Summary
Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster. Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.
Abstract
Coulometrische microrespirometrie is een eenvoudige, goedkope methode om hetO2-verbruik van kleine organismen te meten met behoud van een stabiele omgeving. Een coulometrische microrespirometer bestaat uit een luchtdichte kamer waarin O 2 wordt verbruikt en de door het organisme geproduceerde CO2 wordt verwijderd door een absorberend medium. De resulterende drukverlaging activeert de elektrolytische O2-productie en de hoeveelheid geproduceerdeO2 wordt gemeten door de hoeveelheid lading te registreren die wordt gebruikt om deze te genereren. In de huidige studie is de methode aangepast aan Drosophila melanogaster getest in kleine groepen, waarbij de gevoeligheid van het apparaat en de omgevingsomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor hoge stabiliteit. De hoeveelheid O2 die door wildtype vliegen in dit apparaat wordt geconsumeerd, komt overeen met die gemeten door eerdere studies. De massaspecifiekeO2-consumptie door vatmutanten, die kleiner zijn en waarvan bekend is dat ze minder actief zijn, verschilde niet van die van congene controles. De kleine omvang van de vatmutanten resulteerde echter in een aanzienlijke vermindering van hetO2-verbruik per vlieg. Daarom is de microrespirometer in staat om hetO2-verbruik in D. melanogaster te meten, bescheiden verschillen tussen genotypen te onderscheiden en een veelzijdig hulpmiddel toe te voegen voor het meten van stofwisselingssnelheden.
Introduction
Het vermogen om de stofwisseling te meten is cruciaal voor een volledig begrip van een organisme in zijn omgevingscontext. Het is bijvoorbeeld noodzakelijk om de stofwisseling te meten om de rol ervan in levensduur1, de rol van voeding in het metabolisme2 of de drempel voor hypoxische stress3 te begrijpen.
Er zijn twee algemene benaderingen voor het meten van de stofwisseling4. Directe calorimetrie meet het energieverbruik rechtstreeks door de warmteproductie te meten. Indirecte calorimetrie meet de energieproductie op andere manieren, vaak via respirometrische meting van het O2-verbruik (VO2), de CO2 -productie of beide. Hoewel directe calorimetrie is toegepast op kleine ectothermen, waaronder Drosophila melanogaster5, is respirometrie technisch eenvoudiger en wordt het vaker gebruikt.
Verschillende vormen van respirometrie zijn met succes gebruikt om de stofwisseling te meten bij wildtype en mutant D. melanogaster en hebben inzicht gegeven in de metabole effecten van temperatuur6, sociale omgeving 3, voeding 3,7 en neurologische ontwikkelingsstoornissen8. Deze vallen uiteen in twee klassen, die aanzienlijk variëren in kosten en complexiteit. Manometrie is de eenvoudigste en goedkoopste9,10, waarbij vliegen in een afgesloten kamer worden geplaatst die een CO2 -absorberend middel bevat en die via een dun capillair is verbonden met een vloeistofreservoir. Naarmate O 2 wordt verbruikt en CO2 wordt geabsorbeerd, neemt de druk in de kamer af en wordt vloeistof in het capillair gezogen. Het met vloeistof gevulde volume van het capillair is daarom evenredig met VO2. Meer uitgebreide versies, die de kracht compenseren die door de vloeistof in het capillair wordt uitgeoefend, zijn ook gebruikt op D. melanogaster1. Manometrie heeft het voordeel dat het eenvoudig en goedkoop is, maar omdat het gevoelig is voor druk, vereist het constante omgevingsomstandigheden. Verder, omdat verbruikt O 2 niet wordt vervangen, neemt de partiële druk van O2 (PO2) geleidelijk af in de kamers.
Respirometrie met behulp van gasanalyse wordt ook regelmatig gebruikt voor D. melanogaster. In dit geval worden met regelmatige tussenpozen gassen bemonsterd uit afgesloten kamers met vliegen en naar een infraroodanalysator 2,6,11 gestuurd. Dit type apparaat heeft als voordeel dat het in de handel verkrijgbaar is, minder gevoelig is voor omgevingsomstandigheden en dat gassen tijdens de bemonstering worden ververst, zodat PO2 stabiel blijft. De apparatuur kan echter duur en complex zijn om te bedienen.
Een recent ontwikkelde coulometrische microrespirometer12 biedt een goedkoop, gevoelig en stabiel alternatief voor bestaande systemen. In de praktijk wordt een organisme in een luchtdichte kamer geplaatst waar het O 2 verbruikt en de uitgeademde CO2 wordt verwijderd door een absorberend materiaal, wat resulteert in een netto afname van de kamerdruk. Wanneer de interne druk daalt tot een vooraf ingestelde drempel (AAN-drempel), wordt stroom door een elektrolytische O2-generator geleid, waardoor de druk wordt teruggevoerd naar een tweede drempel (UIT-drempel), waardoor de elektrolyse wordt gestopt. De ladingsoverdracht over de O 2-generator is recht evenredig met de hoeveelheid O 2 die nodig is om de kamer opnieuw onder druk te brengen en kan daarom worden gebruikt om de O2 te meten die door het organisme wordt verbruikt4. De methode is zeer gevoelig, meet V O2 nauwkeurig en de regelmatige vervanging van O2 kan PO2 uren of dagen op een bijna constant niveau houden.
