Messung des_{O2-Verbrauchs} in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Summary

Die coulometrische Respirometrie ist ideal für die Messung der Stoffwechselrate kleiner Organismen. Bei der Adaption für Drosophila melanogaster in der vorliegenden Studie lag der gemessene_O2-Verbrauch innerhalb des Bereichs, der in früheren Studien für Wildtyp D. melanogaster berichtet wurde. Der_O2-Verbrauch pro Fliege war bei CASK-Mutanten , die kleiner und weniger aktiv sind, signifikant niedriger als beim Wildtyp.

Abstract

Die coulometrische Mikrorespirometrie ist eine einfache, kostengünstige Methode zur Messung des_{O2-Verbrauchs} kleiner Organismen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines stabilen Milieus. Ein coulometrisches Mikrorespirometer besteht aus einer luftdichten Kammer, in der O2 verbraucht und das vom Organismus produzierte_CO2 durch ein absorbierendes Medium entfernt wird. Der resultierende Druckabfall löst die elektrolytische_{O2-Produktion} aus, und die Menge an erzeugtem_O2 wird gemessen, indem die Menge der Ladung aufgezeichnet wird, die zu ihrer Erzeugung verwendet wurde. In der vorliegenden Studie wurde die Methode an Drosophila melanogaster angepasst, die in kleinen Gruppen getestet wurde, wobei die Empfindlichkeit der Apparatur und die Umgebungsbedingungen für eine hohe Stabilität optimiert wurden. Die Menge an_O2, die von Wildtyp-Fliegen in diesem Apparat verbraucht wird, stimmt mit der in früheren Studien gemessenen Menge überein. Der massenspezifische_O2-Verbrauch von CASK-Mutanten, die kleiner sind und von denen bekannt ist, dass sie weniger aktiv sind, unterschied sich nicht von kongenen Kontrollen. Die geringe Größe der CASK-Mutanten führte jedoch zu einer signifikanten Reduzierung des_{O2-Verbrauchs} pro Fliege. Daher ist das Mikrorespirometer in der Lage, den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, kann bescheidene Unterschiede zwischen Genotypen unterscheiden und ist ein vielseitiges Werkzeug zur Messung der Stoffwechselraten.

Introduction

Die Fähigkeit, die Stoffwechselrate zu messen, ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis eines Organismus in seinem Umweltkontext. Zum Beispiel ist es notwendig, die Stoffwechselrate zu messen, um ihre Rolle in der Lebensspanne¹, die Rolle der Ernährung im Stoffwechsel² oder die Schwelle für hypoxischen Stress³ zu verstehen.

Es gibt zwei allgemeine Ansätze zur Messung der Stoffwechselrate⁴. Die direkte Kalorimetrie misst den Energieverbrauch direkt durch die Messung der Wärmeproduktion. Die indirekte Kalorimetrie misst die Energieerzeugung auf andere Weise, oft durch respirometrische Messung des O2-Verbrauchs (V_O2), der CO_{2 -}Produktion oder beidem. Obwohl die direkte Kalorimetrie bei kleinen Ektothermen, einschließlich Drosophila melanogaster⁵, angewendet wurde, ist die Respirometrie technisch einfacher und wird häufiger verwendet.

Verschiedene Formen der Respirometrie wurden erfolgreich zur Messung der Stoffwechselrate bei Wildtyp- und mutierten D. melanogaster eingesetzt und haben Einblicke in die metabolischen Auswirkungen von Temperatur⁶, sozialem Umfeld 3, Ernährung^{3, 7 und} neurologischen Entwicklungsstörungen⁸ gegeben. Diese lassen sich in zwei Klassen einteilen, die sich in Kosten und Komplexität erheblich unterscheiden. Die Manometrie ist die einfachste und kostengünstigste ^9,10, bei der die Fliegen in eine geschlossene Kammer gesetzt werden, die ein_{CO2-Absorptionsmittel} enthält und über eine dünne Kapillare mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Wenn_O2 verbraucht und_CO2 absorbiert wird, sinkt der Druck in der Kammer und Flüssigkeit wird in die Kapillare gesaugt. Das flüssigkeitsgefüllte Volumen der Kapillare ist also proportional zu V_O2. Aufwendigere Versionen, die die Kraft der Flüssigkeit in der Kapillare kompensieren, wurden auch bei D. melanogaster¹ eingesetzt. Die Manometrie hat den Vorteil, dass sie einfach und kostengünstig ist, aber da sie druckempfindlich ist, erfordert sie konstante Umgebungsbedingungen. Da das verbrauchte O2 nicht ersetzt wird, nimmt der Partialdruck von O2 (_PO2) in den Kammern allmählich ab.

