi, tra cui Drosophila melanogaster5, la respirometria è tecnicamente più semplice e più comunemente usata.
Diverse forme di respirometria sono state utilizzate con successo per misurare il tasso metabolico in D. melanogaster wildtype e mutante e hanno fornito informazioni sugli effetti metabolici della temperatura6, dell'ambiente sociale 3, della dieta 3,7 e dei disturbi dello sviluppo neurologico8. Questi si dividono in due classi, che variano considerevolmente in termini di costi e complessità. La manometria è la più semplice e meno costosa 9,10, in cui le mosche vengono poste in una camera sigillata che contiene un assorbente di CO 2 e che è collegata tramite un sottile capillare a un serbatoio di fluido. Man mano che l'O 2 viene consumato e la CO2 assorbita, la pressione nella camera diminuisce e il fluido viene aspirato nel capillare. Il volume riempito di liquido del capillare è quindi proporzionale a VO2. Versioni più elaborate, che compensano la forza esercitata dal fluido nel capillare, sono state utilizzate anche su D. melanogaster1. La manometria ha il vantaggio di essere semplice ed economica, ma, poiché è sensibile alla pressione, richiede condizioni ambientali costanti. Inoltre, poiché l'O 2 consumato non viene sostituito, la pressione parziale di O2 (PO2) diminuisce gradualmente all'interno delle camere.
La respirometria con l'analisi dei gas viene regolarmente utilizzata anche per D. melanogaster. In questo caso, i gas vengono campionati a intervalli regolari da camere sigillate contenenti mosche e inviati a un analizzatore a infrarossi 2,6,11. Questo tipo di apparecchio ha il vantaggio di essere disponibile in commercio, è meno sensibile alle condizioni ambientali e i gas vengono rinfrescati durante il campionamento in modo che il PO2 rimanga stabile. Tuttavia, l'apparecchiatura può essere costosa e complessa da utilizzare.
Un microrespirometro coulometrico12 di recente sviluppo fornisce un'alternativa economica, sensibile e stabile ai sistemi esistenti. In pratica, un organismo viene posto in una camera ermetica dove consuma O 2 e la CO2 espirata viene rimossa da un materiale assorbente, con conseguente diminuzione netta della pressione della camera. Quando la pressione interna scende ad una soglia preimpostata (soglia ON), la corrente viene fatta passare attraverso un generatore elettrolitico di O2 , riportando la pressione ad una seconda soglia (soglia OFF) arrestando l'elettrolisi. Il trasferimento di carica attraverso il generatore di O 2 è direttamente proporzionale alla quantità di O 2 necessaria per ripressurizzare la camera e può quindi essere utilizzato per misurare l'O2 consumato dall'organismo4. Il metodo è altamente sensibile, misura con precisione V O2 e la sostituzione regolare di O2 può mantenere PO2 a un livello quasi costante per ore o giorni.
Il microrespirometro coulometrico utilizzato in questo studio impiega un sensore elettronico multimodale (pressione, temperatura e umidità). Il sensore è azionato da un microcontrollore che rileva piccole variazioni di pressione e attiva la generazione di O2 quando viene raggiunta una soglia di bassa pressione12. Questo apparecchio è assemblato da parti standard, può essere utilizzato con un'ampia varietà di camere e ambienti sperimentali ed è stato impiegato con successo per esaminare gli effetti della massa corporea e della temperatura sul coleottero Tenebrio molitor. Nel presente studio, il microrespirometro è stato adattato per misurare il consumo di O2 in D. melanogaster, che ha circa l'1% della massa di T. molitor. La sensibilità dell'apparecchio è stata aumentata riducendo la soglia per l'attivazione della generazione di O2 e la stabilità ambientale è stata migliorata conducendo esperimenti in un bagno d'acqua a temperatura controllata e mantenendo l'umidità all'interno delle camere al 100% o quasi.
La proteina CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte della famiglia delle guanilate chinasi associate alla membrana (MAGUK), è un'impalcatura molecolare in diversi complessi multi-proteici e le mutazioni in CASK sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico nell'uomo e in D. melanogaster13,14. Un mutante vitale di D. melanogaster, CASKΔ18, interrompe l'attività dei neuroni dopaminergici 15 e riduce i livelli di attività di oltre il 50% rispetto ai controlli congenici14,16. A causa dei ridotti livelli di attività dei mutanti CASK e del ruolo delle catecolamine nella regolazione del metabolismo17 abbiamo ipotizzato che il loro tasso metabolico standard, e quindi il consumo di O2, sarebbe drasticamente ridotto rispetto ai controlli.