De coulometrische microrespirometer die in dit onderzoek wordt gebruikt, maakt gebruik van een multimodale (druk, temperatuur en vochtigheid) elektronische sensor. De sensor wordt bediend door een microcontroller die kleine drukveranderingen detecteert en O2-generatie activeert wanneer een lagedrukdrempel12 wordt bereikt. Dit apparaat is samengesteld uit kant-en-klare onderdelen, kan worden gebruikt met een breed scala aan kamers en experimentele omgevingen, en is met succes gebruikt om de effecten van lichaamsgewicht en temperatuur op de kever Tenebrio molitor te onderzoeken. In de huidige studie is de microrespirometer aangepast om hetO2-verbruik te meten in D. melanogaster, dat ongeveer 1% van de massa van T. molitor heeft. De gevoeligheid van het apparaat is verhoogd door de drempel voor het activeren van O2-opwekking te verlagen, en de stabiliteit van het milieu is verbeterd door experimenten uit te voeren in een temperatuurgecontroleerd waterbad en door de luchtvochtigheid in de kamers op of in de buurt van 100% te houden.
Het CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) eiwit, onderdeel van de familie van membraan-geassocieerde guanylaatkinasen (MAGUK), is een moleculair steiger in verschillende multi-eiwitcomplexen, en mutaties in CASK zijn geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen bij mensen en bij D. melanogaster13,14. Een levensvatbare D. melanogaster-mutant, CASKΔ18, verstoort de activiteit van dopaminerge neuronen 15 en vermindert de activiteitsniveaus met meer dan 50% in vergelijking met congene controles14,16. Vanwege de verminderde activiteitsniveaus van CASK mutanten en de rol van catecholamines bij het reguleren van het metabolisme17 veronderstelden we dat hun standaard stofwisseling, en dus O2 consumptie, drastisch zou worden verminderd in vergelijking met controles.
O2 consumptie werd gemeten in CASKΔ18 en hun wildtype congeneren, w(ex33). Groepen vliegen werden in respirometriekamers geplaatst, het O 2-verbruik werd gemeten, het O2-verbruik werd berekend en uitgedrukt op zowel massaspecifieke basis als per vlieg. Het apparaat registreerde VO2 in wildtype vliegen, wat consistent was met eerdere studies, en het kon onderscheid maken tussen de O2-consumptie per vlieg van wildtype en CASK mutante vliegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vliegenopfok en -verzameling
- Houd vliegen bij 25 °C in smalle injectieflacons met standaard Drosophila-voer .
OPMERKING: De steekproefomvang voor elk genotype moet ten minste negen replicaten omvatten, elk bestaande uit een enkele respirometerkamer met 15-25 vliegen, opgesteld zoals hieronder beschreven. - Breng de vliegen elke 2-3 dagen over.
- Verdoof vliegen met CO2, verzamel groepen van 15-25 mannetjes van elk genotype en plaats elke groep in verse, niet-gegiste voedselflesjes.
OPMERKING: Mannetjes werden gebruikt om de variabiliteit als gevolg van de voortplantingsstatus te verminderen. De methode is van toepassing op beide geslachten. - Laat de vliegen minimaal 24 uur herstellen bij 25 °C.
OPMERKING: Tegen de tijd van het experiment moeten vliegen 1-4 dagen oud zijn. De frequentie van het verzamelen zoals beschreven in stap 1.3 kan worden ingesteld om de leeftijdscategorie van de vliegen te verkleinen.
2. Opstelling en montage van de respirometerkamer
- Zet het waterbad aan en stel het in op de gewenste temperatuur voor het experiment.
OPMERKING: De onderstaande experimenten werden uitgevoerd bij 25 °C met 50 ml Schlenk-buizen als kamers. Componenten moeten worden gemonteerd zoals weergegeven in afbeeldingen 1A, 1B en 1C. - Reinig de geslepen glasverbindingen van kamers en sensorpluggen grondig door 70% ethanol op een laboratoriumdoekje te spuiten (niet rechtstreeks op de verbinding) en stof en oud vet van de sensorstekker te vegen (Figuur 1A). Veeg ethanol weg met een nieuw laboratoriumdoekje.
- Leg een stuk wattenrol van 1 cm gedrenkt in gezuiverd water op de bodem van de kamer om de luchtvochtigheid te stabiliseren.
- Voeg voldoende water toe (~0,5 ml) om een kleine plas op de bodem van de wattenrol te vormen.
- Veeg al het water weg dat op de verbinding van de kamer is gemorst.
- Breng de vliegen over naar geëtiketteerde polypropyleen buizen met behulp van een trechter.
- Sluit de buis af met een wattenbroodje.
OPMERKING: De buisjes bestaan uit een reageerbuis van 5 ml polypropyleen, op 5,5 cm lengte geknipt en geperforeerd met een heet mes om de vrije uitwisseling van lucht met de experimentele kamer mogelijk te maken. Van CO2 -anesthesie is bekend dat het metabole afwijkingen veroorzaakt, dus vliegen worden zonder verdoving overgebracht, wat meer zorg vereist om te voorkomen dat de vliegen verloren gaan.