Auch die Respirometrie mittels Gasanalyse wird regelmäßig bei D. melanogaster eingesetzt. In diesem Fall werden Gase in regelmäßigen Abständen aus versiegelten Kammern, die Fliegen enthalten, entnommen und an einen Infrarot-Analysator ^2,6,11 geschickt. Diese Art von Apparatur hat den Vorteil, dass sie im Handel erhältlich ist, weniger empfindlich auf Umweltbedingungen reagiert und Gase während der Probenahme aufgefrischt werden, so dass P_O2 stabil bleibt. Die Geräte können jedoch teuer und komplex im Betrieb sein.

Ein kürzlich entwickeltes coulometrisches Mikrorespirometer¹² bietet eine kostengünstige, empfindliche und stabile Alternative zu bestehenden Systemen. In der Praxis wird ein Organismus in eine luftdichte Kammer gebracht, wo er O2 verbraucht und das ausgeatmete_CO2 durch ein absorbierendes Material entfernt wird, was zu einer Nettoabnahme des Kammerdrucks führt. Wenn der Innendruck auf einen voreingestellten Schwellenwert (ON-Schwelle) sinkt, wird Strom durch einen elektrolytischen_O2-Generator geleitet, der den Druck auf einen zweiten Schwellenwert (OFF-Schwelle) zurückführt und die Elektrolyse stoppt. Die Ladungsübertragung über den O2-Generator ist direkt proportional zu der Menge an O2, die erforderlich ist, um die Kammer wieder unter Druck zu setzen, und kann daher verwendet werden, um das vom Organismus⁴ verbrauchte_O2 zu messen. Die Methode ist hochempfindlich, misst V O2 präzise, und der regelmäßige Austausch von O2 kann P_O2 über Stunden oder Tage auf einem nahezu konstanten Niveau halten.

Das coulometrische Mikrorespirometer, das in dieser Studie verwendet wird, verwendet einen multimodalen (Druck, Temperatur und Feuchtigkeit) elektronischen Sensor. Der Sensor wird von einem Mikrocontroller betrieben, der kleine Druckänderungen erkennt und bei Erreichen einer niedrigen Druckschwelle^{12 die O2-Generation} aktiviert. Diese Apparatur wird aus handelsüblichen Teilen zusammengebaut, kann mit einer Vielzahl von Kammern und Versuchsumgebungen verwendet werden und wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von Körpermasse und Temperatur auf den Käfer Tenebrio molitor zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurde das Mikrorespirometer angepasst, um den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, der etwa 1% der Masse von T. molitor aufweist. Die Empfindlichkeit der Apparatur wurde erhöht, indem die Schwelle für die Aktivierung der_O2-Erzeugung gesenkt wurde, und die Umgebungsstabilität wurde durch die Durchführung von Experimenten in einem temperaturgesteuerten Wasserbad und durch die Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit in den Kammern bei oder nahe 100 % erhöht.

Das CASK-Protein (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), das zur Familie der membranassoziierten Guanylatkinasen (MAGUK) gehört, ist ein molekulares Gerüst in verschiedenen Multiproteinkomplexen, und Mutationen in CASK sind mit neurologischen Entwicklungsstörungen beim Menschen und bei D. melanogaster assoziiert ^13,14. Eine lebensfähige D. melanogaster-Mutante, CASK^Δ18, stört die Aktivität dopaminerger Neuronen 15 und reduziert das Aktivitätsniveau um mehr als 50 % im Vergleich zu kongenen Kontrollen^14,16. Aufgrund der reduzierten Aktivität von CASK-Mutanten und der Rolle von Katecholaminen bei der Regulierung des Stoffwechsels¹⁷ stellten wir die Hypothese auf, dass ihre Standardstoffwechselrate und damit der_O2-Verbrauch im Vergleich zu Kontrollen dramatisch reduziert wäre.

Der O2-Verbrauch wurde in CASK^Δ18 und ihren_{Wildtyp-Artgenossen} w(ex33) gemessen. Gruppen von Fliegen wurden in Respirometriekammern gesetzt, der O2-Verbrauch wurde gemessen, der_O2-Verbrauch wurde berechnet und sowohl massenspezifisch als auch pro Fliege ausgedrückt. Die Apparatur zeichnete V O2 in Wildtyp-Fliegen auf, was mit früheren Studien übereinstimmte, und sie konnte zwischen dem_O2-Verbrauch pro Fliege von Wildtyp- und CASK-mutierten Fliegen unterscheiden.