Il consumo di O2 è stato misurato in CASKΔ18 e nei loro congeneri wildtype, w(ex33). Gruppi di mosche sono stati collocati in camere di respirometria, è stato misurato il consumo di O 2, il consumo di O2 è stato calcolato ed espresso sia su base massa-specifica che per mosca. L'apparato ha registrato VO2 nei moscerini wildtype che era coerente con gli studi precedenti e ha potuto differenziare tra il consumo di O2 per mosca dei moscerini wildtype e dei moscerini mutanti CASK.
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Protocol
1. Allevamento e raccolta delle mosche
- Mantenere le mosche a 25 °C in flaconcini stretti contenenti cibo standard per Drosophila .
NOTA: La dimensione del campione per ciascun genotipo deve comprendere almeno nove repliche, ciascuna costituita da una singola camera respirometrica contenente 15-25 moscerini, configurati come descritto di seguito. - Trasferisci le mosche ogni 2-3 giorni.
- Anestetizzare le mosche con CO2, raccogliere gruppi di 15-25 maschi di ogni genotipo e mettere ogni gruppo in fiale di cibo fresco e non lievitato.
NOTA: I maschi sono stati utilizzati per ridurre la variabilità dovuta allo stato riproduttivo. Il metodo si applica ad entrambi i sessi. - Lasciare che le mosche si riprendano a 25 °C per almeno 24 ore.
NOTA: Al momento dell'esperimento, le mosche dovrebbero avere 1-4 giorni. La frequenza dei prelievi descritta al punto 1.3 può essere impostata per restringere la fascia di età delle mosche.
2. Installazione e montaggio della camera del respirometro
- Accendi il bagnomaria e impostalo alla temperatura desiderata per l'esperimento.
NOTA: Gli esperimenti seguenti sono stati condotti a 25 °C utilizzando provette Schlenk da 50 mL come camere. I componenti devono essere assemblati come mostrato nelle Figure 1A, 1B e 1C. - Pulire accuratamente i giunti in vetro smerigliato delle camere e dei tappi dei sensori spruzzando etanolo al 70% su un panno da laboratorio (non direttamente sul giunto) e rimuovendo polvere e grasso vecchio dal connettore del sensore (Figura 1A). Pulisci l'etanolo con una nuova salvietta da laboratorio.
- Posizionare un pezzo di cotone di 1 cm imbevuto di acqua purificata sul fondo della camera per stabilizzare l'umidità.
- Aggiungere acqua a sufficienza (~0,5 ml) per formare una piccola pozza sul fondo del rotolo di cotone.
- Asciugare l'acqua che si è riversata sul giunto della camera.
- Trasferisci le mosche in tubi di polipropilene etichettati utilizzando un imbuto.
- Tappate il tubo con un rotolo di cotone.
NOTA: Le provette sono costituite da una provetta in polipropilene da 5 mL, tagliata a 5,5 cm di lunghezza e perforata con un coltello caldo per consentire il libero scambio d'aria con la camera sperimentale. È noto che l'anestesia con CO2 causa anomalie metaboliche, quindi le mosche vengono trasferite senza anestesia, il che richiede più attenzione per evitare di perdere le mosche.
- Tappate il tubo con un rotolo di cotone.
- Aggiungere un tubo ventilato con mosche in ogni camera del respirometro (sopra il cotone bagnato).
- Riempire le cartucce di calce sodata (4-5 pellet per tubo) e posizionarle sulla parte superiore del tubo contenente le mosche all'interno della camera.
NOTA: Le cartucce di calce sodata sono costituite da provette da centrifuga da 800 μL perforate 4-5 volte con un trapano elettrico. - Riempire i generatori di O2 con una soluzione di solfato di rame saturo (CuSO4) al di sotto del livello dei fori di sfiato
NOTA: I generatori O2 sono costituiti da provette da centrifuga con tappo a vite con 4 fori praticati sotto le filettature. Gli elettrodi in platino (Pt) e rame (Cu) sono saldati a un connettore a due pin, inseriti nei fori praticati nel cappuccio e fissati con resina epossidica. L'elettrolisi di CuSO4 genera l'O2 consumato dall'organismo sperimentale. CuSO4 è tossico per gli invertebrati, evitare fuoriuscite o perdite e pulire immediatamente. - Collegare il generatore di O2 pieno al connettore a due pin sulla spina del sensore.
NOTA: Il catodo di rame deve essere collegato con l'uscita negativa del controller e l'anodo di platino al filo positivo. Le connessioni invertite causeranno il fallimento dell'esperimento. - Posizionare due piccoli tocchi di grasso siliconico trasparente sui lati opposti del giunto in vetro smerigliato della spina del sensore.
- Inserire il tappo nella camera e ruotare il tappo (o la camera) con una pressione moderata per distribuire il grasso nel giunto.