- Sluit de buis af met een wattenbroodje.
- Voeg een geventileerde buis met vliegen toe aan elke ademhalingsmeterkamer (bovenop nat katoen).
- Vul natronkalkpatronen (4-5 pellets per buis) en plaats ze op de bovenkant van de buis met vliegen in de kamer.
OPMERKING: Soda lime-patronen bestaan uit centrifugebuisjes van 800 μL die 4-5 keer zijn geperforeerd met een boormachine. - Vul O2-generatoren met een oplossing van verzadigd kopersulfaat (CuSO4) onder het niveau van de ontluchtingsgaten
OPMERKING: O2 generatoren bestaan uit centrifugebuisjes met schroefdop en 4 gaten die onder de schroefdraad zijn geboord. Platina (Pt) en koper (Cu) elektroden worden gesoldeerd aan een tweepolige connector, in gaten gestoken die in de dop zijn geboord en bevestigd met epoxy. Elektrolyse van CuSO4 genereert de O2 die door het experimentele organisme wordt verbruikt. CuSO4 is giftig voor ongewervelde dieren, vermijd morsen of lekken en ruim onmiddellijk op. - Sluit de gevulde O2-generator aan op de tweepolige connector op de sensorstekker.
NOTITIE: De koperen kathode moet worden aangesloten op de negatieve uitgang van de controller en de platina-anode op de positieve draad. Omgekeerde verbindingen zullen het mislukken van het experiment veroorzaken. - Plaats twee kleine klodders helder siliconenvet aan weerszijden van de geslepen glasverbinding van de sensorstekker.
- Steek de plug in de kamer en draai de plug (of kamer) met matige druk om het vet in de verbinding te verspreiden.
- Veeg overtollig vet weg met een laboratoriumdoekje.
- Klik plastic Keck-klemmen op verbindingen om pluggen in kamers vast te zetten. De geassembleerde kamer moet eruit zien als figuur 1C.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor het aantal kamers dat wordt gebruikt voor het experiment van de dag.
OPMERKING: Het aantal kamers dat kan worden opgenomen, wordt beperkt door het aantal beschikbare kamers, controllers en USB-ingangen voor de computer. Voor de huidige experimenten werden gewoonlijk zeven kamers parallel gedraaid. Experimentele vliegen, zoals mutanten, moeten worden gekoppeld aan passende controles. In elk experiment moet een kamer worden opgenomen die identiek is opgezet, maar zonder vliegen, als controle op omgevingsvariatie. Kamers met verschillende behandelingen (mutant, wildtype, no-fly) moeten tussen de experimenten worden afgewisseld. - Plaats de geassembleerde kamers in een rek in het waterbad met de kranen open (Figuur 1E).
OPMERKING: Om circadiane variatie te voorkomen, werden tussen 9.30 en 9.50 uur kamers in het bad geplaatst voor alle hier beschreven experimenten. - Laat de kranen open (houd de hendel evenwijdig aan de kraan).
NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen water in de kranen komt. - Laat de kamers ongeveer 30 minuten in evenwicht zijn met de kranen open.
NOTITIE: Terwijl de kamer in evenwicht is, sluit u de elektronica aan en stelt u de gegevensverzameling in zoals hieronder beschreven.
3. Controllers en computer instellen
- Zorg ervoor dat de schakelaars die stroom leveren aan de O2-generatoren in de UIT-stand staan (weg van de connector; Figuur 1D).
- Sluit elke controllerbox aan op een beschikbare USB-poort (Universal Serial Bus).
OPMERKING: Constructie en programmering van de elders beschreven besturingseenheden12. - Sluit controllers aan op ademhalingsmeterkamers met behulp van 6-aderige kabels.
- Controleer of de displays van de OLED-displays (Organic Light Emitting Diode) van de controllers (Afbeelding 1D) omgevingsparameters weergeven.
- Schakel de O2-generatoren kort in met de schakelaar op de regelaar (Figuur 1D).
- Als de stroomwaarde stijgt van nul naar tussen 35 en 55 mA, zijn de controller en de kamer klaar voor experimenten.
- Bepaal welke COM-poorten worden gebruikt door de controllers, zoals hieronder beschreven.,
- Klik op het Start-pictogram in Microsoft Windows.
- Klik op het pictogram Instellingen .
- Klik op Bluetooth en apparaten.
- Zorg ervoor dat de controllers en hun COM-poorten in de lijst met apparaten worden weergegeven.
- Open PuTTY op het bureaublad en stel een logbestand in voor elk kanaal van de respirometer zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: PuTTY is een gratis beveiligde shell en telnet-client die wordt gebruikt om gegevens via COM-poorten naar de computer over te brengen.- Selecteer de COM-poort voor een controller door het nummer van de poort in het vak "Seriële lijn" te typen (Figuur 2A).
- Klik op Logging.
- Selecteer Afdrukbare uitvoer in "Sessieregistratie" (Afbeelding 2B).
- Klik onder Bestandsnaam logboekbestand op Bladeren.
- Maak in de map van de keuze een bestandsnaam aan met beschrijvende informatie (bijv. datum, soort, COM-poortnummer).
- Klik op Opslaan.