Protocol

1. Fliegenaufzucht und -sammlung

1. Halten Sie Fliegen bei 25 °C in schmalen Fläschchen mit Standardfutter für Drosophila .
   HINWEIS: Die Probengröße für jeden Genotyp sollte mindestens neun Wiederholungen umfassen, die jeweils aus einer einzigen Respirometerkammer mit 15-25 Fliegen bestehen, die wie unten beschrieben eingerichtet sind.
2. Transferieren Sie die Fliegen alle 2-3 Tage.
3. Betäuben Sie Fliegen mit CO₂, sammeln Sie Gruppen von 15-25 Männchen jedes Genotyps und legen Sie jede Gruppe in frische, nicht hefehaltige Futterfläschchen.
   HINWEIS: Männchen wurden verwendet, um die Variabilität aufgrund des Fortpflanzungsstatus zu reduzieren. Die Methode gilt für beide Geschlechter.
4. Lassen Sie die Fliegen mindestens 24 Stunden lang bei 25 °C ruhen.
   HINWEIS: Zum Zeitpunkt des Experiments sollten die Fliegen 1-4 Tage alt sein. Die in Schritt 1.3 beschriebene Häufigkeit der Entnahme kann so eingestellt werden, dass der Altersbereich der Fliegen eingegrenzt wird.

2. Aufbau und Montage der Respirometerkammer

1. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie es auf die gewünschte Temperatur für das Experiment ein.
   HINWEIS: Die folgenden Experimente wurden bei 25 °C mit 50-ml-Schlenk-Röhrchen als Kammern durchgeführt. Die Komponenten sind wie in den Abbildungen 1A, 1B und 1C dargestellt zusammenzubauen.
2. Reinigen Sie die Schlifffugen der Kammern und Sensorstopfen gründlich, indem Sie 70%iges Ethanol auf ein Labortuch (nicht direkt auf die Fuge) sprühen und Staub und altes Fett vom Sensorstopfen wischen (Abbildung 1A). Wischen Sie Ethanol mit einem frischen Labortuch ab.
3. Legen Sie 1 cm dickes Stück Watterolle, die in gereinigtem Wasser getränkt ist, in den Boden der Kammer, um die Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.
   1. Füge so viel Wasser hinzu (~0,5 ml), dass eine kleine Lache am Boden der Watterolle entsteht.
4. Wischen Sie jegliches Wasser ab, das auf die Fuge der Kammer verschüttet wurde.
5. Die Fliegen mit einem Trichter in beschriftete Polypropylen-Röhrchen umfüllen.
   1. Verstopfen Sie den Schlauch mit einer Watterolle.
      HINWEIS: Die Röhrchen bestehen aus einem 5-ml-Reagenzglas aus Polypropylen, das auf eine Länge von 5,5 cm getrimmt und mit einem heißen Messer perforiert wurde, um den freien Luftaustausch mit der Versuchskammer zu ermöglichen. Es ist bekannt, dass die CO_{2 -} Anästhesie Stoffwechselstörungen verursacht, so dass Fliegen ohne Anästhesie übertragen werden, was mehr Sorgfalt erfordert, um den Verlust der Fliegen zu vermeiden.
6. Fügen Sie einen belüfteten Schlauch mit Fliegen in jede Atemschutzkammer (auf nasse Baumwolle) ein.
7. Füllen Sie Kalk-Natronkartuschen (4-5 Pellets pro Röhrchen) und legen Sie sie auf die Oberseite des Röhrchens mit den Fliegen in der Kammer.
   HINWEIS: Kalk-Natronkartuschen bestehen aus 800-μl-Zentrifugenröhrchen, die 4-5 Mal mit einer Bohrmaschine perforiert werden.
8. O2-Generatoren mit gesättigter Kupfersulfatlösung (CuSO₄) unterhalb der Höhe der Entlüftungslöcher füllen
   HINWEIS: O_{2-Generatoren} bestehen aus Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss und 4 Löchern, die unterhalb der Gewinde gebohrt sind. Platin- (Pt) und Kupferelektroden (Cu) werden an zweipolige Steckverbinder gelötet, in Löcher in die Kappe gebohrt und mit Epoxidharz befestigt. Die Elektrolyse von_CuSO4 erzeugt das_O2 , das vom Versuchsorganismus verbraucht wird. CuSO₄ ist giftig für wirbellose Tiere, vermeiden Sie Verschüttungen oder Leckagen und reinigen Sie es sofort.
9. Den gefüllten_O2-Generator an den zweipoligen Stecker am Sensorstecker anschließen.
   HINWEIS: Die Kupferkathode muss mit dem negativen Ausgang des Controllers und die Platinanode mit dem positiven Draht verbunden werden. Umgekehrte Verbindungen führen zum Fehlschlagen des Experiments.
10. Geben Sie zwei kleine Tupfer klares Silikonfett auf gegenüberliegende Seiten der Schlifffuge des Sensorsteckers.
11. Setzen Sie den Stopfen in die Kammer ein und drehen Sie den Stopfen (oder die Kammer) mit mäßigem Druck, um das Fett in der Verbindung zu verteilen.
    1. Überschüssiges Fett mit einem Labortuch abwischen.
12. Schnappen Sie Kunststoff-Keck-Klemmen an Gelenken, um Stopfen in Kammern zu sichern. Die zusammengebaute Kammer sollte wie in Abbildung 1C aussehen.
13. Wiederholen Sie die obigen Schritte für die Anzahl der Kammern, die für das Experiment des Tages verwendet werden.
    HINWEIS: Die Anzahl der Kammern, die aufgezeichnet werden können, ist durch die Anzahl der verfügbaren Kammern, Controller und USB-Eingänge für den Computer begrenzt. Für die vorliegenden Experimente wurden in der Regel sieben Kammern parallel betrieben. Versuchsfliegen wie Mutanten sollten mit geeigneten Kontrollen abgeglichen werden. Eine identisch aufgebaute Kammer, aber ohne Fliegen, sollte in jedes Experiment einbezogen werden, um die Variation der Umwelt zu kontrollieren. Kammern, die verschiedene Behandlungen (Mutante, Wildtyp, Flugverbot) enthalten, sollten zwischen den Experimenten gewechselt werden.
14. Die zusammengebauten Kammern werden bei geöffneten Hähnen in ein Gestell im Wasserbad gestellt (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Um zirkadiane Schwankungen zu vermeiden, wurden für alle hier beschriebenen Experimente zwischen 9:30 und 9:50 Uhr Kammern in die Badewanne gestellt.
15. Absperrhähne offen lassen (Halten Sie den Griff parallel zum Absperrhahn).
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass kein Wasser in die Absperrhähne eindringt.
16. Lassen Sie die Kammern mit geöffneten Hähnen ca. 30 Minuten lang ausbalancieren.
    HINWEIS: Während die Kammer im Gleichgewicht ist, schließen Sie die Elektronik an und richten Sie die Datenerfassung wie unten beschrieben ein.

