Summary
Кулонометрическая респирометрия идеально подходит для измерения скорости метаболизма мелких организмов. При адаптации к Drosophila melanogaster в настоящем исследовании измеренное потреблениеO2 было в пределах диапазона, о котором сообщалось для дикого типа D. melanogaster в предыдущих исследованиях. ПотреблениеO2 мухой мутантами CASK , которые меньше по размеру и менее активны, было значительно ниже, чем у дикого типа.
Abstract
Кулонометрическая микрореспирометрия является простым и недорогим методом измерения потребленияO2 мелкими организмами при сохранении стабильной среды. Кулонометрический микрореспирометр состоит из герметичной камеры, в которой расходуется О2, а вырабатываемый организмомСО2 удаляется абсорбирующей средой. Результирующее снижение давления запускает производство электролитического O2, а количество произведенногоO2 измеряется путем регистрации количества заряда, использованного для его генерации. В настоящем исследовании метод был адаптирован к Drosophila melanogaster, протестированному в небольших группах, с чувствительностью аппарата и условиями окружающей среды, оптимизированными для высокой стабильности. Количество O2, потребляемое мухами дикого типа в этом аппарате, соответствует тому, которое было измерено в предыдущих исследованиях. Массовое потреблениеO2 мутантами CASK, которые меньше по размеру и, как известно, менее активны, не отличалось от конгенной контрольной группы. Тем не менее, небольшой размер мутантов CASK привел к значительному снижению потребленияO2 в расчете на муху. Таким образом, микрореспирометр способен измерять потреблениеО2 у D. melanogaster, может различать скромные различия между генотипами и добавляет универсальный инструмент для измерения скорости метаболизма.
Introduction
Способность измерять скорость метаболизма имеет решающее значение для полного понимания организма в его экологическом контексте. Например, необходимо измерить скорость метаболизма, чтобы понять ее роль в продолжительности жизни1, роль диеты в метаболизме2 или порог гипоксического стресса3.
Существует два основных подхода к измерению скорости метаболизма4. Прямая калориметрия измеряет расход энергии напрямую, измеряя выработку тепла. Косвенная калориметрия измеряет выработку энергии другими способами, часто с помощью респирометрического измерения потребления O2 (VO2), производстваCO2 или и того, и другого. Несмотря на то, что прямая калориметрия применяется к мелким эктотермам, включая Drosophila melanogaster5, респирометрия технически проще и чаще используется.
Несколько форм респирометрии были успешно использованы для измерения скорости метаболизма у дикого и мутантного D. melanogaster и дали представление о метаболических эффектах температуры6, социальной среды 3, диеты 3,7 и нарушений развития нервной системы8. Они делятся на два класса, которые значительно различаются по стоимости и сложности. Манометрия - это самый простой и наименее дорогой метод 9,10, при котором мухи помещаются в герметичную камеру, содержащую абсорбентСО2 и соединенную через тонкий капилляр с резервуаром для жидкости. По мере того, как О2 расходуется, аСО2 абсорбируется, давление в камере уменьшается, и жидкость втягивается в капилляр. Таким образом, заполненный жидкостью объем капилляра пропорционален VO2. Более сложные версии, которые компенсируют силу, действующую на жидкость в капилляре, также были использованы на D. melanogaster1. Преимущества манометрии заключаются в том, что она проста и недорога, но, поскольку она чувствительна к давлению, требует постоянных условий окружающей среды. Далее, поскольку израсходованный О2 не восполняется, парциальное давление О2 (РО2) внутри камер постепенно уменьшается.
Респирометрия с использованием газового анализа также регулярно применяется для D. melanogaster. В этом случае пробы газов отбирают через равные промежутки времени из герметичных камер, содержащих мух, и направляют на инфракрасный анализатор 2,6,11. Преимущества этого типа приборов заключаются в том, что они доступны в продаже, менее чувствительны к условиям окружающей среды, а газы обновляются во время отбора проб, чтобы PO2 оставался стабильным. Однако оборудование может быть дорогим и сложным в эксплуатации.
Недавно разработанный кулонометрический микрореспирометр12 представляет собой недорогую, чувствительную и стабильную альтернативу существующим системам. На практике организм помещается в герметичную камеру, где он потребляет O2, а выдыхаемыйCO2 удаляется абсорбирующим материалом, что приводит к чистому снижению давления в камере. Когда внутреннее давление снижается до заданного порога (ON-threshold), ток пропускается через электролитический генераторO2, возвращая давление ко второму порогу (OFF-threshold), останавливая электролиз. Перенос заряда через генератор О2 прямо пропорционален количеству О2, необходимому для повышения давления в камере, и поэтому может быть использован для измерения О2, потребляемого организмом4. Метод высокочувствителен, точно измеряет V O2, а регулярная заменаO2 может поддерживать PO2 на почти постоянном уровне в течение нескольких часов или дней.