- Rimuovere il grasso in eccesso con una salvietta da laboratorio.
- Agganciare i morsetti Keck in plastica ai giunti per fissare i tappi nelle camere. La camera assemblata dovrebbe essere simile alla Figura 1C.
- Ripetere i passaggi precedenti per il numero di camere utilizzate per l'esperimento del giorno.
NOTA: Il numero di camere che è possibile registrare è limitato dal numero di camere, controller e ingressi USB disponibili per il computer. Per i presenti esperimenti, sette camere sono state normalmente gestite in parallelo. Le mosche sperimentali, come i mutanti, devono essere abbinate a controlli appropriati. Una camera allestita in modo identico ma senza mosche dovrebbe essere inclusa in ogni esperimento come controllo per le variazioni ambientali. Le camere contenenti diversi trattamenti (mutanti, wildtype, no-fly) dovrebbero essere ruotate tra un esperimento e l'altro. - Posizionare le camere assemblate in un rack nel bagno d'acqua con i rubinetti aperti (Figura 1E).
NOTA: Per evitare variazioni circadiane, le camere sono state posizionate nel bagno tra le 9:30 e le 9:50 per tutti gli esperimenti qui descritti. - Lasciare aperti i rubinetti (tenere la maniglia parallela al rubinetto).
NOTA: Fare attenzione a non far entrare l'acqua nei rubinetti. - Lasciare che le camere si equilibrino con i rubinetti aperti per circa 30 min.
NOTA: Mentre la camera è in equilibrio, collegare l'elettronica e impostare l'acquisizione dati come descritto di seguito.
3. Configurazione dei controller e del computer
- Assicurarsi che gli interruttori che forniscono corrente ai generatori O2 siano in posizione OFF (lontano dal connettore; Figura 1D).
- Collegare ciascuna scatola del controller a una porta USB (Universal Serial Bus) disponibile.
NOTA: Costruzione e programmazione delle unità di controllo descritte altrove12. - Collegare i controller alle camere del respirometro utilizzando cavi a 6 conduttori.
- Verificare che i display OLED (Organic Light Emitting Diode) dei controller (Figura 1D) visualizzino i parametri ambientali.
- Accendere brevemente i generatori O2 utilizzando l'interruttore sul controller (Figura 1D).
- Se il valore di corrente aumenta da zero a un valore compreso tra 35 e 55 mA, il controller e la camera sono pronti per gli esperimenti.
- Determinare quali porte COM vengono utilizzate dai controller, come descritto di seguito.,
- Fare clic sull'icona Start in Microsoft Windows.
- Fare clic sull'icona Impostazioni .
- Fare clic su Bluetooth e dispositivi.
- Assicurarsi che i controller e le relative porte COM vengano visualizzati nell'elenco dei dispositivi.
- Apri PuTTY sul desktop e imposta un file di registro per ciascun canale del respirometro come descritto di seguito.
NOTA: PuTTY è una shell sicura gratuita e un client telnet che viene utilizzato per trasferire i dati al computer tramite porte COM.- Selezionare la porta COM per un controller digitando il numero della porta nella casella "Linea seriale" (Figura 2A).
- Fare clic su Registrazione.
- Selezionare Output stampabile in "Registrazione sessione" (Registrazione sessione) (Figura 2B).
- In Nome file di registro, fare clic su Sfoglia.
- Nella cartella scelta, creare un nome file contenente informazioni descrittive (ad esempio, data, specie, numero di porta COM).
- Fai clic su Salva.
- Fare clic su Apri. Si aprirà una finestra che mostra i dati delimitati da virgole in fase di registrazione (Figura 2C).
- Ripetere l'operazione per tutti gli altri controller in uso per l'esperimento. L'ingresso a ciascuna porta COM verrà visualizzato come una finestra separata (Figura 2D).
4. Esecuzione di esperimenti
- Una volta che le camere si sono equilibrate per 30 minuti, sigillarle chiudendo i rubinetti.
- Coprire il bagno e le camere con una scatola di polistirolo espanso per mantenere un ambiente stabile.
- Lasciare agire per un'altra ora.
- Attivare la corrente al generatore di O2 di ciascuna camera utilizzando l'interruttore sulla scatola del controller.
- Una volta attivati i generatori di O2 , assicurarsi che la pressione aumenti fino alla pressione OFF preimpostata.