3. Einrichten von Controllern und Computer

1. Vergewissern Sie sich, dass sich die Schalter, die die O_{2-Generatoren} mit Strom versorgen, in der OFF-Position befinden (weg vom Stecker; Abbildung 1D).
2. Schließen Sie jede Controller-Box an einen verfügbaren USB-Anschluss (Universal Serial Bus) an.
   HINWEIS: Aufbau und Programmierung von Steuergeräten, die an anderer Stelle^{beschrieben werden 12}.
3. Verbinden Sie die Controller mit 6-adrigen Kabeln mit den Respirometerkammern.
4. Vergewissern Sie sich, dass auf den OLED-Displays (Organic Light Emitting Diode) der Controller (Abbildung 1D) Umgebungsparameter angezeigt werden.
5. Schalten Sie die Generatoren O₂ kurz mit dem Schalter am Regler ein (Abbildung 1D).
   1. Steigt der Stromwert von Null auf 35 bis 55 mA, sind Regler und Kammer bereit für Experimente.
6. Ermitteln Sie, welche COM-Ports von den Controllern verwendet werden, wie unten beschrieben.
   1. Klicken Sie in Microsoft Windows auf das Startsymbol .
   2. Klicken Sie auf das Symbol Einstellungen .
   3. Klicken Sie auf Bluetooth und Geräte.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Controller und ihre COM-Ports in der Liste der Geräte angezeigt werden.
7. Öffnen Sie PuTTY auf dem Desktop und richten Sie eine Protokolldatei für jeden Kanal des Respirometers ein, wie unten beschrieben.
   HINWEIS: PuTTY ist ein kostenloser sicherer Shell- und Telnet-Client, der verwendet wird, um Daten über COM-Ports auf den Computer zu übertragen.
   1. Wählen Sie den COM-Port für einen Controller aus, indem Sie die Nummer des Ports in das Feld "Serielle Leitung" eingeben (Abbildung 2A).
   2. Klicken Sie auf Protokollierung.
   3. Wählen Sie unter "Sitzungsprotokollierung" die Option Druckbare Ausgabe aus (Abbildung 2B).
   4. Klicken Sie unter Protokolldateiname auf Durchsuchen.
   5. Erstellen Sie im gewünschten Ordner einen Dateinamen, der beschreibende Informationen enthält (z. B. Datum, Spezies, COM-Port-Nummer).
   6. Klicken Sie auf Speichern.
   7. Klicken Sie auf Öffnen. Es öffnet sich ein Fenster, in dem durch Kommas getrennte Daten protokolliert werden (Abbildung 2C).
   8. Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Controller, die für das Experiment verwendet werden. Die Eingabe an jedem COM-Port wird als separates Fenster angezeigt (Abbildung 2D).