В кулонометрическом микрореспирометре, используемом в данном исследовании, используется мультимодальный (давление, температура и влажность) электронный датчик. Датчик управляется микроконтроллером, который обнаруживает небольшие изменения давления и активирует генерацию O2 при достижении низкого порога давления12. Этот аппарат собран из готовых деталей, может использоваться с широким спектром камер и экспериментальных сред и успешно применяется для изучения влияния массы тела и температуры на жука Tenebrio molitor. В настоящем исследовании микрореспирометр был адаптирован для измерения потребленияO2 у D. melanogaster, который имеет примерно 1% массы T. molitor. Чувствительность аппарата была повышена за счет снижения порога активации генерацииO2, а стабильность окружающей среды была повышена за счет проведения экспериментов в водяной бане с регулируемой температурой и поддержания влажности внутри камер на уровне или близком к 100%.
Белок CASK (кальмодулин-зависимая серинкиназа), входящий в семейство мембраноассоциированных гуанилаткиназ (MAGUK), является молекулярным каркасом в различных мультибелковых комплексах, а мутации в CASK связаны с нарушениями развития нервной системы у человека и у D. melanogaster13,14. Жизнеспособный мутант D. melanogaster, CASKΔ18, нарушает активность дофаминергических нейронов 15 и снижает уровень активности более чем на 50% по сравнению с конгенной контрольной группой14,16. Из-за пониженных уровней активности мутантов CASK и роли катехоламинов в регуляции метаболизма17 мы предположили, что их стандартная скорость метаболизма и, следовательно, потреблениеO2 будут значительно снижены по сравнению с контрольной группой.
ПотреблениеO2 измеряли в CASKΔ18 и их конгенерах дикого типа, w(ex33). Группы мух помещали в респирометрические камеры, измеряли расход О2, рассчитывали и выражали расходО2 как по массе, так и по мухе. Аппарат зарегистрировал VO2 у мух дикого типа, что согласуется с предыдущими исследованиями, и он смог дифференцировать потребление O2 мухами дикого типа и мухами-мутантами CASK на муху.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Разведение и сбор мух
- Содержать мух при температуре 25 °C в узких флаконах, содержащих стандартный корм для дрозофилы .
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер выборки для каждого генотипа должен состоять, по крайней мере, из девяти репликаций, каждый из которых состоит из одной камеры респирометра, содержащей 15-25 мух, установленных так, как описано ниже. - Переносят мух каждые 2-3 дня.
- Обезболивайте мухСО2, собирайте группы по 15-25 самцов каждого генотипа и помещайте каждую группу в свежие бездрожжевые пищевые флаконы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы использовались для уменьшения изменчивости из-за репродуктивного статуса. Метод применим к представителям обоих полов. - Дайте мухам восстановиться при температуре 25 °C в течение не менее 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: К моменту проведения эксперимента мухам должно быть 1-4 дня. Частота сборов, описанная в шаге 1.3, может быть установлена для сужения возрастного диапазона мух.
2. Настройка и сборка камеры респирометра
- Включите водяную баню и установите на ней нужную для эксперимента температуру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже эксперименты проводились при температуре 25 °C с использованием пробирок Schlenk объемом 50 мл в качестве камер. Компоненты должны быть собраны, как показано на рисунках 1А, 1Б и 1С. - Тщательно очистите стыки матового стекла камер и пробок датчика, распылив 70% этанол на лабораторную салфетку (не непосредственно на стык) и вытерев пыль и старую смазку со штекера датчика (Рисунок 1A). Сотрите этанол свежей лабораторной салфеткой.
- Поместите на дно камеры 1 см кусок ватного валика, смоченного в очищенной воде, чтобы стабилизировать влажность.
- Добавьте достаточное количество воды (~0,5 мл), чтобы образовалась небольшая лужица на дне ватного валика.
- Вытрите воду, которая пролилась на стык камеры.
- Переложите мух на промаркированные полипропиленовые трубки с помощью воронки.
- Заткните трубочку ватным валиком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки состоят из полипропиленовой пробирки объемом 5 мл, обрезанной до 5,5 см в длину и перфорированной горячим ножом, чтобы обеспечить свободный обмен воздуха с экспериментальной камерой. Известно, что анестезия CO2 вызывает метаболические аномалии, поэтому мух переносят без анестезии, что требует большей осторожности, чтобы не потерять мух.
