Summary
A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O2 estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O2 pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.
Abstract
A microrrespirometria coulométrica é um método simples e barato para medir o consumo de O2 de pequenos organismos, mantendo um ambiente estável. Um microrrespirômetro coulométrico consiste em uma câmara hermética na qual o O 2 é consumido e o CO2 produzido pelo organismo é removido por um meio absorvente. A diminuição de pressão resultante desencadeia a produção eletrolítica de O 2, e a quantidade de O2 produzida é medida registrando-se a quantidade de carga usada para gerá-la. No presente estudo, o método foi adaptado para Drosophila melanogaster testado em pequenos grupos, com a sensibilidade do aparelho e as condições ambientais otimizadas para alta estabilidade. A quantidade de O2 consumida por moscas selvagens neste aparelho é consistente com a medida por estudos anteriores. O consumo deO2 específico em massa pelos mutantes CARSK, que são menores e sabidamente menos ativos, não foi diferente dos controles congênicos. No entanto, o pequeno tamanho dos mutantes CASK resultou em uma redução significativa no consumo de O2 por mosca. Portanto, o microrrespirômetro é capaz de medir o consumo de O2 em D. melanogaster, pode distinguir diferenças modestas entre genótipos e adiciona uma ferramenta versátil para medir taxas metabólicas.
Introduction
A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida1, o papel da dieta no metabolismo2 ou o limiar para o estresse hipóxico3.
Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica4. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométrica do consumo de O 2 (VO2), produção de CO2 ou ambos. Embora a calorimetria direta tenha sido aplicada a pequenos ectotérmicos, incluindo Drosophila melanogaster5, a respirometria é tecnicamente mais simples e mais comumente usada.
Várias formas de respirometria têm sido usadas com sucesso para medir a taxa metabólica em D. melanogaster selvagem e mutante e têm fornecido informações sobre os efeitos metabólicos da temperatura6, ambiente social 3, dieta 3,7 e distúrbios do neurodesenvolvimento8. Estes dividem-se em duas classes, que variam consideravelmente em custo e complexidade. A manometria é a mais simples e barata 9,10, na qual as moscas são colocadas em uma câmara selada que contém um absorvente de CO2 e que é conectada através de um capilar fino a um reservatório de fluido. À medida que o O 2 é consumido e o CO2 absorvido, a pressão na câmara diminui e o fluido é atraído para o capilar. O volume preenchido por líquido do capilar é, portanto, proporcional ao VO2. Versões mais elaboradas, que compensam a força exercida pelo fluido no capilar, também têm sido utilizadas em D. melanogaster1. A manometria tem as vantagens de ser simples e barata, mas, por ser sensível à pressão, requer condições ambientais constantes. Além disso, como o O 2 consumido não é substituído, a pressão parcial de O2 (PO2) diminui gradualmente dentro das câmaras.
A respirometria usando análise de gases também é regularmente usada para D. melanogaster. Neste caso, os gases são amostrados em intervalos regulares a partir de câmaras seladas contendo moscas e enviados para um analisador infravermelho 2,6,11. Esse tipo de aparelho tem as vantagens de estar disponível comercialmente, ser menos sensível às condições ambientais e os gases serem refrescados durante a amostragem para que o PO2 permaneça estável. No entanto, o equipamento pode ser caro e complexo de operar.
Um microrrespirômetro coulométrico12 recentemente desenvolvido fornece uma alternativa barata, sensível e estável aos sistemas existentes. Na prática, um organismo é colocado em uma câmara hermética onde consome O 2 e o CO2 exalado é removido por um material absorvente, resultando em uma diminuição líquida na pressão da câmara. Quando a pressão interna diminui para um limiar pré-estabelecido (ON-threshold), a corrente é passada através de um gerador eletrolítico O2, retornando a pressão para um segundo limiar (OFF-threshold) parando a eletrólise. A transferência de carga através do gerador de O 2 é diretamente proporcional à quantidade de O 2 necessária para repressurizar a câmara e, portanto, pode ser usada para medir o O2 consumido pelo organismo4. O método é altamente sensível, mede V O2 com precisão, e a reposição regular de O2 pode manter PO2 em um nível quase constante por horas ou dias.