4. Durchführen von Experimenten

1. Sobald sich die Kammern 30 Minuten lang ausbalanciert haben, verschließen Sie sie, indem Sie die Hähne schließen.
2. Decken Sie das Bad und die Kammern mit einer Styroporschaumbox ab, um eine stabile Umgebung zu erhalten.
3. Eine weitere Stunde ausgleichen lassen.
4. Schalten Sie den Strom für den_O2-Generator jeder Kammer mit dem Schalter an der Reglerbox ein.
5. Sobald die O_{2-Generatoren} aktiviert sind, stellen Sie sicher, dass der Druck auf den voreingestellten AUS-Druck ansteigt.
   ANMERKUNG: 1017 hPa, was etwas über dem atmosphärischen Druck liegt, wurde in dieser Versuchsreihe als "OFF"-Druck verwendet. Die Rückkehr zum Umgebungsdruck zeigt an, dass Gas aus den Kammern austritt. Darüber hinaus ermöglicht es die Verwendung des gleichen Drucks in allen Experimenten, unabhängig vom barometrischen Umgebungsdruck. Der "ON"-Druck betrug 1016 hPa, was bedeutet, dass der Druck nur um 1 hPa sinken musste, bevor der_O2-Generator aktiviert wurde. Dies lieferte eine ausreichende Sensitivität, um den_O2-Verbrauch in Drosophila zu messen. Sobald eine Kammer unter Druck gesetzt wird, sollte der Strom auf Null fallen.
6. Lassen Sie das Experiment 3 oder mehr Stunden lang laufen.
   HINWEIS: Höhere V_O2 bei erhöhten Temperaturen können kürzere Versuchszeiten ermöglichen. Überwachen Sie gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Geräte funktionieren, aber vermeiden Sie übermäßige Aktivitäten in der Nähe der Kammern, die die Temperaturstabilität beeinträchtigen könnten.

5. Beenden des Experiments

1. Schalten Sie die_{O2-Generatoren} an allen Reglern aus.
   HINWEIS: Tun Sie dies zuerst, um zu vermeiden, dass die O_{2-Generatoren} laufen, während die Kammern geöffnet sind.
2. Öffnen Sie die Absperrhähne, um die Kammern zu entsiegeln.
3. Lassen Sie die PuTTY-Fenster für weitere 5-15 Minuten geöffnet, um eine endgültige Ausgangsbasis zu erhalten.
4. Schließen Sie das PuTTY-Fenster für jeden Controller und beenden Sie die Aufzeichnungen.
   HINWEIS: Alle Experimente endeten zwischen 16:50 und 17:10 Uhr.
5. Trennen Sie die Sensoren von den Kabeln.
6. Schieben Sie die Kammern in den Trockenkorb.
7. Entfernen Sie die Sensorstopfen nacheinander aus den Kammern.
8. Trennen Sie die O_{2-Generatoren} und setzen Sie sie in das Röhrchengestell ein.
9. Wischen Sie den Sensorstecker vom Fett ab und bewahren Sie ihn im Gestell auf.
10. Reinigen Sie die Kammergelenke von Fett und entfernen Sie Schläuche mit Fliegen und Kalknatron.
11. Anästhesiefliegen werden in jedem Röhrchen mit CO 2 betäubt_, auf ein Gewichtsboot geklopft und auf einer Mikrowaage gewogen.
    1. Protokollieren Sie das Gewicht und die Anzahl der Fliegen für jede Röhre.
12. Werfen Sie Fliegen weg oder legen Sie sie für weitere Prozeduren beiseite.
13. Kippen Sie Kalknatron-Natron-Kalk aus den Kartuschen in den Abfallbehälter.
14. Öffnen Sie den_O2-Generator und entsorgen Sie die_{CuSO4-Lösung} in den Abfallbehälter.
    1. Spülen Sie Elektroden und Röhrchen mit gereinigtem Wasser.
    2. Platzieren Sie die Röhrchengestelle zum Trocknen.