- Заткните трубочку ватным валиком.
- Добавьте в каждую камеру респирометра по одной вентилируемой трубке с мухами (поверх влажной ваты).
- Наполните картриджи с натронной известью (4-5 гранул в тюбике) и поместите их на верхнюю часть трубки с мухами внутри камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Картриджи с натриевой известью состоят из центрифужных пробирок объемом 800 мкл, перфорированных 4-5 раз с помощью электродрели. - Генераторы O2 заполнить раствором насыщенного сульфата меди (CuSO4) ниже уровня вентиляционных отверстий
ПРИМЕЧАНИЕ: Генераторы Ø2 состоят из центрифужных трубок с завинчивающейся крышкой и 4 отверстиями, просверленными под резьбой. Платиновые (Pt) и медные (Cu) электроды припаиваются к двухконтактному разъему, вставляются в отверстия, просверленные в колпачке, и приклеиваются эпоксидной смолой. При электролизеCuSO4 образуетсяO2 , потребляемый экспериментальным организмом. CuSO4 токсичен для беспозвоночных, избегайте разливов или утечек и немедленно очищайте. - Подключите заполненный генератор O2 к двухконтактному разъему на штекер датчика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медный катод должен соединиться с отрицательным выходом контроллера и платиновым анодом с положительным проводом. Обратные соединения приведут к провалу эксперимента. - Поместите два небольших капля прозрачной силиконовой смазки на противоположные стороны стыка матового стекла штекера датчика.
- Вставьте заглушку в камеру и поверните плунжер (или камеру) с умеренным давлением, чтобы распределить смазку в соединении.
- Сотрите излишки жира лабораторной салфеткой.
- Защелкните пластиковые зажимы Keck на соединениях, чтобы зафиксировать заглушки в камерах. Собранная камера должна выглядеть, как показано на рисунке 1С.
- Повторите описанные выше шаги для количества камер, используемых для дневного эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество камер, которые могут быть записаны, ограничено количеством доступных камер, контроллеров и USB-входов к компьютеру. В настоящих экспериментах семь камер обычно работали параллельно. Экспериментальные мухи, такие как мутанты, должны быть сопоставлены с соответствующими контрольными группами. Камера, установленная идентично, но без мух, должна быть включена в каждый эксперимент в качестве контроля за изменениями окружающей среды. Камеры, содержащие различные методы лечения (мутантный, дикий, бесполетный), следует чередовать между экспериментами. - Поместите собранные камеры в стойку на водяной бане с открытыми запорными кранами (Рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать циркадных колебаний, камеры помещались в ванну между 9:30 и 9:50 утра для всех экспериментов, описанных здесь. - Оставьте запорные краны открытыми (держите ручку параллельно запорному крану).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы вода не попала в запорные краны. - Дайте камерам уравновеситься с открытыми запорными кранами в течение примерно 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пока камера находится в равновесии, подключите электронику и настройте сбор данных, как описано ниже.
3. Настройка контроллеров и компьютера
- Убедитесь, что переключатели, подающие ток на генераторыØ2 , находятся в положении OFF (вдали от разъема; Рисунок 1D).
- Подключите каждый блок контроллера к свободному порту USB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конструирование и программирование блоков контроллеров, описанных в другом месте12. - Подключите контроллеры к камерам респирометра с помощью 6-жильных кабелей.
- Убедитесь, что на дисплеях контроллеров с органическими светодиодами (OLED) (рис. 1D) отображаются параметры окружающей среды.
- Кратковременно включите генераторы O2 с помощью переключателя на контроллере (рис. 1D).
- Если значение тока увеличивается с нуля до 35-55 мА, контроллер и камера готовы к экспериментам.
- Определите, какие COM-порты используются контроллерами, как описано ниже.
- Щелкните значок «Пуск » в Microsoft Windows.
- Нажмите на значок «Настройки ».
- Нажмите Bluetooth и устройства.
- Убедитесь, что контроллеры и их COM-порты отображаются в списке устройств.
- Откройте PuTTY на рабочем столе и настройте файл журнала для каждого канала респирометра, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: PuTTY - это бесплатная безопасная оболочка и telnet-клиент, который используется для передачи данных на компьютер через COM-порты.- Выберите COM-порт для контроллера, введя номер порта в поле «Последовательная линия» (Рисунок 2A).
- Нажмите « Ведение журнала».
- Выберите Printable Output (Вывод для печати) в разделе "Session logging" (Протокол сеанса) (рисунок 2B).