O microrrespirômetro coulométrico utilizado neste estudo emprega um sensor eletrônico multimodal (pressão, temperatura e umidade). O sensor é operado por um microcontrolador que detecta pequenas mudanças de pressão e ativa a geração de O2 quando um limiar de baixa pressão é atingido12. Este aparelho é montado a partir de peças de prateleira, pode ser usado com uma grande variedade de câmaras e ambientes experimentais, e tem sido empregado com sucesso para examinar os efeitos da massa corporal e temperatura sobre o besouro Tenebrio molitor. No presente estudo, o microrrespirômetro foi adaptado para medir o consumo de O2 em D. melanogaster, que possui aproximadamente 1% da massa de T. molitor. A sensibilidade do aparelho foi aumentada pela redução do limiar de ativação da geração de O2 , e a estabilidade ambiental foi melhorada pela realização de experimentos em banho-maria com temperatura controlada e pela manutenção da umidade no interior das câmaras em ou perto de 100%.
A proteína CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte da família das guanilato quinases associadas à membrana (MAGUK), é um arcabouço molecular em diferentes complexos multiproteicos, e mutações no CASK estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento em humanos e em D. melanogaster13,14. Um mutante viável de D. melanogaster, CASKΔ18, interrompe a atividade de neurônios dopaminérgicos 15 e reduz os níveis de atividade em mais de 50% em comparação com controles congênicos14,16. Devido aos níveis reduzidos de atividade dos mutantes CASK e ao papel das catecolaminas na regulação do metabolismo17, levantamos a hipótese de que sua taxa metabólica padrão e, portanto, o consumo de O2, seriam drasticamente reduzidos em comparação com os controles.
O consumo de O2 foi medido em CASKΔ18 e seus congêneres selvagens, w(ex33). Grupos de moscas foram colocados em câmaras de respirometria, o consumo de O 2 foi medido, o consumo de O2 foi calculado e expresso em uma base específica de massa e por mosca. O aparelho registrou VO2 em moscas selvagens que foi consistente com estudos anteriores, e poderia diferenciar entre o consumo por mosca O2 de moscas selvagens e mutantes CARK.
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Protocol
1. Criação e coleta de moscas
- Manter as moscas a 25 °C em frascos para injetáveis estreitos contendo alimentos padrão de Drosophila .
NOTA: O tamanho da amostra para cada genótipo deve incluir pelo menos nove repetições, cada uma consistindo de uma única câmara respiratória contendo 15-25 moscas, configuradas conforme descrito abaixo. - Transfira as moscas a cada 2-3 dias.
- Anestesiar moscas com CO2, coletar grupos de 15-25 machos de cada genótipo e colocar cada grupo em frascos de alimentos frescos e não fermentados.
NOTA: Os machos foram usados para reduzir a variabilidade devido ao status reprodutivo. O método aplica-se a ambos os sexos. - Permitir que as moscas se recuperem a 25 °C por pelo menos 24 h.
NOTA: No momento do experimento, as moscas devem ter 1-4 dias de idade. A frequência de coletas descrita no passo 1.3 pode ser definida para reduzir a faixa etária das moscas.
2. Instalação e montagem da câmara do respirômetro
- Ligue o banho-maria e coloque-o na temperatura desejada para o experimento.
NOTA: Os experimentos abaixo foram conduzidos a 25 °C utilizando tubos de Schlenk de 50 mL como câmaras. Os componentes devem ser montados conforme mostrado nas Figuras 1A, 1B e 1C. - Limpe completamente as juntas de vidro moído das câmaras e plugues do sensor pulverizando etanol 70% em um lenço de laboratório (não diretamente na junta) e limpando a poeira e a graxa velha do plugue do sensor (Figura 1A). Limpe o etanol com um toalhete de laboratório fresco.
- Coloque 1 cm de rolo de algodão embebido em água purificada no fundo da câmara para estabilizar a umidade.
- Adicione água suficiente (~0,5 mL) para formar uma pequena piscina no fundo do rolo de algodão.
- Limpe qualquer água que tenha derramado na junta da câmara.
- Transfira as moscas para tubos de polipropileno marcados usando um funil.
- Conecte o tubo com um rolo de algodão.
OBS: Os tubos consistem em um tubo de ensaio de polipropileno de 5 mL, aparado até 5,5 cm de comprimento e perfurado com uma faca quente para permitir a livre troca de ar com a câmara experimental. A anestesia com CO2 é conhecida por causar anormalidades metabólicas, de modo que as moscas são transferidas sem anestesia, o que requer mais cuidados para evitar a perda das moscas.
- Conecte o tubo com um rolo de algodão.
- Adicione um tubo ventilado com moscas em cada câmara do respirômetro (em cima do algodão úmido).
- Encha cartuchos de cal sodada (4-5 pellets por tubo) e coloque-os na parte superior do tubo contendo moscas dentro da câmara.