- Klik op Openen. Er wordt een venster geopend met door komma's gescheiden gegevens die worden geregistreerd (Figuur 2C).
- Herhaal dit voor alle andere controllers die voor het experiment worden gebruikt. De invoer van elke COM-poort verschijnt als een apart venster (Figuur 2D).
4. Experimenten uitvoeren
- Zodra de kamers gedurende 30 minuten in evenwicht zijn, sluit u ze af door de kranen te sluiten.
- Bedek het bad en de kamers met een doos van polystyreenschuim om een stabiele omgeving te behouden.
- Laat nog een uur balanceren.
- Schakel de stroom naar de O2-generator van elke kamer in met behulp van de schakelaar op de controllerbox.
- Zodra de O2-generatoren zijn geactiveerd, moet u ervoor zorgen dat de druk toeneemt tot de vooraf ingestelde UIT-druk.
OPMERKING: 1017 hPa, wat iets boven de atmosferische druk ligt, werd gebruikt als de "UIT"-druk in deze reeks experimenten. Terugkeer naar de omgevingsdruk duidt op lekkage van gas uit de kamers. Verder maakt het het mogelijk om dezelfde druk te gebruiken in alle experimenten, ongeacht de luchtdruk in de omgeving. De "AAN"-druk was 1016 hPa, wat betekent dat de druk slechts 1 hPa hoefde te dalen voordat de O2-generator werd geactiveerd. Dit leverde voldoende gevoeligheid op om deO2-consumptie in Drosophila te meten. Zodra een kamer onder druk staat op de "UIT"-instelling, moet de stroom tot nul dalen. - Laat het experiment 3 uur of langer lopen.
OPMERKING: Een hogere VO2 bij verhoogde temperaturen kan zorgen voor kortere experimenttijden. Controleer af en toe om er zeker van te zijn dat de apparatuur werkt, maar vermijd overmatige activiteit in de buurt van de kamers die de temperatuurstabiliteit kunnen beïnvloeden.
5. Experiment afronden
- Schakel O2-generatoren op alle controllers uit.
NOTITIE: Doe eerst om te voorkomen dat de O2-generatoren draaien terwijl de kamers open zijn. - Open de kranen om de kamers te ontzegelen.
- Laat de PuTTY-vensters nog 5-15 minuten open om een definitieve basislijn te geven.
- Sluit het PuTTY-venster voor elke controller en beëindig de opnames.
OPMERKING: Alle experimenten eindigden tussen 16.50 en 17.10 uur. - Koppel de sensoren los van de kabels.
- Verplaats de kamers naar het droogrek.
- Verwijder de sensorstekkers één voor één uit de kamers.
- Koppel de O2 generatoren los en plaats ze in het buizenrek.
- Veeg het vet van de sensorstekker en bewaar deze in het rek.
- Verwijder vet van kamerverbindingen en verwijder buizen met vliegen en natronkalk.
- Verdoofvliegen in elke buis met CO2, tik op een gewichtsboot en weeg op een microbalans.
- Registreer het gewicht en het aantal vliegen voor elke buis.
- Gooi vliegen weg of leg ze opzij voor aanvullende procedures.
- Gooi natronkalk uit patronen in de afvalcontainer.
- Open de O2-generator en gooi de CuSO4-oplossing in de afvalcontainer.
- Spoel elektroden en slang af met gezuiverd water.
- Plaats de buizenrekken om te drogen.
6. Analyse van de gegevens over de overdracht van de kosten
- Importeer gegevens als door komma's gescheiden tekst in een spreadsheet, waarbij elke record een afzonderlijk werkblad bevat.
- Noteer de stroom- en tijdgegevens voor elke puls van de O2-generator . Beginnend met de eerste puls nadat de kamer onder druk is gezet, noteert u de starttijd en eindtijd (als rijnummers) van elke stroompuls. Dat is het rijnummer wanneer de stroom boven nul gaat (meestal tot ongeveer 45-50 mA) naar de laatste rij die boven nul ligt.
- Maak een tabel op het werkblad om de volgende gegevens vast te leggen:
- De gemiddelde stroomamplitude tijdens de puls: = GEMIDDELDE([eerste rij puls]:[laatste rij puls]) voor elke puls (uit de stroomkolom).
- Pulsduur: ([Laatste rij polsslag] - [eerste rij polsslag[-één rij]])/1000 voor elke polsslag (vanaf de tijd in milliseconden kolom).
- Totale experimenttijd: [tijd aan het begin van de laatste puls] - [tijd aan het einde van de eerste puls nadat de kamer onder druk is gezet] (vanaf de kolom tijd in minuten).
- Bereken vervolgens de ladingsoverdracht (Q) voor elke puls (gemiddelde stroom X duur)
- Tel de lading van alle pulsen bij elkaar op om de totale lading (Qtot) te berekenen.
7. Analyse van hetO2-verbruik
- Stel een nieuwe spreadsheet in voor alle gegevens en voer voor elke kamer het volgende in of bereken het:
- Qtot (totale kosten)
- Moedervlekken (= Q ÷ 96485 × 4)
- ml O2 (= mol × 22413 ml/mol)
- Totale tijd (uit de gegevensanalyse hierboven)
- ml min-1 (= ml O2 ÷ totale tijd)
- Gewicht in grammen (vliegen verdoofd en gewogen, gemeten na het experiment)
- ml min-1 g-1 (= ml min-1 ÷ gewicht in gram)
- ml/h/g (de bovenstaande × 60)
- mg/vlieg (= gewicht van vliegen ÷ aantal vliegen)
- μL vlieg-1 h-1 (= (ml min-1 × 3600) ÷ aantal vliegen).