NOTA: 1017 hPa, che è leggermente al di sopra della pressione atmosferica, è stata utilizzata come pressione "OFF" in questa serie di esperimenti. Il ritorno alla pressione ambiente indicherà una perdita di gas dalle camere. Inoltre, consente di utilizzare la stessa pressione in tutti gli esperimenti, indipendentemente dalla pressione barometrica ambientale. La pressione "ON" era di 1016 hPa, il che significa che la pressione doveva scendere solo di 1 hPa prima che il generatore di O2 fosse attivato. Ciò ha fornito un'adeguata sensibilità per misurare il consumo di O2 in Drosophila. Una volta che una camera è pressurizzata all'impostazione "OFF", la corrente dovrebbe scendere a zero. - Lascia che l'esperimento venga eseguito per 3 o più ore.
NOTA: Un VO2 più elevato a temperature elevate può consentire tempi di esperimento più brevi. Monitorare di tanto in tanto per assicurarsi che l'apparecchiatura funzioni, ma evitare attività eccessive vicino alle camere che potrebbero influire sulla stabilità della temperatura.
5. Esperimento di finitura
- Spegnere i generatori O2 su tutti i controller.
NOTA: Evitare innanzitutto di far funzionare i generatori di O2 mentre le camere sono aperte. - Aprire i rubinetti per aprire le camere.
- Lasciare aperte le finestre PuTTY per altri 5-15 minuti per fornire una linea di base finale.
- Chiudere la finestra PuTTY per ciascun controller, terminando le registrazioni.
NOTA: Tutti gli esperimenti si sono conclusi tra le 16:50 e le 17:10. - Scollegare i sensori dai cavi.
- Spostare le camere sulla griglia a secco.
- Rimuovere i tappi dei sensori uno alla volta dalle camere.
- Scollegare i generatori di O2 e posizionarli nel rack per provette.
- Rimuovere il grasso dalla spina del sensore e conservarlo nel rack.
- Pulire il grasso dai giunti della camera e rimuovere i tubi con mosche e calce sodata.
- L'anestetizzatore vola in ogni provetta con CO2 , tocca una barca di pesi e pesa su una microbilancia.
- Registra il peso e il numero di mosche per ogni tubo.
- Scartare le mosche o metterle da parte per ulteriori procedure.
- Scaricare la calce sodata dalle cartucce nel contenitore dei rifiuti.
- Aprire il generatore di O2 e gettare la soluzione CuSO4 nel contenitore dei rifiuti.
- Sciacquare gli elettrodi e il tubo con acqua purificata.
- Posizionare le rastrelliere per provette per l'asciugatura.
6. Analisi dei dati di trasferimento degli addebiti
- Importare i dati come testo delimitato da virgole in un foglio di calcolo, in cui ogni record comprende un foglio di lavoro separato.
- Registrare i dati attuali e temporali per ogni impulso del generatore O2 . A partire dal primo impulso dopo che la camera è stata pressurizzata, registrare l'ora di inizio e l'ora di fine (come numeri di riga) di ogni impulso corrente. Questo è il numero di riga quando la corrente supera lo zero (di solito a circa 45-50 mA) fino all'ultima riga che è sopra lo zero.
- Crea una tabella sul foglio di lavoro per registrare i seguenti dati:
- L'ampiezza media della corrente durante l'impulso: = AVERAGE([prima riga di impulso]:[ultima riga di impulso]) per ogni impulso (dalla colonna corrente).
- Durata dell'impulso: ([Ultima riga di impulso] - [Prima riga di impulso[-una riga]])/1000 per ogni impulso (dalla colonna del tempo in millisecondi).
- Tempo totale dell'esperimento: [tempo all'inizio dell'ultimo impulso] - [tempo alla fine del primo impulso dopo la pressurizzazione della camera] (dalla colonna del tempo in minuti).
- Quindi calcolare il trasferimento di carica (Q) per ogni impulso (durata media della corrente X)
- Somma la carica di tutti gli impulsi per calcolare la carica totale (Qtot).
7. Analisi del consumo di O2
- Impostare un nuovo foglio di calcolo per tutti i dati e immettere o calcolare quanto segue per ogni camera:
- Qtot (carica totale)
- Talpe (= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= moli × 22413 mL/mol)
- Tempo totale (dall'analisi dei dati di cui sopra)
- mL min-1 (= ml O2 ÷ tempo totale)
- Peso in grammi (mosche anestetizzate e pesate misurate dopo l'esperimento)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ peso in grammi)
- mL/h/g (il precedente × 60)
- mg/mosca (= peso delle mosche ÷ numero di mosche)
- μL mosca-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ numero di mosche).
- Tabulare i dati per ciascun trattamento (genotipo, ad es.)
- Confronta i trattamenti utilizzando ANOVA, t-test o Mann-Whitney u-test 13.