NOTA: Os cartuchos de cal sodada consistem em tubos de centrífuga de 800 μL perfurados 4-5 vezes com uma furadeira elétrica. - Encha os geradores O2 com solução saturada de sulfato de cobre (CuSO4) abaixo do nível dos orifícios de ventilação
OBS: Os2 geradores consistem em tubos centrífugos com tampa de rosca com 4 furos perfurados abaixo das roscas. Os eletrodos de platina (Pt) e cobre () são soldados a um conector de dois pinos, inseridos em furos perfurados na tampa e afixados com epóxi. A eletrólise do CuSO4 gera o O2 consumido pelo organismo experimental. CuSO4 é tóxico para invertebrados, evitar derramamentos ou vazamentos e limpar imediatamente. - Conecte o gerador O2 preenchido ao conector de dois pinos no plugue do sensor.
NOTA: O cátodo de cobre deve ligar-se com a saída negativa do controlador e o ânodo de platina ao fio positivo. Conexões invertidas causarão a falha do experimento. - Coloque dois pequenos pinças de graxa de silicone transparente em lados opostos da junta de vidro fosco do plugue do sensor.
- Insira o plugue na câmara e gire o plugue (ou câmara) com pressão moderada para espalhar a graxa na junta.
- Limpe o excesso de gordura com um lenço de laboratório.
- Encaixe as fixações de plástico Keck nas juntas para fixar plugues nas câmaras. A câmara montada deve se parecer com a Figura 1C.
- Repita as etapas acima para o número de câmaras usadas para o experimento do dia.
NOTA: O número de câmaras que podem ser gravadas é limitado pelo número de câmaras, controladores e entradas USB disponíveis para o computador. Para os experimentos atuais, sete câmaras foram normalmente executadas em paralelo. Moscas experimentais, como mutantes, devem ser combinadas com controles apropriados. Uma câmara montada de forma idêntica, mas sem moscas, deve ser incluída em cada experimento como controle da variação ambiental. Câmaras contendo diferentes tratamentos (mutante, selvagem, no-fly) devem ser rotacionadas entre os experimentos. - Coloque as câmaras montadas em um rack no banho-maria com torneiras abertas (Figura 1E).
OBS: Para evitar variação circadiana, câmaras foram colocadas no banho entre 9:30 e 9:50 horas para todos os experimentos aqui descritos. - Deixe as torneiras abertas (Mantenha a alça paralela à torneira).
OBS: Cuidado para não permitir a entrada de água nas torneiras. - Deixe as câmaras se equilibrarem com torneiras abertas por cerca de 30 min.
NOTA: Enquanto a câmara estiver equilibrada, conecte a eletrônica e configure a aquisição de dados conforme descrito abaixo.
3. Configuração de controladores e computador
- Certifique-se de que os interruptores que fornecem corrente para os geradores O2 estão na posição OFF (longe do conector; Figura 1D).
- Conecte cada caixa do controlador a uma porta USB (barramento serial universal) disponível.
NOTA: Construção e programação das unidades controladoras descritas em12. - Conecte controladores a câmaras de respirômetro usando cabos de 6 condutores.
- Verifique se os displays OLED (organic light emitting diode) dos controladores (Figura 1D) estão exibindo parâmetros ambientais.
- Ligue brevemente os geradores O2 usando o interruptor do controlador (Figura 1D).
- Se o valor da corrente aumentar de zero para entre 35 e 55 mA, o controlador e a câmara estão prontos para experimentos.
- Determine quais portas COM estão sendo usadas pelos controladores, conforme descrito abaixo.,
- Clique no ícone Iniciar no Microsoft Windows.
- Clique no ícone Configurações .
- Clique em Bluetooth e dispositivos.
- Verifique se os controladores e suas portas COM aparecem na lista de dispositivos.
- Abra o PuTTY na área de trabalho e configure um arquivo de log para cada canal do respirômetro, conforme descrito abaixo.
NOTA: PuTTY é um shell seguro gratuito e cliente telnet que é usado para transferir dados para o computador através de portas COM.- Selecione a porta COM para um controlador digitando o número da porta na caixa "Linha serial" (Figura 2A).
- Clique em Registro.
- Selecione Saída imprimível em "Log de sessão" (Figura 2B).
- Em Nome do Arquivo de Log, clique em Procurar.
- Na pasta da escolha, crie um nome de arquivo contendo informações descritivas (por exemplo, data, espécie, número da porta COM).
- Clique em Salvar.
- Clique em Abrir. Uma janela será aberta mostrando dados delimitados por vírgulas sendo registrados (Figura 2C).