- Tabelgegevens voor elke behandeling (genotype, bijv.)
- Vergelijk behandelingen met ANOVA, t-test of Mann-Whitney u-test 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De druk- en stroomuitgangen van de ademhalingsmeterregelaar worden weergegeven voor één kamer in één experiment in figuur 3A. De eerste, lange stroompuls zette de kamer onder druk van omgevingsdruk (ongeveer 992 hPa) tot de vooraf ingestelde UIT-drempel van 1017 hPa. Terwijl de vliegen O 2 verbruikten en CO 2 werd geabsorbeerd, nam de druk langzaam af totdat deze de AAN-drempel van 1016 hPa bereikte, die de stroom door de O 2-generator activeerde. In het getoonde voorbeeld is de gemiddelde amplitude van elke puls 50,1 mA, de duur is 16,1 s, wat een ladingsoverdracht oplevert van ongeveer 0,81 coulombs (C) per puls. De totale ladingsoverdracht voor deze kamer bedroeg 3,28 C over een totale tijd van 240,0 min. Gebruikmakend van de berekeningen beschreven in Procedures met de massa en het aantal vliegen (23 vliegen met een totaal gewicht van 14,9 mg), was het O 2-verbruik voor de groep in deze kamer 3,19 ml h-1 g-1 of 2,07 μL h-1 vlieg-1.
De apparatuur kan eenvoudig worden ingesteld, met een minimum aan training, en presteert betrouwbaar gedurende vele cycli van montage en uitschakeling. Niettemin moet de apparatuur regelmatig worden onderhouden en geïnspecteerd, en moeten de experimentele omstandigheden zorgvuldig worden gecontroleerd. Het verlies van een gasdichte afdichting, als gevolg van het falen van een verbinding of kraan, kan bijvoorbeeld leiden tot snelle drukcycli en een zeer hoge VO2 (Figuur 3B). Bovendien moeten temperatuur en vochtigheid stabiel blijven in de kamer. Als de temperatuur of vochtigheid daalt, zal de resulterende drukval ten onrechte worden geïnterpreteerd als een O2 die wordt verbruikt. Omgekeerd zal opwaartse drift in temperatuur of vochtigheid de drukdaling als gevolg van het O2-verbruik tegengaan en het VO2-signaal kunstmatig verminderen of elimineren (Figuur 3C).
De methode werd gebruikt om VO2 van CASK Δ18-mutanten te testen, die werden gegenereerd door onnauwkeurige excisie van een transponeerbaar element uit de CASK locus 14, en waarin de voortbeweging drastisch wordt verminderd14,16. In wildtype w(ex33)-controles, gegenereerd door nauwkeurige excisie van het transponeerbare element, bedroeg het gemiddelde massaspecifiekeO2-verbruik 3,65 ± 0,24 ml·g-1·h-1 (n = 16 kamers; Figuur 4A).
Ondanks hun zichtbaar verminderde voortbeweging was de VO2 van CASKΔ18-mutanten iets maar niet significant lager dan die van de controlegroep (gemiddelde ± s.e.m.= 3,23 ± 0,13 ml·g-1·h-1; n = 11 groepen; P = 0,08 Mann-Whitney u-test).
Omdat de validiteit van het uitdrukken van de stofwisseling in termen van lichaamsgewicht in twijfel is getrokken18, werd deO2-consumptie ook per vlieg geanalyseerd (Figuur 4B). Met behulp van deze analyse was VO2 significant verlaagd in CASKΔ18 in vergelijking met wildtype controles (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·h-1; VATΔ18: 1,58 ± 0,10 μL·vlieg-1·h-1; P = 0,0003, Mann-Whitney u-test). De gemiddelde massa van CASKΔ18-vliegen was echter >20% lager dan die van ex33-controles (figuur 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; CASKΔ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, Mann-Whitney u-test), dus het verschil in stofwisseling tussen genotypen is waarschijnlijk te wijten aan het verschil in hun grootte.