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Representative Results
Le uscite di pressione e corrente del controller del respirometro sono mostrate per una camera in un esperimento nella Figura 3A. Il primo, lungo impulso di corrente ha pressurizzato la camera dalla pressione ambiente (circa 992 hPa) alla soglia OFF preimpostata di 1017 hPa. Man mano che le mosche consumavano O 2 e la CO 2 veniva assorbita, la pressione diminuiva lentamente fino a raggiungere la soglia ON di 1016 hPa, che attivava la corrente attraverso il generatore di O2. Nell'esempio mostrato, l'ampiezza media di ogni impulso è di 50,1 mA, la durata è di 16,1 s, producendo un trasferimento di carica di circa 0,81 coulomb (C) per impulso. Il trasferimento di carica totale per questa camera è stato di 3,28 °C su un tempo totale di 240,0 minuti. Utilizzando i calcoli descritti in Procedure con la massa e il numero di mosche (23 mosche del peso totale di 14,9 mg), il consumo di O 2 per il gruppo in questa camera è stato di 3,19 mL h-1 g-1 o 2,07 μL h-1 fly-1.
L'apparecchiatura può essere configurata facilmente, con un minimo di formazione, e funziona in modo affidabile per molti cicli di montaggio e spegnimento. Ciononostante, le apparecchiature devono essere sottoposte a manutenzione e ispezionate regolarmente e le condizioni sperimentali devono essere controllate attentamente. Ad esempio, la perdita di una tenuta a tenuta di gas, a causa del cedimento di un giunto o di un rubinetto, può portare a cicli di pressurizzazione rapidi e a VO2 spuriamente elevati (Figura 3B). Inoltre, la temperatura e l'umidità devono rimanere stabili all'interno della camera. Se la temperatura o l'umidità diminuiscono, la caduta di pressione risultante verrà interpretata erroneamente come un consumo di O2 . Al contrario, la deriva verso l'alto della temperatura o dell'umidità contrasterà la diminuzione della pressione causata dal consumo di O2 e ridurrà o eliminerà artificialmente il segnale VO2 (Figura 3C).
Il metodo è stato utilizzato per testare VO2 dei mutanti CASKΔ18, che sono stati generati dall'escissione imprecisa di un elemento trasponibile dal locus CASK 14 e in cui la locomozione è drasticamente ridotta14,16. Nei controlli wild-type w(ex33), generati dall'escissione precisa dell'elemento trasponibile, il consumo medio di O2 specifico per la massa è stato di 3,65 ± 0,24 mL·g-1·h-1 (n = 16 camere; Figura 4A).
Nonostante la loro locomozione visibilmente ridotta, la VO2 dei mutanti CASKΔ18 era leggermente ma non significativamente inferiore a quella dei controlli (media ± s.e.m.= 3,23 ± 0,13 mL·g-1·h-1; n = 11 gruppi; P = 0,08 u-test di Mann-Whitney).
Poiché la validità dell'espressione del tasso metabolico in termini di massa corporea è stata messa in discussione18, il consumo di O2 è stato analizzato anche su base per mosca (Figura 4B). Utilizzando questa analisi, VO2 è risultato significativamente ridotto in CASKΔ18 rispetto ai controlli wild-type (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·h-1; CASKΔ18: 1,58 ± 0,10 μL·fly-1·h-1; P = 0,0003, u-test di Mann-Whitney). Tuttavia, la massa media dei moscerini CASKΔ18 era inferiore del >20% rispetto a quella dei controlli ex33 (Figura 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; BOTEΔ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, u-test di Mann-Whitney), quindi la differenza nel tasso metabolico tra i genotipi è probabilmente dovuta alla differenza nelle loro dimensioni.