- Repita para todos os outros controladores em uso para o experimento. A entrada para cada porta COM aparecerá como uma janela separada (Figura 2D).
4. Experimentos em execução
- Uma vez que as câmaras tenham se equilibrado por 30 min, vele-as fechando torneiras.
- Cubra o banho e as câmaras com uma caixa de espuma de poliestireno para manter um ambiente estável.
- Deixe equilibrar por mais uma hora.
- Ligue a corrente para o gerador O2 de cada câmara usando o interruptor na caixa do controlador.
- Uma vez que os geradores de O2 estejam ativados, certifique-se de que a pressão aumente para a pressão OFF pré-definida.
NOTA: 1017 hPa, que está ligeiramente acima da pressão atmosférica, foi usada como pressão "OFF" nesta série de experimentos. O retorno à pressão ambiente indicará vazamento de gás das câmaras. Além disso, permite que a mesma pressão seja usada em todos os experimentos, independentemente da pressão barométrica ambiente. A pressão "ON" era de 1016 hPa, o que significa que a pressão só precisava cair 1 hPa antes que o gerador de O2 fosse ativado. Isso proporcionou sensibilidade adequada para medir o consumo de O2 em Drosophila. Uma vez que uma câmara é pressurizada para a configuração "OFF", a corrente deve cair para zero. - Deixe o experimento correr por 3 ou mais h.
NOTA:O2 V mais alto em temperaturas elevadas pode permitir tempos de experimento mais curtos. Monitore ocasionalmente para garantir que o equipamento esteja funcionando, mas evite atividades excessivas perto das câmaras que possam afetar a estabilidade da temperatura.
5. Experimento de acabamento
- Desligue os geradores O2 em todos os controladores.
NOTA: Faça primeiro para evitar o funcionamento dos geradores O2 enquanto as câmaras estão abertas. - Abra as torneiras para desselar as câmaras.
- Deixe as janelas do PuTTY abertas por mais 5-15 minutos para fornecer uma linha de base final.
- Feche a janela PuTTY para cada controlador, encerrando as gravações.
OBS: Todos os experimentos foram encerrados entre 16h50 e 17h10. - Desconecte os sensores dos cabos.
- Mova as câmaras para o rack seco.
- Remova os plugues do sensor, um de cada vez, das câmaras.
- Desconecte os geradores O2 e coloque-os no rack tubular.
- Limpe a graxa do plugue do sensor e mantenha-a no rack.
- Limpe a graxa das juntas da câmara e remova os tubos com moscas e cal sodada.
- Anestesiar moscas em cada tubo com CO2, bater em um barco de peso e pesar em uma microbalança.
- Registre o peso e o número de moscas para cada tubo.
- Descarte moscas ou reserve-as para procedimentos adicionais.
- Despeje cal sodada dos cartuchos no recipiente de resíduos.
- Abra o gerador O2 e descarte a solução CuSO4 no recipiente de resíduos.
- Enxágue eletrodos e tubo com água purificada.
- Coloque as cremalheiras tubulares para secagem.
6. Análise dos dados de transferência de encargos
- Importe Dados como texto delimitado por vírgulas para uma planilha, com cada registro compreendendo uma planilha separada.
- Registre os dados de corrente e tempo para cada pulso do gerador de O2 . Começando com o primeiro pulso após a câmara ter sido pressurizada, registre a hora de início e a hora de término (como números de linha) de cada pulso de corrente. Esse é o número da linha quando a corrente vai acima de zero (geralmente para cerca de 45-50 mA) para a última linha que está acima de zero.
- Crie uma tabela na planilha para registrar os seguintes dados:
- A amplitude média da corrente durante o pulso: = MÉDIA([primeira linha de pulso]:[última fileira de pulso]) para cada pulso (da coluna de corrente).
- Duração do pulso: ([Última linha de pulso] - [primeira fileira de pulso[-uma linha]])/1000 para cada pulso (a partir do tempo em milissegundos da coluna).
- Tempo total do experimento: [tempo no início do último pulso] - [tempo no final do primeiro pulso após câmara pressurizada] (a partir do tempo em minutos da coluna).
- Em seguida, calcule a transferência de carga (Q) para cada pulso (corrente média X duração)
- Somar a carga de todos os pulsos para calcular a Carga Total (Qtot).