6. Analyse der Ladungsübertragungsdaten

1. Importieren Sie Daten als durch Kommas getrennten Text in eine Tabelle, wobei jeder Datensatz ein separates Arbeitsblatt enthält.
2. Zeichnen Sie die aktuellen und Zeitdaten für jeden Impuls des_{O2-Generators} auf. Beginnend mit dem ersten Impuls, nachdem die Kammer unter Druck gesetzt wurde, notieren Sie die Start- und Endzeit (als Zeilennummern) jedes Stromimpulses. Das ist die Zeilennummer, wenn der Strom über Null (normalerweise auf etwa 45-50 mA) bis zur letzten Reihe, die über Null liegt, geht.
3. Erstellen Sie eine Tabelle auf dem Arbeitsblatt, um die folgenden Daten aufzuzeichnen:
   1. Die durchschnittliche Stromamplitude während des Impulses: = MITTELWERT([erste Impulszeile]:[letzte Impulszeile]) für jeden Impuls (aus der aktuellen Spalte).
   2. Impulsdauer: ([Letzte Impulszeile] - [erste Impulszeile[-eine Zeile]])/1000 für jeden Impuls (aus der Spalte Zeit in Millisekunden).
   3. Gesamtversuchszeit: [Zeit zu Beginn des letzten Impulses] - [Zeit am Ende des ersten Impulses nach Druckbeaufschlagung der Kammer] (aus der Spalte Zeit in Minuten).
4. Berechnen Sie dann den Ladungstransfer (Q) für jeden Impuls (durchschnittlicher Strom X Dauer)
5. Addieren Sie die Ladung aus allen Impulsen, um die Gesamtladung (Q_tot) zu berechnen.

7. Analyse des_{O2-Verbrauchs}

1. Richten Sie eine neue Tabelle für alle Daten ein und geben Sie für jede Kammer Folgendes ein oder berechnen Sie Folgendes:
   1. Q_tot (Gesamtladung)
   2. Muttermale (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL_O2 (= Mol × 22413 mL/mol)
   4. Gesamtzeit (aus der obigen Datenanalyse)
   5. mL ^min-1 (= ml_O2 ÷ Gesamtzeit)
   6. Gewicht in Gramm (Fliegen, betäubt und gewogen, gemessen nach dem Experiment)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 ÷ Gewicht in Gramm)
   8. ml/h/g (die oben genannten × 60)
   9. mg/Fliege (= Gewicht der Fliegen ÷ Anzahl der Fliegen)
   10. μL fly-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ Anzahl der Fliegen).
2. Tabellarische Daten für jede Behandlung (z.B. Genotyp)
3. Vergleichen Sie Behandlungen mit ANOVA, t-Test oder Mann-Whitney u-test ¹³.

Representative Results

Die Druck- und Stromausgänge des Respirometer-Controllers sind für eine Kammer in einem Experiment in Abbildung 3A dargestellt. Der erste, lange Stromimpuls beaufschlagte die Kammer vom Umgebungsdruck (ca. 992 hPa) bis zur voreingestellten Ausschaltschwelle von 1017 hPa. Als die Fliegen O 2 verbrauchten und CO₂ absorbiert wurde, sank der Druck langsam, bis er die EIN-Schwelle von 1016 hPa erreichte, wodurch Strom durch den_O2-Generator aktiviert wurde. Im gezeigten Beispiel beträgt die durchschnittliche Amplitude jedes Pulses 50,1 mA, die Dauer beträgt 16,1 s, was einen Ladungstransfer von etwa 0,81 Coulomb (C) pro Puls ergibt. Der gesamte Ladungstransfer für diese Kammer betrug 3,28 °C über eine Gesamtzeit von 240,0 min. Unter Verwendung der in Verfahren beschriebenen Berechnungen mit der Masse und Anzahl der Fliegen (23 Fliegen mit einem Gesamtgewicht von 14,9 mg) betrug der_O2-Verbrauch für die Gruppe in dieser Kammer 3,19 ml h-1 g-1 oder 2,07 μl h-1 ^fly-1.

Die Geräte lassen sich einfach und mit minimalem Schulungsaufwand einrichten und arbeiten zuverlässig über viele Montage- und Abschaltzyklen hinweg. Nichtsdestotrotz müssen die Geräte regelmäßig gewartet und inspiziert werden, und die Versuchsbedingungen müssen sorgfältig kontrolliert werden. So kann beispielsweise der Verlust einer gasdichten Abdichtung durch das Versagen einer Verbindung oder eines Absperrhahns zu schnellen Druckbeaufschlagungszyklen und fälschlicherweise hohen_V-O2-Werten führen (Abbildung 3B). Darüber hinaus müssen Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Kammer stabil bleiben. Sinkt die Temperatur oder die Luftfeuchtigkeit, wird der resultierende Druckabfall fälschlicherweise als Verbrauch von O₂ interpretiert. Umgekehrt wirkt eine Aufwärtsdrift der Temperatur oder der Luftfeuchtigkeit dem durch den O2-Verbrauch verursachten Druckabfall entgegen und reduziert oder eliminiert das V_O2-Signal künstlich (Abbildung 3C).