Afbeelding 1: Instelling van de ademhalingsmeter . (A) Diagram van de sensorstekker (boven) en de kamer van 50 ml (bestaande uit een Schlenk-buis van 50 ml, hieronder) vóór montage. Let op de locaties van de 19/22 geslepen glasverbindingen die de kamer en de sensorstekker zullen verbinden, en die voor elk experiment moeten worden schoongemaakt. De kraan, die nodig is voor het openen of afdichten van de kamer, wordt ook aangegeven. (B) Diagram van kamer en onderdelen, gemonteerd en gereed voor het experiment, met daarop: natte katoenrol, polypropyleen buis met vliegen, afgesloten met een katoenen stop, natronkalkpatroon en O2-generator gevuld met CuSO4. (C) Foto van de geassembleerde kamer. De Keck-klem waarmee de stekker aan de kamer is bevestigd, wordt gedeeltelijk aan het oog onttrokken door de ringstandaardklem die de kamer vasthoudt. (D) Foto van de controller met schakelaar die de stroom regelt via de O2-generator en het venster voor het bekijken van het OLED-display. (E) Geassembleerde kamers in een waterbad. Er worden zeven kamers getoond, waarvan drie met mutanten, drie met wildtype-besturing en één kamer met alle componenten behalve vliegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Instellen van data-acquisitie. (A) PuTTY-interface voor het selecteren van de seriële poort voor data-acquisitie. Er is COM3 geselecteerd, met een baudrate van 9600 die overeenkomt met de output van de controller. (B) PuTTY-interface voor het instellen van een logbestand. "Afdrukbare uitvoer" is geselecteerd om het loggen van gegevens in een tekstbestand mogelijk te maken, de gegevensmap wordt geselecteerd met behulp van de knop "Bladeren" en er wordt een bestandsnaam gemaakt. (C) PuTTY-logbestand tijdens een experiment. Gegevens worden ongeveer twee keer per seconde verzameld en elke regel bevat de volgende door komma's gescheiden informatie: sensornummer, tijd (ms) sinds het begin van de acquisitie, kamertemperatuur (°C), kamerdruk (hPa), vochtigheid (procentueel relatief) en stroom (mA). (D) Datalogging tijdens een typisch experiment, met zeven vensters voor experimentele kamers, plus één kanaal voor de registratie van de badtemperatuur, omgevingsluchttemperatuur, druk en vochtigheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gegevens van de microrespirometer. (A) Druk (grijze lijn, linkeras) en stroom over de O2-generator (zwarte lijn, rechteras) in een enkele respirometerkamer met 23 w(ex33) vliegen. In het begin is een lange stroompuls nodig om de kamer onder druk te zetten van ~992 hPa tot de UIT-drempel van 1017 hPa. Terwijl de vliegen O 2 verbruikten, daalde de druk totdat deze de AAN-drempel van 1016 hPa bereikte, die de stroom door de O2-generator activeerde, waardoor de kamer opnieuw onder druk kwam te staan tot 1017 hPa. Het proces werd zes keer herhaald in dit experiment. (B) Een voorbeeld van een lekkende kamer veroorzaakt door een beschadigde kraan, ontleend aan een andere reeks experimenten. De kamer slaagde er niet in om de druk te handhaven (grijze lijn), wat resulteerde in een constante cyclus van elektrolytische stroom (zwarte lijn). Let op een andere tijdschaal dan paneel A. (C) Effect van drift in vochtigheid. O2 consumptie door het 20 mg lieveheersbeestje (Hippodamia convergens) in de kamer zou een cyclisch drukpatroon moeten hebben opgeleverd dat vergelijkbaar is met figuur 3A, maar de gestage toename van de luchtvochtigheid (zwarte lijn) veroorzaakte een kunstmatige toename van de kamerdruk (grijze lijn) die VO2 maskeerde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantitatieve gegevens van wild-type en CASK mutant D. melanogaster. (A) Massaspecifieke VO2 voor wildtype (w(ex33)) en mutante (CASKΔ18) vliegen. In alle grafieken geven de onderkant en bovenkant van de dozen respectievelijk het eerste en derde kwartielen aan, snorharen geven extreme waarden aan en de steekproefomvang (aantal kamers, elk met 17-24 vliegen) wordt tussen haakjes boven de genotypen gegeven. CASK Δ18-vliegen verschillen niet statistisch significant van ex33 (mediaan: ex33: 3.420 ml·g-1·h-1, CASKΔ18 : 3.029 ml·g-1·h-1; p = 0.08 Mann-Whitney u-test). (B) Vliegspecifiek VO2. CASKΔ18-vliegenverbruikten significant minder O 2 (mediaan 1.650 ml·vlieg-1·h-1) dan w(ex33) (2.078 ml·vlieg-1·h-1; p = 0.0003, Mann-Whitney u-test; significantie aangegeven met sterretjes). (C) De massa verschilde tussen CASKΔ18 en het wildtype (mediaan: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, Mann-Whitney u-test; significantie aangegeven met sterretjes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Overzicht van Drosophila-respirometriegegevens van wildtype vliegen bij 25 °C. Op één uitzonderingna 18 zijn de studies beperkt tot de studies die hetO2-verbruik meten. In de meeste gevallen was het nodig om VO2 te schatten aan de hand van grafieken, en figuurnummers uit de originele papieren worden verstrekt. Hoewel alle genotypen als "wildtype" werden beschouwd, varieerden de bronnen en voortplantingsmethoden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bovenstaande procedure demonstreert de meting van hetO2-verbruik in D. Melanogaster met behulp van een elektronische coulometrische microrespirometer. De resulterende gegevens voor de consumptie van O2 in wildtype D. melanogaster lagen binnen de marges die in de meeste eerdere publicaties met verschillende methoden zijn beschreven (tabel 1), hoewel iets lager dan die welke door anderen werden gerapporteerd 3,6.