7. Análise do consumo de O2
- Configure uma nova planilha para todos os dados e insira ou calcule o seguinte para cada câmara:
- Qtot (carga total)
- Toupeiras (= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= moles × 22413 mL/mol)
- Tempo total (a partir da análise dos dados acima)
- mL min-1 (= ml O2 ÷ tempo total)
- Peso em gramas (moscas anestesiadas e pesadas medidas após o experimento)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ peso em gramas)
- mL/h/g (o acima × 60)
- mg/mosca (= peso das moscas ÷ número de moscas)
- μL mosca-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ número de moscas).
- Tabular os dados de cada tratamento (genótipo, por exemplo)
- Comparar os tratamentos usando ANOVA, teste t ou teste u de Mann-Whitney 13.
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Representative Results
As saídas de pressão e corrente do controlador do respirômetro são mostradas para uma câmara em um experimento na Figura 3A. O primeiro pulso de corrente longa pressurizou a câmara da pressão ambiente (aproximadamente 992 hPa) até o limiar OFF pré-estabelecido de 1017 hPa. À medida que as moscas consumiam O 2 e CO 2 era absorvido, a pressão diminuía lentamente até atingir o limiar de ON de 1016 hPa, que ativava a corrente através do gerador de O2. No exemplo mostrado, a amplitude média de cada pulso é de 50,1 mA, a duração é de 16,1 s, gerando uma transferência de carga de cerca de 0,81 coulombs (C) por pulso. A transferência de carga total para esta câmara foi de 3,28 C em um tempo total de 240,0 min. Utilizando os cálculos descritos em Procedimentos com a massa e o número de moscas (23 moscas pesando 14,9 mg no total), o consumo de O 2 para o grupo nesta câmara foi de 3,19 mL h-1 g-1 ou 2,07 μL h-1 mosca-1.
O equipamento pode ser configurado facilmente, com um mínimo de treinamento, e funciona de forma confiável para muitos ciclos de montagem e desligamento. No entanto, os equipamentos devem ser mantidos e inspecionados regularmente, e as condições experimentais devem ser controladas cuidadosamente. Por exemplo, a perda de uma vedação estanque, devido à falha de uma junta ou torneira, pode levar a ciclos de pressurização rápidos e VO2 espuriosamente alto (Figura 3B). Além disso, a temperatura e a umidade devem permanecer estáveis dentro da câmara. Se a temperatura ou a umidade diminuírem, a queda de pressão resultante será interpretada erroneamente como um O2 sendo consumido. Por outro lado, a deriva ascendente da temperatura ou umidade neutralizará a diminuição da pressão causada pelo consumo de O2 e reduzirá ou eliminará artificialmente o sinal deV O2 (Figura 3C).
O método foi utilizado para testar VO2 de mutantes CASK Δ18, que foram gerados pela excisão imprecisa de um elemento transponível do locus CASK 14, e nos quais a locomoção é drasticamente reduzida14,16. Nos controles selvagens w(ex33), gerados pela excisão precisa do elemento transponível, o consumo médio de O2 específico para a massa foi de 3,65 ± 0,24 mL·g-1·h-1 (n = 16 câmaras; Figura 4A).
Apesar da locomoção visivelmente reduzida, o VO2 dos mutantes CASKΔ18 foi levemente, mas não significativamente, menor do que o dos controles (média ± s.e.m.= 3,23 ± 0,13 mL·g-1·h-1; n = 11 grupos; P = 0,08 teste u de Mann-Whitney).
Como a validade de expressar a taxa metabólica em termos de massa corporal tem sido questionada18, o consumo de O2 também foi analisado por mosca (Figura 4B). Usando esta análise, o VO2 foi significativamente reduzido no CASKΔ18 em comparação com controles selvagens (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·h-1; BARRILΔ18: 1,58 ± 0,10 μL·mosca-1·h-1; P = 0,0003, teste u de Mann-Whitney). Entretanto, a massa média das moscas CASK Δ18 foi >20% menor que a dos controles ex33 (Figura 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; BARRILΔ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, teste u de Mann-Whitney), portanto, a diferença na taxa metabólica entre os genótipos é provavelmente devida à diferença em seus tamanhos.
