Summary
Coulometrisk respirometri er ideell for å måle metabolismen av små organismer. Når det ble tilpasset for Drosophila melanogaster i denne studien, var målt O2-forbruk innenfor området rapportert for villtype D. melanogaster ved tidligere studier. Per-fly O2-forbruket av CASK mutanter, som er mindre og mindre aktive, var betydelig lavere enn villtypen.
Abstract
Coulometrisk mikrorespirometri er en enkel, billig metode for å måleO2-forbruket av små organismer samtidig som det opprettholdes et stabilt miljø. Et coulometrisk mikrorespirometer består av et lufttett kammer hvor O2 forbrukes ogCO2 produsert av organismen fjernes av et absorberende medium. Den resulterende trykkreduksjonen utløser elektrolytisk O2-produksjon, og mengdenO2 som produseres måles ved å registrere mengden ladning som brukes til å generere den. I denne studien har metoden blitt tilpasset Drosophila melanogaster testet i små grupper, med følsomheten til apparatet og miljøforholdene optimalisert for høy stabilitet. Mengden O2 konsumert av villtypefluer i dette apparatet er i samsvar med det som er målt av tidligere studier. MassespesifiktO2-forbruk av CASK mutanter, som er mindre og kjent for å være mindre aktive, var ikke forskjellig fra kongene kontroller. Den lille størrelsen på CASK mutanter resulterte imidlertid i en betydelig reduksjon i O2 -forbruket per fly. Derfor er mikrorespirometeret i stand til å måle O2 forbruk i D. melanogaster, kan skille beskjedne forskjeller mellom genotyper, og legger til et allsidig verktøy for måling av metabolske hastigheter.
Introduction
Evnen til å måle metabolsk hastighet er avgjørende for en fullstendig forståelse av en organisme i sin miljømessige sammenheng. For eksempel er det nødvendig å måle metabolsk hastighet for å forstå sin rolle i levetid1, diettens rolle i metabolisme2 eller terskelen for hypoksisk stress3.
Det er to generelle tilnærminger til å måle metabolsk hastighet:4. Direkte kalorimetri måler energiforbruket direkte ved å måle varmeproduksjon. Indirekte kalorimetri måler energiproduksjon på andre måter, ofte via respirometrisk måling av O2-forbruk (VO2), CO2 -produksjon eller begge deler. Selv om direkte kalorimetri har blitt brukt på små ektotermer, inkludert Drosophila melanogaster5, er respirometri teknisk enklere og mer vanlig brukt.
Flere former for respirometri har blitt brukt med hell for å måle metabolsk hastighet i villtype og mutant D. melanogaster og har gitt innsikt i metabolske effekter av temperatur6, sosialt miljø 3, kosthold 3,7 og nevroutviklingsforstyrrelser8. Disse faller inn i to klasser, som varierer betydelig i kostnad og kompleksitet. Manometri er den enkleste og minst kostbare 9,10, hvor fluer plasseres i et forseglet kammer som inneholder en CO 2 -absorberende og som er forbundet via en tynn kapillær til et væskereservoar. NårO2 forbrukes og CO2 absorberes, reduseres trykket i kammeret og væske trekkes inn i kapillæren. Det væskefylte volumet av kapillæren er derfor proporsjonalt med VO2. Mer forseggjorte versjoner, som kompenserer for kraften som utøves av væsken i kapillæren, har også blitt brukt på D. melanogaster1. Manometri har fordelene ved å være enkel og billig, men fordi den er følsom for trykk, krever det konstante miljøforhold. Videre, fordi konsumert O2 ikke erstattes, reduseres partialtrykket av O2 (PO2) gradvis inne i kamrene.
Respirometri ved hjelp av gassanalyse brukes også regelmessig for D. melanogaster. I dette tilfellet blir gasser samplet med jevne mellomrom fra forseglede kamre som inneholder fluer og sendt til en infrarød analysator 2,6,11. Denne typen apparater har fordelene at den er tilgjengelig kommersielt, er mindre følsom for miljøforhold, og gasser oppdateres under prøvetaking slik at PO2 forblir stabil. Utstyret kan imidlertid være dyrt og komplisert å betjene.
Et nylig utviklet coulometrisk mikrorespirometer12 gir et billig, følsomt og stabilt alternativ til eksisterende systemer. I praksis plasseres en organisme i et lufttett kammer hvor den forbrukerO2 og utåndet CO2 fjernes av et absorberende materiale, noe som resulterer i en netto reduksjon i kammertrykket. Når det indre trykket synker til en forhåndsinnstilt terskel (ON-terskel), føres strøm gjennom en elektrolytiskO2-generator, og returnerer trykket til en andre terskel (OFF-terskel) som stopper elektrolyse. Ladningsoverføring over O 2-generatoren er direkte proporsjonal med mengden O 2 som kreves for å trykke kammeret på nytt og kan derfor brukes til å måle O2 som forbrukes av organismen4. Metoden er svært følsom, måler V O2 nøyaktig, og regelmessig erstatning av O2 kan opprettholde PO2 på et nesten konstant nivå i timer eller dager.