Cruciale stappen waren gericht op de twee absolute vereisten van de methode: gasdichte afdichting en omgevingsstabiliteit. Het handhaven van een gasdichte omgeving is eenvoudig, maar vereist zorg. Schlenk-kolven en -buizen zijn bij uitstek geschikt als respirometriekamers. De glasconstructie vermijdt de gasdoorlaatbaarheid die aanwezig is in veel soorten plastic19, wat vooral van cruciaal belang is bij langdurige experimenten. De standaard koppelingen maken gasdichte verbindingen mogelijk met de stekkers met de sensoren en elektronische aansluitingen. Afsluitkranen zorgen voor betrouwbare afdichtingen en kunnen tijdens experimenten naar behoefte worden geopend of gesloten. Om ervoor te zorgen dat de afsluitingen voor elk experiment gasdicht waren, werden de kranen geïnspecteerd, werden de verbindingen grondig gereinigd, werden oordeelkundige hoeveelheden schoon siliconenvet aangebracht en werden de verbindingen vastgezet met Keck-klemmen.
De gevoeligheid van de methode wordt beperkt door de stabiliteit van temperatuur en vochtigheid in de kamer. Veranderingen in een van beide parameters zullen resulteren in drukschommelingen die het VO2-signaal verstoren. Het gebruik van een klimaatkamer12 of een circulerend waterbad zorgt voor een stabielere temperatuurregeling. Eerder werk van anderen heeft aangetoond dat de methode het O2-verbruik kan meten op het niveau van nmol·h-1 wanneer de temperatuur binnen ±0,01 °C20 wordt gehouden. Om de luchtvochtigheid te stabiliseren, hielden stukken katoenen rol ondergedompeld in water de luchtvochtigheid op bijna 100%. Temperatuur en vochtigheid werden gedurende ten minste 90 minuten gestabiliseerd voordat de kamers onder druk werden gezet met elektrolytisch gegenereerd O2 en de opnames begonnen. Alle experimenten omvatten één kamer die was samengesteld met alle componenten, maar geen vliegen bevatte, om de omgevingsomstandigheden te controleren.
Het regelmatig constant controleren van de temperatuur, druk en vochtigheid vereenvoudigt het oplossen van problemen aanzienlijk. Zo kon bijvoorbeeld het kunstmatig hoge schijnbareV-O2-gehalte veroorzaakt door een beschadigde kraan (Figuur 3B) of het schijnbare verlies vanVO2 als gevolg van een onstabiele kamervochtigheid (Figuur 3C) worden gedetecteerd en gecorrigeerd.
De hier beschreven coulometrische microrespirometer heeft verschillende voordelen. Ten eerste is het relatief goedkoop, met een geschatte totale kostprijs van $ 100 per kanaal (bestaande uit kamer, sensor en controller). Ten tweede, omdat elk kanaal onafhankelijk gegevens verwerft en verzendt, is het systeem schaalbaar, waarbij het aantal kamers alleen wordt beperkt door de grootte van de omgevingscontroller (waterbad of omgevingskamer) en het aantal beschikbare USB-poorten in de computer (over het algemeen uitbreidbaar tot >100). Omdat de kamers en controllers onafhankelijk zijn, heeft het falen van een van hen geen invloed op de andere. Ten derde kunnen regelaars eenvoudig opnieuw worden geprogrammeerd om zich aan te passen aan de omgevingsdruk of om de gevoeligheid naar behoefte aan te passen. In verband hiermee is de druk in de kamers ingesteld op een vaste waarde, zodat de experimentele druk constant zal zijn in alle experimenten, ongeacht de luchtdruk in de omgeving. Ten vierde maakt de gestage stroom van gegevens met betrekking tot tijd, temperatuur, druk, vochtigheid en stroom een gedetailleerde analyse van deze parameters voor elke kamer mogelijk, waardoor het oplossen van problemen of het analyseren van temporele veranderingen in VO2 in langere experimenten wordt vergemakkelijkt. Ten slotte kunnen de omgevingscondities in de kamer gedurende vele uren of dagen op een constant niveau worden gehouden, omdat verbruikt O2 voortdurend wordt vervangen. In de huidige studie fluctueerde de kamerdruk van 1016 tot 1017 hPa, wat minder is dan 0,1%, waarbij de resulterende variatie in PO2 minder dan 0,5% bedroeg. Op basis van de hoeveelheid CuSO4 in elke O 2-generator, die 28 ml O2 kan genereren, en de gemiddelde VO2 van groepen vliegen in deze studie, 1,15 ml/dag (gemiddelde = 21,8 vliegen per kamer), kan de stofwisseling tot 24 dagen per keer worden bestudeerd. Ervan uitgaande dat de vliegen voldoende voeding krijgen, betekent dit dat het metabolisme gedurende het grootste deel van de levensduur van een vlieg continu kan worden bestudeerd.