Figura 1: Configuração do respirômetro . (A) Diagrama do plugue do sensor (acima) e da câmara de 50 mL (consistindo de um tubo de Schlenk de 50 mL, abaixo) antes da montagem. Observe os locais das juntas de vidro fosco 19/22 que conectarão a câmara e o plugue do sensor, e que devem ser limpos antes de cada experimento. A torneira, necessária para abrir ou selar a câmara, também é indicada. (B) Diagrama da câmara e dos componentes, montados e prontos para o experimento, mostrando: rolo de algodão úmido, tubo de polipropileno contendo moscas, entupido com rolha de algodão, cartucho de cal sodada e gerador de O2 preenchido com CuSO4. (C) Fotografia da câmara montada. A braçadeira Keck que prende o plugue à câmara é parcialmente obscurecida pela braçadeira do suporte do anel que segura a câmara. (D) Fotografia do controlador mostrando interruptor controlando a corrente através do gerador O2 e janela para visualização do display OLED. (E) Câmaras montadas em banho-maria. Sete câmaras são mostradas, com três contendo mutantes, três com controles de tipo selvagem e uma câmara contendo todos os componentes, exceto moscas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração da aquisição de dados. (A) Interface PuTTY para selecionar a porta serial para aquisição de dados. COM3 foi selecionado, com uma taxa BAUD de 9600 para corresponder à saída do controlador. (B) Interface PuTTY para configurar o arquivo de log. "Saída imprimível" é selecionada para permitir o registro de dados em um arquivo de texto, a pasta de dados é selecionada usando o botão "Procurar" e um nome de arquivo é criado. (C) Arquivo de log PuTTY durante um experimento. Os dados são adquiridos aproximadamente duas vezes por segundo, e cada linha contém as seguintes informações delimitadas por vírgula: Número do sensor, tempo (ms) desde o início da aquisição, temperatura da câmara (°C), pressão da câmara (hPa), umidade (porcentagem relativa) e corrente (mA). (D) Registro de dados durante um experimento típico, com sete janelas para câmaras experimentais, mais um canal registrando temperatura do banho, temperatura do ar ambiente, pressão e umidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados do microrrespirômetro. (A) Pressão (linha cinza, eixo esquerdo) e corrente através do gerador O2 (linha preta, eixo direito) em uma única câmara respiratória contendo 23 w(ex33) moscas. No início, um pulso de corrente longa é necessário para pressurizar a câmara de ~992 hPa até o limiar OFF de 1017 hPa. À medida que as moscas consumiam O 2, a pressão caía até atingir o limiar ON de 1016 hPa, que ativava a corrente através do gerador de O2, que repressurizava a câmara para 1017 hPa. O processo foi repetido seis vezes neste experimento. (B) Um exemplo de uma câmara com vazamento causada por uma torneira danificada, retirada de uma série diferente de experimentos. A câmara falhou em manter a pressão (linha cinza), resultando em ciclagem constante da corrente eletrolítica (linha preta). Observe a escala de tempo diferente do painel A. (C) Efeito da deriva na umidade. Oconsumo de 2 mg de joaninha (Hippodamia convergens) na câmara deveria ter produzido um padrão de ciclagem de pressão semelhante à Figura 3A, mas o aumento constante da umidade (linha preta) causou um aumento artifactual da pressão da câmara (linha cinza) que mascarou o VO2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados quantitativos do mutante selvagem e CASK D. melanogaster. (A) VO2 específico em massa para moscas selvagens (w(ex33)) e mutantes (CASKΔ18). Em todas as parcelas, o fundo e o topo das caixas indicam o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente, os bigodes indicam valores extremos, e os tamanhos de amostra (número de câmaras, cada uma contendo 17-24 moscas) são dados entre parênteses acima dos genótipos. As moscas CASK Δ18 não são estatisticamente diferentes do ex33 (mediana: ex33: 3,420 mL·g-1·h-1, CASKΔ18: 3,029 mL·g-1·h-1; p = 0,08 teste u de Mann-Whitney). (B) VO2 específico para moscas. As moscas CASK Δ18consumiram significativamente menos O 2 (mediana 1,650 mL·mosca-1·h-1) do que w(ex33) (2,078 mL·mosca-1·h-1; p = 0,0003, teste u de Mann-Whitney; significância indicada por asteriscos). (C) A massa diferiu entre o CASKΔ18 e o wildtype (mediana: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, teste u de Mann-Whitney; significância indicada por asteriscos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Levantamento de dados de respirometria de Drosophila de moscas selvagens a 25 °C. Com exceção18, os estudos limitam-se àqueles que medem o consumo deO2 . Na maioria dos casos, foi necessário estimar VO2 a partir de gráficos, e os números das figuras dos artigos originais são fornecidos. Embora todos os genótipos tenham sido considerados "selvagens", as fontes e os métodos de propagação variaram. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O procedimento acima demonstra a medição do consumo de O2 em D. Melanogaster usando um microrrespirômetro coulométrico eletrônico. Os dados resultantes para o consumo de O2 em D. melanogaster selvagem estavam dentro dos intervalos descritos na maioria das publicações anteriores usando diversos métodos (Tabela 1), embora um pouco menores do que os relatados por outros 3,6.