Figura 1: Configurazione del respirometro . (A) Schema della spina del sensore (sopra) e della camera da 50 mL (costituita da una provetta Schlenk da 50 mL, sotto) prima del montaggio. Notare le posizioni dei giunti in vetro smerigliato 19/22 che collegheranno la camera e la spina del sensore e che devono essere puliti prima di ogni esperimento. È indicato anche il rubinetto di arresto, necessario per l'apertura o la chiusura della camera. (B) Schema della camera e dei componenti, assemblati e pronti per l'esperimento, che mostra: rotolo di cotone bagnato, tubo di polipropilene contenente mosche, tappato con un tappo di cotone, cartuccia di soda-calce e generatore di O2 riempito con CuSO4. (C) Fotografia della camera assemblata. Il morsetto Keck che fissa la spina alla camera è parzialmente oscurato dal morsetto del supporto ad anello che tiene la camera. (D) Fotografia del controller che mostra l'interruttore che controlla la corrente attraverso il generatore O2 e la finestra per la visualizzazione del display OLED. (E) Camere assemblate a bagnomaria. Vengono mostrate sette camere, di cui tre contenenti mutanti, tre con controlli wildtype e una camera contenente tutti i componenti tranne le mosche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Impostazione dell'acquisizione dati. (A) Interfaccia PuTTY per la selezione della porta seriale per l'acquisizione dei dati. È stato selezionato COM3, con una velocità BAUD di 9600 per adattarsi all'uscita del controller. (B) Interfaccia PuTTY per l'impostazione del file di registro. Viene selezionata l'opzione "Output stampabile" per consentire la registrazione dei dati in un file di testo, viene selezionata la cartella dei dati utilizzando il pulsante "Sfoglia" e viene creato un nome file. (C) File di log PuTTY durante un esperimento. I dati vengono acquisiti circa due volte al secondo e ogni riga contiene le seguenti informazioni delimitate da virgole: numero del sensore, tempo (ms) dall'inizio dell'acquisizione, temperatura della camera (°C), pressione della camera (hPa), umidità (percentuale relativa) e corrente (mA). (D) Registrazione dei dati durante un tipico esperimento, con sette finestre per le camere sperimentali, più un canale che registra la temperatura del bagno, la temperatura dell'aria ambiente, la pressione e l'umidità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati del microrespirometro. (A) Pressione (linea grigia, asse sinistro) e corrente attraverso il generatore di O2 (linea nera, asse destro) in una singola camera del respirometro contenente 23 w(ex33) mosche. All'inizio, è necessario un lungo impulso di corrente per pressurizzare la camera da ~992 hPa alla soglia OFF di 1017 hPa. Man mano che le mosche consumavano O 2, la pressione scendeva fino a raggiungere la soglia ON di 1016 hPa, che attivava la corrente attraverso il generatore di O2, che ripressurizzava la camera a 1017 hPa. Il processo è stato ripetuto sei volte in questo esperimento. (B) Un esempio di camera che perde causato da un rubinetto danneggiato, tratto da una diversa serie di esperimenti. La camera non è riuscita a mantenere la pressione (linea grigia), con conseguente ciclo costante della corrente elettrolitica (linea nera). Notare una scala temporale diversa dal pannello A. (C) Effetto della deriva dell'umidità. Il consumo di O2 da parte del coleottero (Hippodamia convergens) da 20 mg nella camera avrebbe dovuto produrre un modello ciclico di pressione simile alla Figura 3A, ma l'aumento costante dell'umidità (linea nera) ha causato un aumento artefatto della pressione della camera (linea grigia) che ha mascherato VO2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dati quantitativi di D. melanogaster, wild-type e mutante CASK. (A)V-O2 massa-specifico per mosche wild-type (w(ex33)) e mutanti (CASKΔ18). In tutti i grafici, la parte inferiore e superiore delle caselle indica rispettivamente il primo e il terzo quartile, i baffi indicano valori estremi e le dimensioni del campione (numero di camere, ciascuna contenente 17-24 mosche) sono indicate tra parentesi sopra i genotipi. I moscerini CASK Δ18 non sono statisticamente significativamente diversi da ex33 (mediana: ex33: 3.420 mL·g-1·h-1 , CASKΔ18: 3.029 mL·g-1·h-1; p = 0.08 u-test di Mann-Whitney). (B) VO2 specifico per la mosca. I moscerini CASKΔ18hanno consumato significativamente meno O 2 (mediana 1.650 mL·fly-1·h-1) rispetto a w(ex33) (2.078 mL·fly-1·h-1; p = 0.0003, u-test di Mann-Whitney; significato indicato da asterischi). (C) La massa differiva tra CASKΔ18 e wildtype (mediana: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, u-test di Mann-Whitney; significatività indicata da asterischi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Indagine sui dati di respirometria di Drosophila da moscerini wildtype a 25 °C. Con un'eccezione18, gli studi sono limitati a quelli che misurano il consumo di O2 . Nella maggior parte dei casi, è stato necessario stimare VO2 dai grafici e sono forniti i numeri delle figure dai documenti originali. Sebbene tutti i genotipi fossero considerati "wildtype", le fonti e i metodi di propagazione variavano. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
La procedura di cui sopra mostra la misurazione del consumo di O2 in D. melanogaster utilizzando un microrespirometro coulometrico elettronico. I dati risultanti per il consumo di O2 in D. melanogaster wild-type erano all'interno degli intervalli descritti nella maggior parte delle pubblicazioni precedenti utilizzando metodi diversi (Tabella 1), anche se leggermente inferiori a quelli riportati da altri 3,6.