Det coulometrisk mikrorespirometeret som ble brukt i denne studien, bruker en multimodal (trykk, temperatur og fuktighet) elektronisk sensor. Sensoren drives av en mikrokontroller som oppdager små endringer i trykk og aktiverer O2-generasjon når en lavtrykksterskel er nådd12. Dette apparatet er satt sammen fra hyllevaredeler, kan brukes med et bredt utvalg av kamre og eksperimentelle miljøer, og har blitt brukt med hell for å undersøke effekten av kroppsmasse og temperatur på billen Tenebrio molitor. I denne studien har mikrorespirometeret blitt tilpasset for å måleO2-forbruket i D. melanogaster, som har omtrent 1% av massen av T. molitor. Følsomheten til apparatet er økt ved å redusere terskelen for aktivering avO2-generasjon , og miljøstabiliteten er forbedret ved å utføre eksperimenter i et temperaturkontrollert vannbad og ved å opprettholde fuktighet inne i kamrene på eller nær 100%.
CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) proteinet, en del av familien av membranassosierte guanylatkinaser (MAGUK), er et molekylært stillas i forskjellige multiproteinkomplekser, og mutasjoner i CASK er assosiert med nevroutviklingsforstyrrelser hos mennesker og i D. melanogaster13,14. En levedyktig D. melanogaster mutant, CASKΔ18, forstyrrer aktiviteten til dopaminerge nevroner 15 og reduserer aktivitetsnivået med mer enn 50% sammenlignet med kongene kontroller14,16. På grunn av det reduserte aktivitetsnivået til CASK mutanter og katekolaminers rolle i regulering av metabolisme17 antydet vi at deres standard metabolske hastighet, og derforO2-forbruk, ville bli dramatisk redusert sammenlignet med kontroller.
O2 forbruk ble målt i CASKΔ18 og deres wildtype congeners, w (ex33). Grupper av fluer ble plassert i respirometrikamre, O 2 forbruk ble målt, O2 forbruk ble beregnet og uttrykt både på massespesifikk og per fly basis. Apparatet registrerte VO2 i villtypefluer som var i samsvar med tidligere studier, og det kunne skille mellom per fly O2-forbruk av villtype og CASK mutantfluer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flueoppdrett og innsamling
- Hold fluene oppe ved 25 °C i smale hetteglass som inneholder standard Drosophila-mat .
MERK: Prøvestørrelsen for hver genotype skal bestå av minst ni replikater, hver bestående av et enkelt respirometerkammer som inneholder 15-25 fluer, satt opp som beskrevet nedenfor. - Overfør fluene hver 2-3 dager.
- Bedøv fluer med CO2, samle grupper på 15-25 hanner av hver genotype, og plasser hver gruppe i ferske, unyeastede matflasker.
MERK: Hannene ble brukt til å redusere variabiliteten på grunn av reproduksjonsstatus. Metoden gjelder for begge kjønn. - La fluene komme seg ved 25 °C i minst 24 timer.
MERK: Ved forsøkstidspunktet skal fluer være 1-4 dager gamle. Frekvensen av samlinger beskrevet i trinn 1.3 kan stilles inn for å begrense aldersområdet til fluene.
2. Oppsett og montering av respirometerkammer
- Slå på vannbadet og sett det til ønsket temperatur for eksperimentet.
MERK: Eksperimentene nedenfor ble utført ved 25 °C med 50 ml Schlenk-rør som kamre. Komponenter skal monteres som vist i figur 1A, 1B og 1C. - Rengjør de malte glassskjøtene på kamrene og sensorpluggene grundig ved å spraye 70 % etanol på en laboratorieserviett (ikke direkte på skjøten) og tørke av støv og gammelt fett fra sensorpluggen (figur 1A). Tørk av etanol med en ny laboratorieserviett.
- Plasser 1 cm stykke bomullsrull dynket i renset vann i bunnen av kammeret for å stabilisere fuktigheten.
- Tilsett nok vann (~0,5 ml) til å danne et lite basseng i bunnen av bomullsrullen.
- Tørk av vann som har sølt på kammerets ledd.
- Overfør fluene til merkede polypropylenrør ved hjelp av en trakt.
- Plugg røret med en bomullsrull.