As etapas críticas atenderam aos dois requisitos absolutos do método: vedação estanque ao gás e estabilidade ambiental. Manter um ambiente estanque ao gás é simples, mas requer cuidados. Os frascos e tubos Schlenk são ideais como câmaras de respirometria. A construção em vidro evita a permeabilidade ao gás presente em muitos tipos de plástico19, o que é especialmente crítico em experimentos prolongados. As juntas padrão permitem conexões estanques com os plugues que contêm os sensores e conexões eletrônicas. As torneiras fornecem vedações confiáveis e podem ser abertas ou fechadas conforme necessário durante os experimentos. Para garantir vedações estanques, as torneiras foram inspecionadas, as juntas foram limpas minuciosamente, quantidades criteriosas de graxa de silicone limpa foram aplicadas e as juntas foram fixadas com grampos Keck.
A sensibilidade do método é limitada pela estabilidade da temperatura e umidade dentro da câmara. Mudanças em ambos os parâmetros resultarão em flutuações de pressão que interferem no sinal VO2 . O uso de uma câmara ambiental12 ou banho-maria circulante proporciona um controle de temperatura mais estável. Trabalhos anteriores de outros demonstraram que o método pode medir o consumo de O2 no nível de nmol·h-1 quando a temperatura foi mantida dentro de ±0,01 °C20. Para estabilizar a umidade, pedaços de rolo de algodão imersos em água mantiveram a umidade em quase 100%. A temperatura e a umidade foram estabilizadas por pelo menos 90 min antes que as câmaras fossem pressurizadas com O2 gerado eletroliticamente e os registros começassem. Todos os experimentos incluíram uma câmara que foi montada com todos os componentes, mas não continha moscas, a fim de monitorar as condições ambientais.
Monitorar constantemente a temperatura, pressão e umidade regularmente simplifica muito a solução de problemas. Por exemplo, o V O2 aparente artificialmente elevado causado por uma torneira danificada (Figura 3B) ou a aparente perda de VO2 devido à umidade instável da câmara (Figura 3C) puderam ser detectados e corrigidos.
O microrrespirômetro coulométrico aqui descrito apresenta diversas vantagens. Primeiro, é relativamente barato, com um custo total aproximado de US $ 100 por canal (compreendendo câmara, sensor e controlador). Em segundo lugar, como cada canal adquire e transmite dados de forma independente, o sistema é escalável, com o número de câmaras limitado apenas pelo tamanho do controlador ambiental (banho de água ou câmara ambiental) e pelo número de portas USB disponíveis no computador (geralmente expansível até >100). Além disso, como as câmaras e os controladores são independentes, a falha de qualquer um deles não afetará os outros. Em terceiro lugar, os controladores podem ser facilmente reprogramados para se adaptarem à pressão ambiente ou para ajustar a sensibilidade conforme necessário. Relacionado a isso, a pressão dentro das câmaras é ajustada para um valor fixo, de modo que a pressão experimental será constante ao longo dos experimentos, independentemente da pressão barométrica ambiente. Quarto, o fluxo constante de dados sobre tempo, temperatura, pressão, umidade e corrente permite a análise detalhada desses parâmetros para cada câmara, facilitando a solução de problemas ou análise de mudanças temporais em VO2 em experimentos mais longos. Finalmente, as condições ambientais dentro da câmara podem ser mantidas em um nível constante por muitas horas ou dias, porque o O2 consumido é continuamente substituído. No presente estudo, a pressão de câmara oscilou de 1016 a 1017 hPa, que é inferior a 0,1%, com a variação resultante do PO2 sendo menor que 0,5%. Com base na quantidade de CuSO4 em cada gerador de O2, que pode gerar 28 mL de O 2, e na média de VO2 dos grupos de moscas neste estudo, 1,15 mL/dia (média = 21,8 moscas por câmara), a taxa metabólica pode ser estudada por até 24 dias de cada vez. Supondo que as moscas recebam nutrição adequada, isso significa que o metabolismo pode ser estudado continuamente durante a maior parte da vida de uma mosca.