- В разделе Log File Name (Имя файла журнала) нажмите кнопку Browse (Обзор).
- В выбранной папке создайте имя файла, содержащее описательную информацию (например, дату, породу, номер COM-порта).
- Нажмите кнопку Сохранить.
- Нажмите кнопку Открыть. Откроется окно, показывающее регистрируемые данные с разделителями-запятыми (рисунок 2C).
- Повторите эти действия для всех остальных контроллеров, используемых в эксперименте. Вход на каждый COM-порт появится в виде отдельного окна (рисунок 2D).
4. Проведение экспериментов
- После того, как камеры уравновесится в течение 30 минут, загерметизируйте их, закрыв запорные краны.
- Накройте ванну и камеры коробом из пенополистирола для поддержания стабильной среды.
- Дайте уравновеситься еще час.
- Включите ток на генераторØ2 каждой камеры с помощью переключателя на блоке контроллера.
- После активации генераторов O2 убедитесь, что давление увеличилось до предварительно установленного давления OFF.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1017 гПа, что немного выше атмосферного давления, использовалось в качестве давления «OFF» в этой серии экспериментов. Возврат к атмосферному давлению будет свидетельствовать об утечке газа из камер. Кроме того, это позволяет использовать одно и то же давление в экспериментах независимо от атмосферного барометрического давления. Давление во включенном состоянии составляло 1016 гПа, что означало, что давление должно было упасть всего на 1 гПа, прежде чем генераторO2 был активирован. Это обеспечило достаточную чувствительность для измерения потребленияО2 у дрозофилы. После того, как давление в камере будет установлено до значения «OFF», ток должен упасть до нуля. - Пусть эксперимент продолжается в течение 3 или более часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокое VO2 при повышенных температурах может сократить время эксперимента. Время от времени контролируйте работоспособность оборудования, но избегайте чрезмерной активности вблизи камер, которая может повлиять на стабильность температуры.
5. Завершаем эксперимент
- Выключите генераторы O2 на всех контроллерах.
ПРИМЕЧАНИЕ: В первую очередь избегайте запуска генераторов O2 при открытых камерах. - Откройте запорные краны, чтобы открыть камеры.
- Оставьте окна PuTTY открытыми еще на 5–15 минут, чтобы получить окончательный базовый уровень.
- Закройте окно PuTTY для каждого контроллера, завершив запись.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты заканчивались между 16:50 и 17:10. - Отсоедините датчики от кабелей.
- Переместите камеры на сухую стойку.
- Вынимайте заглушки датчиков из камер по одному.
- Отсоедините генераторыØ2 и поместите их в штатив для трубок.
- Сотрите смазку со штекера датчика и храните его в стойке.
- Очистите стыки камеры от жира и удалите трубки с мухами и натронной известью.
- Обезболивайте мух в каждой пробирке с помощьюCO2, постукивайте по грузовой лодке и взвешивайте на микровесах.
- Запишите вес и количество мушек для каждой пробирки.
- Отбросьте мух или отложите их для дополнительных процедур.
- Натриевую известь из картриджей высыпать в контейнер для отходов.
- Откройте генераторO2 и выбросьте растворCuSO4 в контейнер для отходов.
- Промойте электроды и трубку очищенной водой.
- Поставьте трубные стеллажи для сушки.
6. Анализ данных переноса заряда
- Импортируйте данные в виде текста, разделенного запятыми, в электронную таблицу, при этом каждая запись будет содержать отдельный лист.
- Записывайте данные о токе и времени для каждого импульса генератораO2 . Начиная с первого импульса после того, как в камере было создано давление, записывайте время начала и время окончания (в виде номеров строк) каждого текущего импульса. Это номер строки, когда ток поднимается выше нуля (обычно примерно до 45-50 мА) до последней строки, которая выше нуля.
- Составьте на листе таблицу, в которую будут записаны следующие данные:
- Средняя амплитуда тока во время импульса: = СРЗНАЧ([первая строка импульса]:[последняя строка импульса]) для каждого импульса (из текущего столбца).
- Длительность импульса: ([Последняя строка импульса] - [первая строка импульса[-одна строка]])/1000 для каждого импульса (из столбца время в миллисекундах).
- Общее время эксперимента: [время в начале последнего импульса] - [время в конце первого импульса после герметизации камеры] (из столбца время в минутах).
- Затем вычислите перенос заряда (Q) для каждого импульса (средняя длительность тока X)
- Просуммируйте заряд всех импульсов, чтобы рассчитать общий заряд (Qtot).