MERK: Rør består av et 5 ml polypropylen reagensrør, trimmet til 5,5 cm i lengde og perforert med en varm kniv for å tillate fri utveksling av luft med eksperimentelt kammer. CO2 anestesi er kjent for å forårsake metabolske abnormiteter, slik at fluer overføres uten anestesi som krever mer forsiktighet for å unngå å miste fluene.
- Plugg røret med en bomullsrull.
- Legg til ett ventilert rør med fluer i hvert respirometerkammer (på toppen av våt bomull).
- Fyll brus kalkpatroner (4-5 pellets per tube) og legg dem på toppen av røret som inneholder fluer inne i kammeret.
MERK: Soda kalkpatroner består av 800 μL sentrifugerør perforert 4-5 ganger med en kraftdrill. - Fyll O2 generatorer med mettet kobbersulfat (CuSO4) løsning under nivå av luftehull
MERK: O2 generatorer består av skrukork sentrifugerør med 4 hull boret under gjengene. Platinum (Pt) og kobber (Cu) elektroder er loddet til to-pinners kontakt, satt inn i hull boret i hetten og festet med epoksy. Elektrolyse av CuSO4 generererO2 som forbrukes av den eksperimentelle organismen. CuSO4 er giftig for virvelløse dyr, unngå søl eller lekkasje og rydde opp umiddelbart. - Koble den fylte O2-generatoren til to-pinners kontakt på sensorpluggen.
MERK: Kobberkatoden må kobles til den negative utgangen fra kontrolleren og platinanoden til den positive ledningen. Omvendte tilkoblinger vil føre til at eksperimentet mislykkes. - Plasser to små dabs med klart silikonfett på motsatte sider av jordglassskjøten på sensorpluggen.
- Sett pluggen inn i kammeret og roter pluggen (eller kammeret) med moderat trykk for å spre fettet i skjøten.
- Tørk av overflødig fett med en laboratorieserviett.
- Snap plast Keck klemmer på skjøter for å sikre plugger i kamre. Det monterte kammeret skal se ut som figur 1C.
- Gjenta trinnene ovenfor for antall kamre som brukes til dagens eksperiment.
MERK: Antall kamre som kan registreres, er begrenset av antall tilgjengelige kamre, kontrollere og USB-innganger til datamaskinen. For de nåværende forsøkene ble syv kamre normalt kjørt parallelt. Eksperimentelle fluer som mutanter bør matches med passende kontroller. Et kammer som er satt opp identisk, men uten fluer, bør inkluderes i hvert forsøk som en kontroll for miljøvariasjon. Kamre som inneholder forskjellige behandlinger (mutant, wildtype, no-fly) bør roteres mellom eksperimenter. - Plasser monterte kamre i et stativ i vannbadet med stoppekraner åpne (figur 1E).
MERK: For å unngå sirkadisk variasjon ble kamrene plassert i badekaret mellom 9:30 og 9:50 for alle eksperimenter beskrevet her. - La stoppekranene være åpne (Hold håndtaket parallelt med stoppekranen).
MERK: Vær forsiktig så du ikke lar vann komme inn i stoppekranene. - La kamrene balansere med stoppekraner åpne i ca. 30 min.
MERK: Mens kammeret er likevektig, kobler du til elektronikken og setter opp datainnsamling som beskrevet nedenfor.
3. Sette opp kontrollere og datamaskin
- Forsikre deg om at bryterne som leverer strøm til O2-generatorene er i AV-stilling (vekk fra kontakten; Figur 1D).
- Koble hver kontrollerboks til en tilgjengelig USB-port (Universal serial bus).
MERK: Konstruksjon og programmering av styringsenheter beskrevet andre steder12. - Koble kontrollere til respirometerkamre ved hjelp av 6-lederkabler.
- Kontroller at OLED-skjermene (organic light emitting diode) på kontrollerne (figur 1D) viser miljøparametere.
- Slå kort på O2-generatorer ved hjelp av bryteren på kontrolleren (figur 1D).
- Hvis den nåværende verdien øker fra null til mellom 35 og 55 mA, er kontrolleren og kammeret klare for eksperimenter.
- Fastslå hvilke COM-porter som brukes av kontrollerne, som beskrevet nedenfor.
- Klikk på Start-ikonet i Microsoft Windows.
- Klikk på Innstillinger-ikonet .
- Klikk på Bluetooth og enheter.
- Kontroller at kontrollerne og deres COM-porter vises i listen over enheter.
- Åpne PuTTY på skrivebordet og sett opp en loggfil for hver kanal i respirometeret som beskrevet nedenfor.
MERK: PuTTY er et gratis sikkert skall og telnet-klient som brukes til å overføre data til datamaskinen via COM-porter.- Velg COM-port for en kontroller ved å skrive inn portens nummer i boksen "Serial line" (figur 2A).