Le fasi critiche hanno riguardato i due requisiti assoluti del metodo: tenuta stagna e stabilità ambientale. Mantenere un ambiente a tenuta di gas è semplice ma richiede attenzione. I palloni e le provette Schlenk sono ideali come camere di respirometria. La costruzione in vetro evita la permeabilità ai gas presente in molti tipi di plastica19, che è particolarmente critica negli esperimenti prolungati. I giunti standard consentono collegamenti a tenuta di gas con le spine contenenti i sensori e le connessioni elettroniche. I rubinetti forniscono guarnizioni affidabili e possono essere aperti o chiusi secondo necessità durante gli esperimenti. Per garantire la tenuta al gas per ogni esperimento, sono stati ispezionati i rubinetti, i giunti sono stati puliti accuratamente, sono state applicate quantità giudiziose di grasso siliconico pulito e i giunti sono stati fissati con morsetti Keck.
La sensibilità del metodo è limitata dalla stabilità della temperatura e dell'umidità all'interno della camera. Le variazioni di uno dei due parametri si tradurranno in fluttuazioni di pressione che interferiscono con il segnale VO2 . L'uso di una camera ambientale12 o di un bagno d'acqua circolante fornisce un controllo della temperatura più stabile. Lavori precedenti di altri hanno dimostrato che il metodo può misurare il consumo di O2 al livello di nmol·h-1 quando la temperatura è stata mantenuta entro ±0,01 °C20. Per stabilizzare l'umidità, i pezzi di rotolo di cotone immersi nell'acqua hanno mantenuto l'umidità quasi al 100%. La temperatura e l'umidità sono state lasciate stabilizzare per almeno 90 minuti prima che le camere venissero pressurizzate con O2 generato elettroliticamente e iniziassero le registrazioni. Tutti gli esperimenti includevano una camera che era assemblata con tutti i componenti ma non conteneva mosche, al fine di monitorare le condizioni ambientali.
Il monitoraggio costante della temperatura, della pressione e dell'umidità riduce notevolmente la risoluzione dei problemi. Ad esempio, è stato possibile rilevare e correggere l'apparente V O2 artificialmente elevata causata da un rubinetto danneggiato (Figura 3B) o l'apparente perdita diV O2 dovuta all'umidità instabile della camera (Figura 3C).
Il microrespirometro coulometrico qui descritto presenta diversi vantaggi. Innanzitutto, è relativamente economico, con un costo totale approssimativo di $ 100 per canale (comprendente camera, sensore e controller). In secondo luogo, poiché ogni canale acquisisce e trasmette i dati in modo indipendente, il sistema è scalabile, con il numero di camere limitato solo dalle dimensioni del controllore ambientale (bagno d'acqua o camera ambientale) e dal numero di porte USB disponibili nel computer (generalmente espandibile fino a >100). Inoltre, poiché le camere e i controllori sono indipendenti, il guasto di uno di essi non influirà sugli altri. In terzo luogo, i controller possono essere facilmente riprogrammati per adattarsi alla pressione ambiente o per regolare la sensibilità secondo necessità. In relazione a questo, la pressione all'interno delle camere è impostata su un valore fisso, quindi la pressione sperimentale sarà costante tra gli esperimenti indipendentemente dalla pressione barometrica ambiente. In quarto luogo, il flusso costante di dati relativi a tempo, temperatura, pressione, umidità e corrente consente un'analisi dettagliata di questi parametri per ciascuna camera, facilitando la risoluzione dei problemi o l'analisi dei cambiamenti temporali in VO2 in esperimenti più lunghi. Infine, le condizioni ambientali all'interno della camera possono essere mantenute a un livello costante per molte ore o giorni, perché l'O2 consumato viene continuamente sostituito. Nel presente studio, la pressione della camera ha fluttuato da 1016 a 1017 hPa, che è inferiore allo 0,1%, con la conseguente variazione di PO2 inferiore allo 0,5%. Sulla base della quantità di CuSO4 in ciascun generatore di O 2 , che può generare 28 ml di O2 , e della media V O2 dei gruppi di mosche in questo studio, 1,15 mL / giorno (media = 21,8 mosche per camera), il tasso metabolico può essere studiato per un massimo di 24 giorni alla volta. Supponendo che le mosche ricevano un'alimentazione adeguata, ciò significa che il metabolismo può essere studiato continuamente per la maggior parte della durata della vita di una mosca.