7. Анализ потребленияО2
- Настройте новую электронную таблицу для всех данных и введите или рассчитайте следующее для каждой камеры:
- Qtot (общий заряд)
- Родинки (= Q ÷ 96485 × 4)
- мл O2 (= моль × 22413 мл/моль)
- Общее время (из анализа данных выше)
- мл мин-1 (= мл O2 ÷ общее время)
- Вес в граммах (мухи под наркозом и взвешенные после эксперимента)
- мл мин-1 г-1 (= мл мин-1 ÷ вес в граммах)
- мл/ч/г (вышеуказанные × 60)
- мг/муха (= вес мух ÷ количество мух)
- мкл мухи-1 ч-1 (= (мл мин-1 × 3600) ÷ количество мух).
- Сведите в таблицу данные по каждому лечению (например, генотипу)
- Сравните лечение с помощью ANOVA, t-критерия или u-критерия Манна-Уитни 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выходы давления и тока контроллера респирометра показаны для одной камеры в одном эксперименте на рисунке 3А. Первый, длинный импульс тока создавал давление в камере от давления окружающей среды (примерно 992 гПа) до заданного порога выключения 1017 гПа. По мере того, как мухи потребляли O2 и поглощалиCO2, давление медленно снижалось, пока не достигало порога ON в 1016 гПа, что активировало ток через генераторO2. В показанном примере средняя амплитуда каждого импульса составляет 50,1 мА, длительность — 16,1 с, что дает перенос заряда около 0,81 кулонов (C) на импульс. Суммарный перенос заряда для этой камеры составил 3,28 С за общее время 240,0 мин. Используя расчеты, описанные в разделе «Процедуры» с массой и количеством мух (всего 23 мухи весом 14,9 мг), расходO2 для группы в этой камере составил 3,19 мл h-1 g-1 или 2,07 мкл h-1 мухи-1.
Оборудование может быть легко настроено с минимальным обучением и надежно работает в течение многих циклов сборки и остановки. Тем не менее, оборудование необходимо регулярно обслуживать и проверять, а условия эксперимента тщательно контролировать. Например, потеря газонепроницаемого уплотнения из-за выхода из строя соединения или запорного крана может привести к быстрым циклам повышения давления и ложно высокому VO2 (рис. 3B). Кроме того, температура и влажность внутри камеры должны оставаться стабильными. Если температура или влажность снижаются, результирующее падение давления будет ошибочно интерпретироваться как расходO2. И наоборот, дрейф температуры или влажности вверх будет противодействовать снижению давления, вызванному потреблением O2, и искусственно уменьшать или устранять сигнал VO2 (рис. 3C).
Метод был использован для тестирования VO2 мутантов CASK Δ18, которые были получены путем неточного иссечения транспозирующего элемента из локуса 14 CASK и у которых локомоция резко снижена14,16. В контроле w(ex33) дикого типа, полученном точным иссечением транспозирующего элемента, средний удельный расходO2 составил 3,65 ± 0,24 мл·г-1·ч-1 (n = 16 камер; Рисунок 4А).
Несмотря на заметно сниженную локомоцию, VO2 мутантов CASKΔ18 был незначительно, но не значимо ниже, чем в контрольной группе (среднее ± с.э.м. = 3,23 ± 0,13 мл·г-1·ч-1; n = 11 групп; P = 0,08 u-критерий Манна-Уитни).
Поскольку достоверность экспрессии скорости метаболизма в терминах массы тела была поставлена под сомнение18, потреблениеO2 также было проанализировано в расчете на одну муху (рис. 4B). С помощью этого анализа VO2 был значительно снижен в CASKΔ18 по сравнению с контрольной группой дикого типа (ex33: 2,22 ± 0,13 мкл·муха-1·ч-1; БОЧКАΔ18: 1,58 ± 0,10 мкл·муха-1·ч-1; P = 0,0003, u-критерий Манна-Уитни). Однако средняя масса мух CASKΔ18 была на >20% ниже, чем у контрольной группы ex33 (рис. 4C; ex33 0,61 ± 0,01 мг; БОЧКАΔ18 0,51± 0,02 мг; P = 0,0005, u-критерий Манна-Уитни), поэтому разница в скорости метаболизма между генотипами, вероятно, обусловлена разницей в их размерах.