Op dit moment zijn de meeste onderzoeken naar het metabolisme bij D. melanogaster gebaseerd op gasanalyse of manometrie. Methoden die gebaseerd zijn op gasanalyse, zoals stop-flow en continue flow respirometers 2,3,6 hebben het voordeel dat de methode goed ingeburgerd is en dat apparatuur in de handel verkrijgbaar is. Ze vereisen echter dure en complexe apparatuur, waaronder spruitstukken en moleculaire stromingssensoren om de stroom te regelen, en gasanalysatoren om gasconcentraties te meten. Als alternatief zijn eenvoudige manometers9 veel goedkoper. In de eenvoudigste vorm, die gewoonlijk wordt gebruikt voor D. melanogaster, worden vliegen verdoofd en in een kleine kamer geplaatst die CO2 -absorberend materiaal bevat en die door een capillair buisje is verbonden met een vloeistofreservoir. Naarmate O 2 wordt verbruikt en de resulterende CO2 wordt geabsorbeerd, daalt de druk in de kamer, waardoor vloeistof in de capillaire buis wordt gezogen. De hoogte van de vloeistof is dan evenredig met de hoeveelheid O2 die wordt verbruikt. Omdat verbruikt O2 tijdens het experiment niet wordt vervangen, neemt PO2 in de loop van het experiment continu af. Hoewel routinematige experimenten P O2 mogelijk niet voldoende verminderen om V O2 negatief te beïnvloeden, kunnen langdurige experimenten of experimenten bij verhoogde temperaturen O2 uitputten en de kritische P O2 bereiken waarbij V O2 sterk afneemt3. Een ander probleem is dat het gewicht van de vloeistof in het capillair een neerwaartse kracht uitoefent, waardoor de hoogte van de vloeistof afneemt in verhouding tot de uitgeoefende neerwaartse kracht, wat resulteert in mogelijke fouten. Methoden om dit effect te compenseren zijn beschreven 4,21, maar zijn omslachtig en worden niet op grote schaal gebruikt. Directe vergelijking van gasanalyse en manometrie gaf aan dat de twee methoden significant verschillende resultaten opleverden, maar de auteurs waren niet in staat om een bevredigende verklaring voor de discrepantie te geven22.
Ondanks zijn voordelen heeft de coulometrische microrespirometer ook beperkingen. Ten eerste is het, in tegenstelling tot sommige stop-flow gasanalysesystemen, niet in de handel verkrijgbaar. De componenten zijn gemakkelijk te verkrijgen en noch het ontwerp, noch de programmering zijn ingewikkeld, maar het is potentieel complexer om te construeren dan de eenvoudige manometrische systemen9. Ten tweede moet het verkrijgen van nauwkeurige gegevens meerdere cycli van O2-generatie omvatten, dus elk experiment moet enkele uren duren. Dit geldt ook voor experimenten met manometrie. Ten slotte moeten, net als bij manometrie, de temperatuur en vochtigheid in de kamers stabiel zijn. Desalniettemin biedt de coulometrische microrespirometer een middenweg met betrekking tot kosten en complexiteit, is hij robuust en betrouwbaar als hij eenmaal is gemonteerd en meet hij nauwkeurig het O2-verbruik .
De experimenten met CASKΔ18-mutanten laten zowel negatieve (massaspecifieke V O2) als positieve resultaten (vliegspecifieke VO2) zien. Als de >50% vermindering van het lopen van CASKΔ18-mutantenhetgevolg zou zijn van een gecompromitteerd metabolisme, zou kunnen worden voorspeld dat VO2 met een vergelijkbare hoeveelheid zou worden verminderd. Toch was de verandering in massaspecifieke O2-consumptie bescheiden (9,6 % reductie van de mediane VO2) en niet statistisch significant. Dit negatieve resultaat komt overeen met CASKΔ18-mutanten met een relatief normaal metabolisme, waarbij het gedragsfenotype het gevolg is van verminderde locomotorische aandrijving. Hoewel het mogelijk is dat de methode onvoldoende sensitiviteit heeft, was de reductie van VO2 veroorzaakt door een relatief klein verschil in grootte (15,5% reductie van de mediane massa) zeer significant.
Lopen wordt geassocieerd met een aanzienlijk verhoogd energieverbruik5,23, dus waarom is VO2 relatief normaal in CASK mutanten? Het is mogelijk dat overmatige vachtverzorging in CASKmutanten 16 een tegenwicht kan vormen voor de vermindering van het lopen, of dat het wandelende fenotype minder duidelijk is wanneer vliegen in groepen in kleine buisjes worden getest, maar deze hypothesen wachten op experimentele verificatie. Desalniettemin concluderen we dat mutaties in de CASK locus geen sterke, directe effecten hebben op het metabolisme, en dat de coulometrische microrespirometer een effectief instrument is voor het bestuderen van het metabolisme in D. melanogaster.
Omdat dit apparaat gemakkelijk kan worden opgebouwd uit gemeenschappelijke componenten, het O2-verbruik nauwkeurig meet, zeer draagbaar is, kan worden gebruikt in elke omgeving met een stabiele temperatuur en is gebruikt met organismen zo klein als 0,5 mg vliegen (de huidige studie) en zo groot als 500 mg schorpioenen (DJS niet gepubliceerd), voegt het een veelzijdig hulpmiddel toe voor het bestuderen van het metabolisme van verschillende organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We danken Dr. Linda Restifo van de Universiteit van Arizona voor het voorstellen om de O2-consumptie van CASK mutanten te testen en voor het sturen van CASK mutanten en hun congene controles. De publicatiekosten werden verstrekt door het Departmental Reinvestment Fund van de afdeling Biologie van het University of College Park. Ruimte en wat apparatuur werden geleverd door de universiteiten in Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