- Klikk på Logging.
- Velg Utskriftsvennlig utdata under "Øktlogging" (figur 2B).
- Under Loggfilnavn klikker du Bla gjennom.
- I valgmappen oppretter du et filnavn som inneholder beskrivende informasjon (f.eks. dato, art, COM-portnummer).
- Klikk på Lagre.
- Klikk Åpne. Det åpnes et vindu som viser kommadelte data som logges (figur 2C).
- Gjenta dette for alle andre kontrollere som er i bruk for eksperimentet. Inndata til hver COM-port vises som et separat vindu (figur 2D).
4. Kjører eksperimenter
- Når kamrene har likevekt i 30 minutter, forsegl dem ved å lukke stoppekraner.
- Dekk badekaret og kamrene med en polystyrenskumboks for å opprettholde et stabilt miljø.
- Tillat å balansere i en annen time.
- Slå på strømmen til O 2-generatoren i hvert kammer ved hjelp av bryteren på kontrollerboksen.
- Når O2-generatorene er aktivert, må du sørge for at trykket øker til forhåndsinnstilt AV-trykk.
MERK: 1017 hPa, som er litt over atmosfærisk trykk, ble brukt som "AV" -trykk i denne serien av eksperimenter. Retur til omgivelsestrykket vil indikere lekkasje av gass fra kamrene. Videre tillater det samme trykket å bli brukt på tvers av eksperimenter uavhengig av omgivende barometertrykk. "ON" -trykket var 1016 hPa, noe som betyr at trykket bare trengte å falle 1 hPa før O2-generatoren ble aktivert. Dette ga tilstrekkelig sensitivitet for å måleO2-forbruk i Drosophila. Når et kammer er trykket til "AV" -innstillingen, bør strømmen falle til null. - La eksperimentet gå i 3 eller flere timer.
MERK: Høyere VO2 ved høye temperaturer kan tillate kortere eksperimenttider. Overvåk av og til for å sikre at utstyret fungerer, men unngå overdreven aktivitet nær kamrene som kan påvirke temperaturstabiliteten.
5. Etterbehandling av eksperimentet
- Slå av O2 generatorer på alle kontrollere.
MERK: Gjør først for å unngå å kjøre O2-generatorene mens kamrene er åpne. - Åpne stoppekranene for å fjerne forseglingen av kamrene.
- La PuTTY-vinduene stå åpne i ytterligere 5-15 minutter for å gi en endelig grunnlinje.
- Lukk PuTTY-vinduet for hver kontroller, og avslutt opptakene.
MERK: Alle eksperimenter ble avsluttet mellom 16:50 og 17:10. - Koble sensorer fra kabler.
- Flytt kamre til tørt stativ.
- Fjern én sensorplugg om gangen fra kamrene.
- Koble fra O2-generatorene og plasser dem i rørstativet.
- Tørk fett av sensorpluggen og oppbevar den i stativet.
- Rengjør fett fra kammerleddene og fjern rørene med fluer og bruskalk.
- Bedøve fluer i hvert rør med CO2, trykk på en vektbåt og veie på en mikrovekt.
- Logg vekt og antall fluer for hvert rør.
- Kast fluer eller sett dem til side for ytterligere prosedyrer.
- Dump bruskalk fra patroner i avfallsbeholderen.
- Åpne O2-generatoren og kast CuSO4-løsningen i avfallsbeholderen.
- Skyll elektroder og rør med renset vann.
- Plasser rørstativene for tørking.
6. Analyse av ladeoverføringsdata
- Importer data som kommadelt tekst til et regneark, der hver post består av et eget regneark.
- Registrer gjeldende og tidsdata for hver puls av O 2-generatoren. Start med den første pulsen etter at kammeret var trykket, registrer starttid og sluttidspunkt (som radnummer) for hver gjeldende puls. Det er radnummeret når strømmen går over null (vanligvis til omtrent 45-50 mA) til den siste raden som er over null.
- Lag en tabell i regnearket for å registrere følgende data:
- Den gjennomsnittlige strømamplituden under pulsen: = GJENNOMSNITT([første rad med puls]:[siste rad med puls]) for hver puls (fra gjeldende kolonne).
- Pulsvarighet: ([Siste rad med puls] - [første rad med puls[-en rad]])/1000 for hver puls (fra klokkeslettet i millisekunder-kolonnen).
- Total eksperimenttid: [tid ved starten av siste puls] - [tid ved slutten av første puls etter trykksatt kammer] (fra kolonnen tid i minutter).
- Beregn deretter ladeoverføring (Q) for hver puls (gjennomsnittlig nåværende X-varighet)
- Sum ladningen fra alle pulser for å beregne total ladning (Qtot).