Attualmente, la maggior parte degli studi sul metabolismo in D. melanogaster si basa sull'analisi dei gas o sulla manometria. I metodi che si basano sull'analisi dei gas, come i respirometria flusso continuo e a flusso continuo 2,3,6, hanno il vantaggio che il metodo è ben consolidato e le apparecchiature sono disponibili in commercio. Tuttavia, richiedono apparecchiature costose e complesse, tra cui collettori e sensori di flusso molecolari per regolare il flusso e analizzatori di gas per misurare le concentrazioni di gas. In alternativa, i semplici manometri9 sono molto meno costosi. Nella forma più semplice, comunemente in uso per D. melanogaster, le mosche vengono anestetizzate e poste in una piccola camera che contiene materiale assorbente di CO2 e che è collegata a un serbatoio di fluido da un tubo capillare. Man mano che l'O 2 viene consumato e la CO2 risultante viene assorbita, la pressione scende nella camera, che attira il fluido nel tubo capillare. L'altezza del fluido è quindi proporzionale alla quantità di O2 consumata. Poiché l'O2 consumato non viene sostituito durante l'esperimento, PO2 diminuisce continuamente nel corso dell'esperimento. Sebbene gli esperimenti di routine non riducano P O2 sufficientemente da influenzare negativamente V O2, esperimenti prolungati o esperimenti a temperature elevate potrebbero esaurire O2 e raggiungere il P O2 critico al quale V O2 diminuisce bruscamente 3. Un altro problema è che il peso del fluido nel capillare esercita una forza verso il basso, riducendo l'altezza del fluido in proporzione alla forza esercitata verso il basso, con conseguenti potenziali errori. I metodi per compensare questo effetto sono stati descritti 4,21, ma sono ingombranti e non sono ampiamente utilizzati. Il confronto diretto tra l'analisi dei gas e la manometria ha indicato che i due metodi hanno prodotto risultati significativamente diversi, ma gli autori non sono stati in grado di fornire una spiegazione soddisfacente per la discrepanza22.
Nonostante i suoi vantaggi, il microrespirometro coulometrico ha anche dei limiti. Innanzitutto, a differenza di alcuni sistemi di analisi dei gas a flusso interrotto, non è disponibile in commercio. I componenti sono di facile acquisizione e né la progettazione né la programmazione sono complicate, ma è potenzialmente più complessa da costruire rispetto ai semplici sistemi manometrici9. In secondo luogo, l'acquisizione di dati accurati deve includere più cicli di generazione di O2 , quindi ogni esperimento deve durare diverse ore. Questo vale anche per gli esperimenti che utilizzano la manometria. Infine, sempre come per la manometria, la temperatura e l'umidità all'interno delle camere devono essere stabili. Ciononostante, il microrespirometro coulometrico offre una via di mezzo per quanto riguarda il costo e la complessità, è robusto e affidabile una volta assemblato e misura con precisione il consumo di O2 .
Gli esperimenti con mutanti CASKΔ18 dimostrano risultati sia negativi (V O2 massa-specifica) che positivi (VO2 specifico per la mosca). Se la riduzione del >50% della deambulazione dei mutanti CASKΔ18derivasse da un metabolismo compromesso, si potrebbe prevedere che VO2 si ridurrebbe di una quantità simile. Tuttavia, la variazione del consumo di O2 specifico per la massa è stata modesta (riduzione del 9,6% della VO2 mediana) e non statisticamente significativa. Questo risultato negativo è coerente con i mutanti CASKΔ18 che hanno un metabolismo relativamente normale, con il fenotipo comportamentale derivante dalla diminuzione della spinta locomotoria. Sebbene sia possibile che il metodo manchi di sensibilità sufficiente, la riduzione di VO2 causata da una differenza relativamente piccola nelle dimensioni (riduzione del 15,5% della massa mediana) è stata altamente significativa.
Camminare è associato a un dispendio energetico significativamente aumentato 5,23, quindi perché VO2 è relativamente normale nei mutanti CASK? È possibile che l'eccessiva toelettatura nei mutanti CASK16 possa controbilanciare la riduzione della deambulazione, o che il fenotipo della deambulazione sia meno evidente quando le mosche vengono testate in gruppi in piccoli tubi, ma queste ipotesi attendono una verifica sperimentale. Ciononostante, concludiamo che le mutazioni nel locus CASK non hanno effetti forti e diretti sul metabolismo e che il microrespirometro coulometrico è uno strumento efficace per studiare il metabolismo in D. melanogaster.
Poiché questo apparecchio è facilmente costruito con componenti comuni, misura con precisione il consumo di O2 , è altamente portatile, può essere utilizzato in qualsiasi ambiente con temperatura stabile ed è stato utilizzato con organismi piccoli come 0,5 mg di mosche (il presente studio) e grandi come 500 mg di scorpioni (DJS non pubblicato), aggiunge uno strumento versatile per studiare il metabolismo di diversi organismi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo la Dott.ssa Linda Restifo dell'Università dell'Arizona per aver suggerito di testare il consumo di O2 dei mutanti CASK e per l'invio dei mutanti CASK e dei loro controlli congeniti. Le spese di pubblicazione sono state fornite dal Fondo di reinvestimento dipartimentale del Dipartimento di Biologia dell'Università di College Park. Lo spazio e alcune attrezzature sono stati forniti dalle Università di Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
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