Рисунок 1: Настройка респирометра . (A) Схема штекера датчика (вверху) и камеры объемом 50 мл (состоящей из пробирки Шленка объемом 50 мл, внизу) перед сборкой. Обратите внимание на места соединений матового стекла 19/22, которые будут соединять камеру и штекер датчика, и которые необходимо очищать перед каждым экспериментом. Также указывается запорный кран, который необходим для открытия или герметизации камеры. (Б) Схема камеры и компонентов, собранных и готовых к эксперименту, показывающая: мокрый ватный рулон, полипропиленовую трубку с мухами, заткнутую ватной пробкой, натриево-известковый картридж и генераторО2 , заполненный CuSO4. (C) Фотография собранной камеры. Зажим Кека, крепящий заглушку к камере, частично закрыт зажимом кольцевой подставки, удерживающим камеру. (D) Фотография контроллера, показывающая переключатель, управляющий током через генератор O2 , и окно для просмотра OLED-дисплея. (E) Собранные камеры на водяной бане. Показаны семь камер, три из которых содержат мутантов, три — элементы управления дикими типами, а одна камера содержит все компоненты, кроме мух. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка сбора данных. (A) Интерфейс PuTTY для выбора последовательного порта для сбора данных. Был выбран COM3 с коэффициентом BAUD 9600, чтобы соответствовать выходу контроллера. (B) Интерфейс PuTTY для настройки файла журнала. Для включения записи данных в текстовый файл выбирается «Вывод для печати», папка данных выбирается с помощью кнопки «Обзор» и создается имя файла. (C) Файл журнала PuTTY во время эксперимента. Данные собираются примерно два раза в секунду, и каждая строка содержит следующую информацию, разделенную запятыми: номер датчика, время (мс) с начала сбора, температура в камере (°C), давление в камере (гПа), влажность (относительный процент) и ток (мА). (D) Регистрация данных во время типичного эксперимента с семью окнами для экспериментальных камер плюс один канал для регистрации температуры ванны, температуры окружающего воздуха, давления и влажности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Данные микрореспирометра. (A) Давление (серая линия, левая ось) и ток через генераторO2 (черная линия, правая ось) в одной камере респирометра, содержащей 23 Вт (ex33). В начале требуется длинный импульс тока для нагнетания давления в камере от ~992 гПа до порога OFF 1017 гПа. По мере того, как мухи потребляли O2, давление падало, пока не достигало порога ON в 1016 гПа, что активировало ток через генераторO2, который восстанавливал давление в камере до 1017 гПа. В этом эксперименте процесс повторялся шесть раз. (Б) Пример негерметичной камеры, вызванной повреждением запорного крана, взятый из другой серии экспериментов. Камера не поддерживала давление (серая линия), что приводило к постоянному циклическому электролитическому току (черная линия). Обратите внимание на шкалу времени, отличную от графика А. (В) Влияние дрейфа влажности. Потребление O2 20 мг божьим жуком (Hippodamia convergens) в камере должно было вызвать циклическую картину давления, подобную рисунку 3A, но устойчивое увеличение влажности (черная линия) вызвало артефактное увеличение давления в камере (серая линия), которое маскировало VO2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественные данные по дикому типу и мутанту CASK D. melanogaster. (A) Удельный по массе VO2 для мух дикого типа (w(ex33)) и мутантных (CASKΔ18). На всех графиках дно и верх ящиков обозначают первый и третий квартили соответственно, усы указывают на крайние значения, а размеры выборки (количество камер, каждая из которых содержит 17-24 мухи) приведены в скобках над генотипами. Мухи CASK Δ18 статистически значимо не отличаются от мух ex33 (медиана: ex33: 3,420 мл·г-1·ч-1, CASKΔ18 : 3,029 мл·г-1·ч-1; p = 0,08 u-критерий Манна-Уитни). (B) Специфичный для мух VO2. Мухи CASKΔ18потребляли значительно меньшеO2 (медиана 1,650 мл·муха-1·ч-1), чем w(ex33) (2,078 мл·муха-1·ч-1; p = 0,0003, u-критерий Манна-Уитни; значимость отмечена звездочками). (C) Масса различалась между CASKΔ18 и диким типом (медиана: 0,526 мг, ex33: 0,623 мг; p = 0,0005, u-критерий Манна-Уитни; значимость указана звездочками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1. Исследование данных респирометрии дрозофилы у мух дикого типа при 25 °C. За одним исключением18, исследования ограничиваются теми, в которых измеряется потреблениеO2 . В большинстве случаев необходимо было оценить VO2 по графикам, и приведены номера рисунков из оригинальных работ. Несмотря на то, что все генотипы считались «дикими», источники и способы размножения были различны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Приведенная выше методика демонстрирует измерение потребленияО2 у D. Melanogaster с помощью электронного кулонометрического микрореспирометра. Полученные данные о потребленииО2 у D. melanogaster дикого типа находились в пределах диапазонов, описанных в большинстве предыдущих публикаций с использованием различных методов (табл. 1), хотя и несколько ниже, чем те, о которых сообщали другие специалисты 3,6.