7. Analyse av O2 forbruk
- Sett opp et nytt regneark for alle dataene, og skriv inn eller beregn følgende for hvert kammer:
- Qtot (total kostnad)
- Føflekker (= Q ÷ 96485 × 4)
- mlO2 (= føflekker × 22413 ml/mol)
- Total tid (fra dataanalysen ovenfor)
- ml min-1 (= mlO2 ÷ total tid)
- Vekt i gram (fluer bedøvet og veid målt etter forsøket)
- ml min-1 g-1 (= ml min-1 ÷ vekt i gram)
- ml/t/g (ovenfor × 60)
- mg/fly (= vekt av fluer ÷ antall fluer)
- μL fly-1 h-1 (= (ml min-1 × 3600) ÷ antall fluer).
- Tabulatdata for hver behandling (f.eks. genotype)
- Sammenlign behandlinger med ANOVA, t-test eller Mann-Whitney u-test 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trykket og strømutgangen til respirometerkontrolleren er vist for ett kammer i ett eksperiment i figur 3A. Den første, lange strømpulsen trykket kammeret fra omgivelsestrykk (ca. 992 hPa) til den forhåndsinnstilte AV-terskelen på 1017 hPa. Etter hvert som fluene konsumerte O 2 og CO 2 ble absorbert, ble trykket redusert sakte til det nådde ON-terskelen på 1016 hPa, som aktiverte strøm gjennom O 2-generatoren. I eksemplet som er vist, er gjennomsnittlig amplitude for hver puls 50,1 mA, varigheten er 16,1 s, noe som gir en ladningsoverføring på ca. 0,81 coulomb (C) per puls. Den totale ladningsoverføringen for dette kammeret var 3,28 C over en total tid på 240,0 min. Ved hjelp av beregningene beskrevet i Prosedyrer med masse og antall fluer (23 fluer som veier 14,9 mg totalt), var O 2 forbruk for gruppen i dette kammeret 3,19 ml h-1 g-1 eller2,07 μL h-1 fly-1.
Utstyret kan settes opp enkelt, med et minimum av opplæring, og fungerer pålitelig i mange sykluser med montering og avslutning. Utstyret må likevel vedlikeholdes og inspiseres regelmessig, og forsøksforholdene må kontrolleres nøye. For eksempel kan tap av en gasstett tetning, på grunn av svikt i en ledd eller stoppekran, føre til raske trykksykluser og spuriously høy VO2 (figur 3B). I tillegg må temperatur og fuktighet forbli stabil inne i kammeret. Hvis temperaturen eller fuktigheten synker, vil det resulterende trykkfallet tolkes feilaktig som en O2 som forbrukes. Omvendt vil oppadgående drift i temperatur eller fuktighet motvirke trykkreduksjonen forårsaket av O2-forbruk , og kunstig redusere eller eliminere VO2-signalet (figur 3C).
Metoden ble brukt til å teste VO2 av CASKΔ18 mutanter, som ble generert ved upresis eksisjon av et transponerbart element fra CASK locus 14, og hvor bevegelse reduseres drastisk14,16. I villtype w(ex33)-kontroller, generert ved presis eksisjon av det transponerbare elementet, var gjennomsnittlig massespesifiktO2-forbruk 3,65 ± 0,24 ml·g-1·h-1 (n = 16 kamre; Figur 4A).
Til tross for synlig redusert bevegelse var CASKΔ18 mutantenes VO2 litt, men ikke signifikant lavere enn hos kontrollpersonene (gjennomsnittlig ± s.e.m. = 3,23 ± 0,13 ml·g-1·h-1; n = 11 grupper; P = 0,08 Mann-Whitney u-test).
Fordi gyldigheten av å uttrykke metabolsk hastighet i form av kroppsmasse har blitt stilt spørsmål ved18, bleO2-forbruket også analysert per fly (figur 4B). Ved hjelp av denne analysen ble VO2 signifikant redusert i CASKΔ18 sammenlignet med villtypekontroller (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·h-1; CASKΔ18: 1,58 ± 0,10 μL·fly-1·h-1; P = 0,0003, Mann-Whitney u-test). Gjennomsnittlig masse av CASKΔ18-fluer var imidlertid >20 % lavere enn for ex33-kontroller (figur 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; CASKΔ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, Mann-Whitney u-test), så forskjellen i metabolsk hastighet mellom genotyper skyldes sannsynligvis forskjellen i størrelse.