Die Methode wurde verwendet, um V_O2 von CASK-Δ18-Mutanten zu testen, die durch ungenaue Exzision eines transponierbaren Elements aus dem CASK-Locus 14 erzeugt wurden und bei denen die Fortbewegung drastisch reduziert ist^14,16. In Wildtyp-w(ex33)-Kontrollen, die durch präzise Exzision des transponierbaren Elements erzeugt wurden, betrug der durchschnittliche massenspezifische_O2-Verbrauch 3,65 ± 0,24 mL·g-1·^h-1 (n = 16 Kammern; Abbildung 4A).

Trotz ihrer sichtbar reduzierten Fortbewegung war das V_O2 der CASK-Δ18-Mutanten leicht, aber nicht signifikant niedriger als das der Kontrollen (Mittelwert ± s.e.m.= 3,23 ± 0,13 mL·g-1·^h-1; n = 11 Gruppen; P = 0,08 Mann-Whitney-u-Test).

Da die Gültigkeit der Angabe der Stoffwechselrate in Bezug auf die Körpermasse in Frage gestellt wurde¹⁸, wurde der_O2-Verbrauch auch pro Fliege analysiert (Abbildung 4B). Mit Hilfe dieser Analyse war V_O2 in CASK^Δ18 im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen signifikant reduziert (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·^h-1; BEHÄLTER^Δ18: 1,58 ± 0,10 μL·fly-1·^h-1; P = 0,0003, Mann-Whitney-U-Test). Die mittlere Masse der CASK^Δ18-Fliegen war jedoch >20 % niedriger als die der ex33-Kontrollen (Abbildung 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; BEHÄLTER^Δ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, Mann-Whitney-u-Test), so dass der Unterschied in der Stoffwechselrate zwischen den Genotypen wahrscheinlich auf den Unterschied in ihrer Größe zurückzuführen ist.