Важнейшие шаги были направлены на удовлетворение двух абсолютных требований метода: газонепроницаемое уплотнение и устойчивость к воздействию окружающей среды. Поддержание газонепроницаемой среды просто, но требует осторожности. Колбы и пробирки Schlenk идеально подходят в качестве спирометрических камер. Стеклянная конструкция позволяет избежать газопроницаемости, присутствующей во многих типах пластика19, что особенно важно при длительных экспериментах. Стандартные соединения обеспечивают газонепроницаемое соединение с разъемами, содержащими датчики и электронные соединения. Запорные краны обеспечивают надежное уплотнение и могут открываться или закрываться по мере необходимости во время экспериментов. Чтобы обеспечить газонепроницаемость уплотнений для каждого эксперимента, были проверены запорные краны, тщательно очищены стыки, нанесено разумное количество чистой силиконовой смазки, а соединения закреплены зажимами Кека.
Чувствительность метода ограничена стабильностью температуры и влажности внутри камеры. Изменения любого из этих параметров приведут к колебаниям давления, которые повлияют на сигнал VO2 . Использование климатической камеры12 или циркуляционной водяной бани обеспечивает более стабильный контроль температуры. Предыдущая работа ученых показала, что метод может измерять потреблениеO2 на уровне нмоль·ч-1 при температуре в пределах ±0,01 °C20. Для стабилизации влажности кусочки ватного рулона, погруженные в воду, поддерживали влажность почти на 100%. Температуре и влажности давали стабилизироваться в течение не менее 90 мин, после чего в камерах создавалось давление электролитически генерируемым O2 и начиналась запись. Все эксперименты включали в себя одну камеру, которая была собрана из всех компонентов, но не содержала мух, чтобы контролировать условия окружающей среды.
Регулярный постоянный контроль температуры, давления и влажности значительно упрощает поиск и устранение неисправностей. Например, удалось обнаружить и исправить искусственно завышенное кажущееся V O2, вызванное повреждением запорного крана (рис. 3B), или кажущуюся потерю VO2 из-за нестабильной влажности в камере (рис. 3C).
Кулонометрический микрореспирометр, описанный здесь, имеет ряд преимуществ. Во-первых, он относительно недорогой, с приблизительной общей стоимостью 100 долларов за канал (включая камеру, датчик и контроллер). Во-вторых, поскольку каждый канал собирает и передает данные независимо, система является масштабируемой, при этом количество камер ограничено только размером контроллера окружающей среды (водяная баня или камера окружающей среды) и количеством доступных USB-портов в компьютере (обычно расширяется до >100). Кроме того, поскольку камеры и контроллеры независимы, выход из строя любого из них не повлияет на другие. В-третьих, контроллеры можно легко перепрограммировать для адаптации к давлению окружающей среды или для регулировки чувствительности по мере необходимости. В связи с этим давление внутри камер установлено на фиксированное значение, поэтому экспериментальное давление будет постоянным во всех экспериментах независимо от атмосферного барометрического давления. В-четвертых, постоянный поток данных о времени, температуре, давлении, влажности и токе позволяет детально анализировать эти параметры для каждой камеры, облегчая поиск и устранение неисправностей или анализ временных изменений VO2 в более длительных экспериментах. Наконец, условия окружающей среды внутри камеры могут поддерживаться на постоянном уровне в течение многих часов или дней, поскольку потребленныйO2 постоянно восполняется. В настоящем исследовании давление в камере колебалось от 1016 до 1017 гПа, что составляет менее 0,1%, при этом результирующее изменение PO2 составило менее 0,5%. Основываясь на количествеCuSO4 в каждом генераторе O2, который может генерировать 28 млO2, и среднем VO2 групп мух в этом исследовании, 1,15 мл/день (среднее =21,8 мух на камеру), скорость метаболизма может быть изучена в течение 24 дней за один раз. Предполагая, что мухи обеспечены достаточным питанием, это означает, что метаболизм можно изучать непрерывно на протяжении большей части жизни мухи.