Figur 1: Oppsett av respirometer . (A) Diagram over sensorplugg (over) og 50 ml kammer (bestående av et 50 ml Schlenk-rør under) før montering. Legg merke til plasseringen av 19/22 jordglassfugene som skal koble kammeret og sensorpluggen, og som må rengjøres før hvert eksperiment. Stoppekranen, som er nødvendig for å åpne eller forsegle kammeret, er også indikert. (B) Diagram over kammer og komponenter, montert og klar for forsøket, som viser: våt bomullsrull, polypropylenrør som inneholder fluer, plugget med en bomullstopper, brus-kalkpatron og O2 generator fylt med CuSO4. (C) Fotografi av det samlede kammeret. Keck-klemmen som fester pluggen til kammeret, er delvis skjult av ringstativklemmen som holder kammeret. (D) Fotografi av kontroller som viser bryter som styrer strøm gjennom O2-generator og vindu for visning av OLED-skjerm. (E) Monterte kamre i et vannbad. Syv kamre er vist, med tre som inneholder mutanter, tre med villtypekontroller og ett kammer som inneholder alle komponenter unntatt fluer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av datainnsamling. (A) PuTTY-grensesnitt for valg av seriell port for datainnsamling. COM3 er valgt, med en BAUD-hastighet på 9600 for å matche utgangen til kontrolleren. (B) PuTTY-grensesnitt for å sette opp loggfil. "Utskriftsvennlig utgang" er valgt for å aktivere logging av data til en tekstfil, datamappe velges ved hjelp av "Bla gjennom" -knappen, og et filnavn opprettes. (C) PuTTY-loggfil under et eksperiment. Data samles inn omtrent to ganger per sekund, og hver linje inneholder følgende kommadelte opplysninger: Sensornummer, tid (ms) siden begynnelsen av innsamlingen, kammertemperatur (°C), kammertrykk (hPa), fuktighet (prosent relativ) og strøm (mA). (D) Datalogging under et typisk eksperiment, med syv vinduer for eksperimentelle kamre, pluss en kanal som registrerer badetemperatur, omgivelsestemperatur, trykk og fuktighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Data fra mikrorespirometer. (A) Trykk (grå linje, venstre akse) og strøm over O 2-generatoren (svart linje, høyre akse) i et enkelt respirometerkammer som inneholder 23 w (ex33) fluer. I begynnelsen er det nødvendig med en lang strømpuls for å trykke kammeret fra ~ 992 hPa til AV-terskelen på 1017 hPa. Da fluene konsumerte O 2, falt trykket til det nådde ON-terskelen på 1016 hPa, som aktiverte strøm gjennom O2-generatoren, som trykket kammeret til 1017 hPa. Prosessen ble gjentatt seks ganger i dette eksperimentet. (B) Et eksempel på et lekkende kammer forårsaket av en skadet stoppekran, hentet fra en annen serie eksperimenter. Kammeret klarte ikke å opprettholde trykket (grå linje), noe som resulterte i konstant sykling av elektrolyttstrøm (svart linje). Legg merke til en annen tidsskala enn panel A. (C) Effekt av drift i fuktighet. O2-forbruket av 20 mg ladybille (Hippodamia convergens) i kammeret burde ha produsert et sykkelmønster av trykk som ligner på figur 3A, men den jevne økningen i fuktighet (svart linje) forårsaket en kunstig økning i kammertrykk (grå linje) som maskerte VO2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantitative data fra villtype og CASK mutant D. melanogaster. (A) Massespesifikk VO2 for villtype (w(ex33)) og mutant (CASKΔ18) fluer. I alle plott angir bunner og topper av bokser henholdsvis første og tredje kvartil, værhår indikerer ekstremverdier, og utvalgsstørrelsene (antall kamre, hver med 17-24 fluer) er gitt i parentes over genotypene. CASK Δ18 fluer er ikke statistisk signifikant forskjellig fra ex33 (median: ex33: 3.420 ml·g-1·h-1, CASKΔ18 : 3.029 ml·g-1·h-1; p = 0.08 Mann-Whitney u-test). (B) Fly-spesifikk VO2. CASKΔ18-fluerkonsumerte signifikant mindre O 2 (median 1,650 ml·fly-1·h-1) enn w(ex33) (2,078 ml·fly-1·h-1; p = 0,0003, Mann-Whitney u-test; signifikans angitt med stjerner). (C) Massen var forskjellig mellom CASKΔ18 og villtypen (median: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, Mann-Whitney u-test; signifikans angitt med stjerner). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1. Kartlegging av Drosophila respirometridata fra villtypefluer ved 25 °C. Med ett unntak18 er studiene begrenset til de som målerO2-forbruk . I de fleste tilfeller var det nødvendig å estimere VO2 fra grafer, og figurnummer fra de opprinnelige papirene er gitt. Selv om alle genotyper ble ansett for å være "villtype", varierte kildene og forplantningsmetodene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovennevnte prosedyre viser måling avO2-forbruk i D. Melanogaster ved bruk av et elektronisk coulometrisk mikrorespirometer. De resulterende dataene forO2-forbruk i villtype D. melanogaster var innenfor områdene beskrevet i de fleste tidligere publikasjoner ved bruk av forskjellige metoder (tabell 1), men noe lavere enn det som ble rapportert av andre 3,6.