Atualmente, a maioria dos estudos de metabolismo em D. melanogaster é baseada em análise gasosa ou manometria. Métodos que dependem da análise de gases, como respirômetros stop-flow e fluxo contínuo 2,3,6, têm a vantagem de que o método está bem estabelecido e os equipamentos estão disponíveis comercialmente. No entanto, eles exigem equipamentos caros e complexos, incluindo coletores e sensores de fluxo molecular para regular o fluxo, e analisadores de gás para medir as concentrações de gás. Alternativamente, os manômetros simples9 são muito mais baratos. Na forma mais simples, comumente usada para D. melanogaster, as moscas são anestesiadas e colocadas em uma pequena câmara que contém material absorvente de CO2 e que é conectada a um reservatório de fluido por um tubo capilar. À medida que o O 2 é consumido, e o CO2 resultante absorvido, a pressão cai na câmara, que atrai o fluido para o tubo capilar. A altura do fluido é então proporcional à quantidade de O2 consumida. Como o O2 consumido não é reposto durante o experimento, o PO2 diminui continuamente ao longo do experimento. Embora experimentos de rotina possam não reduzir o P O2 o suficiente para afetar negativamente o V O2, experimentos prolongados ou experimentos em temperaturas elevadas podem esgotar o O2 e atingir o P O2 crítico no qual o V O2 diminui acentuadamente3. Outra questão é que o peso do fluido no capilar exerce uma força descendente, reduzindo a altura do fluido na proporção da força descendente exercida, resultando em possíveis erros. Métodos para compensar esse efeito têm sido descritos 4,21, mas são complicados e não estão em uso generalizado. A comparação direta entre a análise de gases e a manometria indicou que os dois métodos produziram resultados significativamente diferentes, mas os autores não conseguiram produzir uma explicação satisfatória para a dicrepância22.
Apesar de suas vantagens, o microrrespirômetro coulométrico também apresenta limitações. Primeiro, ao contrário de alguns sistemas de análise de gases stop-flow, ele não está disponível comercialmente. Os componentes são de fácil aquisição e nem o projeto nem a programação são complicados, mas é potencialmente mais complexo de construir do que os sistemas manométricos simples9. Em segundo lugar, a aquisição de dados precisos deve incluir vários ciclos de geração de O2 , de modo que cada experimento deve durar várias horas. Isso também é verdade para experimentos usando manometria. Finalmente, novamente como a manometria, a temperatura e a umidade dentro das câmaras devem ser estáveis. No entanto, o microrrespirômetro coulométrico oferece um meio termo em relação ao custo e à complexidade, é robusto e confiável uma vez montado e mede o consumo de O2 com precisão.
Os experimentos com mutantes CASKΔ18 demonstram resultados negativos (VO2 específico para massa) e positivos (VO2 específico para mosca). Se a redução de >50% na marcha dos mutantes CASK Δ18resultasse do comprometimento do metabolismo, poder-se-ia prever que o VO2 seria reduzido em quantidade semelhante. No entanto, a mudança no consumo específico de massa de O2 foi modesta (redução de 9,6% na mediana VO2), e não estatisticamente significativa. Esse resultado negativo é consistente com mutantes CASKΔ18 com metabolismo relativamente normal, com fenótipo comportamental resultante da diminuição do drive locomotor. Embora seja possível que o método não tenha sensibilidade suficiente, a redução do VO2 causada por uma diferença relativamente pequena no tamanho (redução de 15,5% na massa mediana) foi altamente significativa.
A caminhada está associada a um gasto energético significativamente aumentado 5,23, então por que a VO2 é relativamente normal em mutantes CARSK? É possível que essa limpeza excessiva em mutantes CASK16 possa contrabalançar a redução da marcha, ou que o fenótipo de marcha seja menos aparente quando as moscas são testadas em grupos em pequenos tubos, mas essas hipóteses aguardam verificação experimental. No entanto, concluímos que mutações no locus CASK não têm efeitos fortes e diretos sobre o metabolismo, e que o microrrespirômetro coulométrico é uma ferramenta eficaz para estudar o metabolismo em D. melanogaster.
Como este aparelho é facilmente construído a partir de componentes comuns, mede o consumo de O2 com precisão, é altamente portátil, pode ser usado em qualquer ambiente com temperatura estável e tem sido usado com organismos tão pequenos quanto 0,5 mg de moscas (o presente estudo) e tão grandes quanto 500 mg de escorpiões (DJS inédito), ele adiciona uma ferramenta versátil para estudar o metabolismo de diversos organismos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos à Dra. Linda Restifo da Universidade do Arizona por sugerir testar o consumo de O2 de mutantes CASK e por enviar mutantes CASK e seus controles congênicos. As taxas de publicação foram fornecidas pelo Fundo de Reinvestimento Departamental do Departamento de Biologia da Universidade de College Park. O espaço e alguns equipamentos foram fornecidos pelas Universidades de Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
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