В настоящее время большинство исследований метаболизма у D. melanogaster основано на газовом анализе или манометрии. Методы, основанные на газовом анализе, такие как респирометры 2,3,6 с остановками и непрерывным потоком, имеют то преимущество, что метод хорошо зарекомендовал себя и оборудование доступно в продаже. Однако они требуют дорогостоящего и сложного оборудования, в том числе коллекторов и молекулярных датчиков расхода для регулирования расхода, а также газоанализаторов для измерения концентрации газов. В качестве альтернативы простые манометры9 стоят гораздо дешевле. В простейшей форме, обычно используемой для D. melanogaster, мух обезболивают и помещают в небольшую камеру, содержащую абсорбирующий материал CO2 и соединенную с резервуаром для жидкости капиллярной трубкой. По мере того, как О2 расходуется, а полученныйСО2 абсорбируется, давление в камере падает, что втягивает жидкость в капиллярную трубку. Высота жидкости пропорциональна количеству потребляемогоО2. Поскольку потребленный O2 не восполняется во время эксперимента, PO2 непрерывно уменьшается в течение эксперимента. Несмотря на то, что обычные эксперименты могут не снижать уровень P O2 в достаточной степени, чтобы отрицательно влиять на V O2, длительные эксперименты или эксперименты при повышенных температурах могут привести к истощению O2 и достижению критического значения P O2, при котором V O2 резко снижается3. Другая проблема заключается в том, что вес жидкости в капилляре оказывает нисходящее усилие, уменьшая высоту жидкости пропорционально приложенной нисходящей силе, что приводит к потенциальным ошибкам. Методы компенсации этого эффекта описаны 4,21, но они громоздки и не получили широкого распространения. Прямое сравнение газового анализа и манометрии показало, что эти два метода дают существенно разные результаты, но авторы не смогли дать удовлетворительного объяснения этому расхождению.
Несмотря на свои преимущества, кулонометрический микрореспирометр имеет и ограничения. Во-первых, в отличие от некоторых систем газового анализа, он не является коммерчески доступным. Компоненты легко приобретать, и ни конструкция, ни программирование не являются сложными, но они потенциально более сложны в конструировании, чем простые манометрическиесистемы. Во-вторых, получение точных данных должно включать в себя несколько циклов генерацииO2 , поэтому каждый эксперимент должен длиться несколько часов. Это справедливо и для экспериментов с использованием манометрии. Наконец, опять же, как и в манометрии, температура и влажность внутри камер должны быть стабильными. Тем не менее, кулонометрический микрореспирометр предлагает золотую середину с точки зрения стоимости и сложности, является прочным и надежным после сборки и точно измеряет потреблениеO2 .
Эксперименты с мутантами CASKΔ18 демонстрируют как отрицательные (массоспецифический V O2), так и положительные результаты (специфический VO2 для мух). Если бы снижение на >50% ходьбы мутантов CASK Δ18было результатом нарушения метаболизма, можно было бы предсказать, что VO2 будет снижен на аналогичную величину. Тем не менее, изменение удельного потребления O2 по массе было умеренным (снижение медианы VO2 на 9,6 %) и не было статистически значимым. Этот отрицательный результат согласуется с тем, что мутанты CASK Δ18 имеют относительно нормальный метаболизм, а поведенческий фенотип является результатом снижения двигательного побуждения. Хотя возможно, что методу не хватает достаточной чувствительности, снижение VO2, вызванное относительно небольшой разницей в размерах (снижение медианы массы на 15,5%), было весьма значимым.
Ходьба связана со значительно повышенным расходом энергии 5,23, так почему же VO2 относительно нормален у мутантов CASK? Возможно, что чрезмерный груминг у мутантов CASK16 может уравновешивать снижение ходьбы, или фенотип ходьбы менее очевиден, когда мухи тестируются группами в небольших пробирках, но эти гипотезы ждут экспериментальной проверки. Тем не менее, мы пришли к выводу, что мутации в локусе CASK не оказывают сильного, прямого влияния на метаболизм, и что кулонометрический микрореспирометр является эффективным инструментом для изучения метаболизма у D. melanogaster.
Поскольку этот аппарат легко сконструирован из обычных компонентов, точно измеряет расходO2 , очень портативный, может использоваться в любой среде со стабильной температурой и использовался с организмами размером от 0,5 мг мух (настоящее исследование) и до 500 мг скорпионов (DJS не опубликован), он добавляет универсальный инструмент для изучения метаболизма различных организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Линду Рестифо из Университета Аризоны за предложение провести тестирование потребления O2 мутантами CASK и за отправку мутантов CASK и их конгенных контрольных групп. Плата за публикацию была предоставлена Департаментским фондом реинвестирования биологического факультета Университета Колледж-Парка. Помещение и некоторое оборудование были предоставлены университетами в Шейди-Гроув.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