Kritiske trinn adresserte de to absolutte kravene til metoden: gasstett tetning og miljøstabilitet. Å opprettholde et gasstett miljø er enkelt, men krever omsorg. Schlenk flasker og rør er ideelt egnet som respirometrikamre. Glasskonstruksjon unngår gasspermeabilitet tilstede i mange typer plast19, noe som er spesielt kritisk i langvarige eksperimenter. Standardskjøtene tillater gasstette forbindelser med pluggene som inneholder sensorene og elektroniske tilkoblinger. Stoppekraner gir pålitelige tetninger og kan åpnes eller lukkes etter behov under eksperimenter. For å sikre gasstette tetninger for hvert eksperiment ble stoppekraner inspisert, skjøter ble rengjort grundig, fornuftige mengder rent silikonfett ble påført, og skjøter ble sikret med Keck-klemmer.
Følsomheten til metoden er begrenset av stabiliteten av temperatur og fuktighet i kammeret. Endringer i begge parametrene vil resultere i trykksvingninger som forstyrrer VO2-signalet . Bruk av et miljøkammer12 eller sirkulerende vannbad gir mer stabil temperaturkontroll. Tidligere arbeid av andre har vist at metoden kan måle O2-forbruket på nmol·h-1-nivået når temperaturen ble holdt innenfor ±0,01 °C20. For å stabilisere fuktigheten opprettholdt biter av bomullsrull nedsenket i vann fuktighet på nesten 100%. Temperatur og fuktighet fikk stabilisere seg i minst 90 minutter før kamrene ble trykksatt med elektrolytisk generert O2 og opptakene begynte. Alle eksperimenter inkluderte ett kammer som ble satt sammen med alle komponenter, men ikke inneholdt fluer, for å overvåke miljøforholdene.
Konstant overvåking av temperatur, trykk og fuktighet regelmessig forenkler feilsøking sterkt. For eksempel kunne den kunstig høye tilsynelatende V O2 forårsaket av en skadet stoppekran (figur 3B) eller det tilsynelatende tapet av VO2 på grunn av ustabil kammerfuktighet (figur 3C) detekteres og korrigeres.
Det coulometrisk mikrorespirometeret beskrevet her har flere fordeler. For det første er det relativt billig, med en omtrentlig totalkostnad på $ 100 per kanal (bestående av kammer, sensor og kontroller). For det andre, fordi hver kanal henter og overfører data uavhengig, er systemet skalerbart, med antall kamre bare begrenset av størrelsen på miljøkontrolleren (vannbad eller miljøkammer) og antall tilgjengelige USB-porter i datamaskinen (vanligvis utvidbar til >100). Også fordi kamrene og kontrollørene er uavhengige, vil svikt i noen av dem ikke påvirke de andre. For det tredje kan styreenhetene enkelt omprogrammeres til å tilpasse seg omgivelsestrykket eller justere følsomheten etter behov. Relatert til dette er trykket inne i kamrene satt til en fast verdi, slik at eksperimentelt trykk vil være konstant på tvers av eksperimenter uavhengig av omgivelsesbarometertrykk. For det fjerde tillater den jevne strømmen av data om tid, temperatur, trykk, fuktighet og strøm detaljert analyse av disse parametrene for hvert kammer, noe som letter feilsøking eller analyse av tidsmessige endringer i VO2 i lengre eksperimenter. Endelig kan miljøforholdene inne i kammeret opprettholdes på et konstant nivå i mange timer eller dager, fordi konsumert O2 kontinuerlig erstattes. I denne studien svingte kammertrykket fra 1016 til 1017 hPa, som er mindre enn 0,1%, med den resulterende variasjonen i PO2 mindre enn 0,5%. Basert på mengden CuSO4 i hver O2-generator, som kan generere 28 ml O2, og gjennomsnittlig VO2 for grupper av fluer i denne studien, 1,15 ml / dag (gjennomsnitt = 21,8 fluer per kammer), kan metabolsk hastighet studeres i opptil 24 dager om gangen. Forutsatt at fluene er utstyrt med tilstrekkelig ernæring, betyr dette at metabolisme kan studeres kontinuerlig for det meste av en flues levetid.
For tiden er de fleste studier av metabolisme i D. melanogaster basert på gassanalyse eller manometri. Metoder som baserer seg på gassanalyse, som stop-flow og continuous flow respirometers 2,3,6 har den fordelen at metoden er veletablert og utstyr er tilgjengelig kommersielt. De krever imidlertid dyrt og komplekst utstyr, inkludert manifolder og molekylære strømningssensorer for å regulere strømningen, og gassanalysatorer for å måle gasskonsentrasjoner. Alternativt er enkle manometrelangt billigere. I den enkleste formen, som vanligvis brukes for D. melanogaster, blir fluer bedøvet og plassert i et lite kammer som inneholder CO2 absorberende materiale og som er forbundet med et væskereservoar med et kapillærrør. Når O2 forbrukes, og den resulterendeCO2 absorberes, faller trykket i kammeret, som trekker væske inn i kapillærrøret. Høyden på væsken er da proporsjonal med mengdenO2 som forbrukes. Fordi konsumert O2 ikke erstattes under forsøket, reduseres PO2 kontinuerlig i løpet av forsøket. Selv om rutinemessige eksperimenter kanskje ikke reduserer P O2 tilstrekkelig til å påvirke V O2 negativt, kan langvarige eksperimenter eller eksperimenter ved forhøyede temperaturer tømme O2 og nå den kritiske P O2 hvor V O2 avtar kraftig3. Et annet problem er at vekten av væsken i kapillæren utøver en nedadgående kraft, og reduserer væskens høyde i forhold til den nedadgående kraften som utøves, noe som resulterer i potensielle feil. Metoder for å kompensere for denne effekten er beskrevet 4,21, men er tungvinte og er ikke i utstrakt bruk. Direkte sammenligning av gassanalyse og manometri indikerte at de to metodene ga signifikant forskjellige resultater, men forfatterne kunne ikke gi en tilfredsstillende forklaring på avviket22.
Til tross for fordelene har det coulometrisk mikrorespirometeret også begrensninger. For det første, i motsetning til noen stop-flow gassanalysesystemer, er det ikke kommersielt tilgjengelig. Komponentene er enkle å skaffe og verken design eller programmering er kompliserte, men det er potensielt mer komplekst å konstruere enn de enkle manometriske systemene9. For det andre må oppkjøp av nøyaktige data inkludere flere sykluser av O2-generasjon , så hvert eksperiment må vare i flere timer. Dette gjelder også eksperimenter med manometri. Til slutt, igjen som manometri, må temperatur og fuktighet inne i kamrene være stabil. Ikke desto mindre gir det coulometrisk mikrorespirometeret en middelvei med hensyn til kostnad og kompleksitet, er robust og pålitelig når den er montert, og måler O2 forbruk nøyaktig.
Forsøkene med CASKΔ18 mutanter viser både negative (massespesifikke V O2) og positive resultater (fluespesifikk VO2). Hvis >50% reduksjon i gange av CASKΔ18mutanter skyldes kompromittert metabolisme, kan det forventes at VO2 ville bli redusert med en tilsvarende mengde. Likevel var endringen i massespesifikt O2-forbruk beskjeden (9,6 % reduksjon i median VO2), og ikke statistisk signifikant. Dette negative resultatet er forenlig med at CASKΔ18-mutanter har relativt normal metabolisme, med atferdsfenotypen som følge av redusert lokomotorisk drift. Selv om det er mulig at metoden mangler tilstrekkelig sensitivitet, var reduksjonen av VO2 forårsaket av en relativt liten forskjell i størrelse (15,5% reduksjon i median masse) svært signifikant.
Gange er forbundet med betydelig økt energiforbruk 5,23, så hvorfor er VO2 relativt normalt hos CASK mutanter? Det er mulig at overdreven pelsstell hos CASK mutanter16 kan motvirke reduksjonen i gange, eller at gangfenotypen er mindre synlig når fluer testes i grupper i små rør, men disse hypotesene avventer eksperimentell verifisering. Likevel konkluderer vi med at mutasjoner i CASK locus ikke har sterke, direkte effekter på metabolismen, og at coulometrisk mikrorespirometer er et effektivt verktøy for å studere metabolisme i D. melanogaster.
Fordi dette apparatet er lett konstruert fra vanlige komponenter, måler O2 forbruk nøyaktig, er svært bærbar, kan brukes i ethvert miljø med stabil temperatur, og har blitt brukt med organismer så små som 0,5 mg fluer (denne studien) og så store som 500 mg skorpioner (DJS upublisert), legger det til et allsidig verktøy for å studere metabolismen av ulike organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Linda Restifo ved University of Arizona for å foreslå å testeO2-forbruket av CASK mutanter og for å sende CASK mutanter og deres congenic kontroller. Publiseringsavgifter ble gitt av Departmental Reinvestment Fund fra Biologisk avdeling ved University of College Park. Plass og noe utstyr ble levert av universitetene i Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