Abbildung 1: Aufbau des Respirometers . (A) Diagramm des Sensorsteckers (oben) und der 50-ml-Kammer (bestehend aus einem 50-ml-Schlenk-Röhrchen, unten) vor der Montage. Notieren Sie sich die Positionen der 19/22-Schlifffugen, die die Kammer und den Sensorstopfen verbinden und die vor jedem Experiment gereinigt werden müssen. Der Absperrhahn, der zum Öffnen oder Verschließen der Kammer notwendig ist, ist ebenfalls angegeben. (B) Diagramm der Kammer und der Komponenten, zusammengebaut und bereit für den Versuch, mit folgenden Darstellungen: nasse Watterolle, Polypropylenschlauch mit Fliegen, verstopft mit einem Baumwollstopfen, Kalk-Natron-Kartusche und_O2-Generator , gefüllt mit CuSO₄. (C) Foto der zusammengebauten Kammer. Die Keckklemme, mit der der Stecker an der Kammer befestigt ist, wird teilweise von der Ringständerklemme verdeckt, die die Kammer hält. (D) Foto des Controllers, der den Schalter zeigt, der den Strom über den_O2-Generator steuert, und ein Fenster zur Anzeige des OLED-Displays. (E) Zusammengebaute Kammern in einem Wasserbad. Gezeigt werden sieben Kammern, von denen drei Mutanten enthalten, drei mit Wildtyp-Kontrollen und eine Kammer alle Komponenten außer Fliegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Einrichtung der Datenerfassung. (A) PuTTY-Schnittstelle zur Auswahl der seriellen Schnittstelle für die Datenerfassung. COM3 wurde mit einer Baudrate von 9600 gewählt, um dem Ausgang des Controllers zu entsprechen. (B) PuTTY-Schnittstelle zum Einrichten einer Logdatei. "Druckbare Ausgabe" wird ausgewählt, um die Protokollierung von Daten in einer Textdatei zu ermöglichen, der Datenordner wird über die Schaltfläche "Durchsuchen" ausgewählt und ein Dateiname wird erstellt. (C) PuTTY-Protokolldatei während eines Experiments. Die Daten werden ungefähr zweimal pro Sekunde erfasst, und jede Zeile enthält die folgenden durch Kommas getrennten Informationen: Sensornummer, Zeit (ms) seit Beginn der Erfassung, Kammertemperatur (°C), Kammerdruck (hPa), Luftfeuchtigkeit (Prozent relativ) und Strom (mA). (D) Datenaufzeichnung während eines typischen Experiments mit sieben Fenstern für Versuchskammern und einem Kanal, der Badtemperatur, Umgebungslufttemperatur, Druck und Luftfeuchtigkeit aufzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Daten des Mikrorespirometers. (A) Druck (graue Linie, linke Achse) und Strom über dem_O2-Generator (schwarze Linie, rechte Achse) in einer einzigen Respirometerkammer mit 23 W(ex33)-Fliegen. Zu Beginn ist ein langer Stromimpuls erforderlich, um die Kammer von ~992 hPa bis zur AUS-Schwelle von 1017 hPa unter Druck zu setzen. Als die Fliegen O 2 verbrauchten, sank der Druck, bis er die EIN-Schwelle von 1016 hPa erreichte, wodurch Strom durch den O_2-Generator aktiviert wurde, der die Kammer wieder auf 1017 hPa druckbeaufschlagte. Der Vorgang wurde in diesem Experiment sechsmal wiederholt. (B) Ein Beispiel für eine undichte Kammer, die durch einen beschädigten Absperrhahn verursacht wird, aus einer anderen Versuchsreihe. Die Kammer konnte den Druck nicht aufrechterhalten (graue Linie), was zu einem ständigen Zyklus des Elektrolytstroms führte (schwarze Linie). Beachten Sie, dass sich die Zeitskala von Tafel A unterscheidet. (C) Auswirkung der Drift der Luftfeuchtigkeit. Der Verbrauch von O₂ durch den 20 mg Marienkäfer (Hippodamia convergens) in der Kammer hätte ein zyklisches Druckmuster ähnlich wie in Abbildung 3A erzeugen müssen, aber der stetige Anstieg der Luftfeuchtigkeit (schwarze Linie) verursachte einen künstlichen Anstieg des Kammerdrucks (graue Linie), der V_O2 maskierte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantitative Daten von Wildtyp- und CASK-Mutanten D. melanogaster. (A) Massenspezifisches V_O2 für Wildtyp- (w(ex33)) und mutierte (CASK-Δ18) Fliegen. In allen Diagrammen zeigen die Unter- und Oberseite der Kästchen das erste bzw. dritte Quartil an, die Schnurrhaare zeigen Extremwerte an, und die Stichprobengrößen (Anzahl der Kammern mit jeweils 17-24 Fliegen) sind in Klammern über den Genotypen angegeben. CASK Δ18 Fliegen unterscheiden sich statistisch nicht signifikant von ex33 (Median: ex33: 3.420 mL·g-1·h-1, CASK^Δ18 : 3.029 mL·g-1·h-1; p = 0.08 Mann-Whitney ^u-Test). (B) Fliegenspezifisches V_O2. CASK^Δ18-Fliegenverbrauchten signifikant weniger_O2 (Median 1.650 mL·fly-1·h-1) als w(ex33) (2.078 mL·fly-1·h-1; p = 0,0003, Mann-Whitney-u-Test; Signifikanz durch Sternchen angegeben). (C) Die Masse unterschied sich zwischen CASK^Δ18 und dem Wildtyp (Median: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, Mann-Whitney-u-Test; Signifikanz durch Sternchen gekennzeichnet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1. Untersuchung von Drosophila-Respirometriedaten von Wildtyp-Fliegen bei 25 °C. Mit einer Ausnahme^{von 18} beschränken sich die Untersuchungen auf die Messung des_{O2-Verbrauchs} . In den meisten Fällen war es notwendig, V_O2 anhand von Diagrammen zu schätzen, und es werden Abbildungszahlen aus den Originalarbeiten angegeben. Obwohl alle Genotypen als "Wildtyp" eingestuft wurden, variierten die Quellen und Vermehrungsmethoden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Das obige Verfahren zeigt die Messung des_{O2-Verbrauchs} in D. Melanogaster mit einem elektronischen coulometrischen Mikrorespirometer. Die resultierenden Daten für den_O2-Verbrauch bei Wildtyp-D. melanogaster lagen innerhalb der Bereiche, die in den meisten früheren Veröffentlichungen mit verschiedenen Methoden beschrieben wurden (Tabelle 1), wenn auch etwas niedriger als die^{von anderen berichteten 3,6}.

Kritische Schritte betrafen die beiden absoluten Anforderungen des Verfahrens: gasdichte Abdichtung und Umweltstabilität. Die Aufrechterhaltung einer gasdichten Umgebung ist einfach, erfordert aber Sorgfalt. Schlenk Kolben und Schläuche eignen sich hervorragend als Respirometriekammern. Die Glaskonstruktion vermeidet die Gasdurchlässigkeit, die in vielen Kunststoffarten vorhanden ist¹⁹, was besonders bei längeren Experimenten kritisch ist. Die Standardverbindungen ermöglichen gasdichte Verbindungen mit den Steckern, die die Sensoren und elektronischen Anschlüsse enthalten. Absperrhähne sorgen für zuverlässige Dichtungen und können bei Experimenten je nach Bedarf geöffnet oder geschlossen werden. Um die gasdichten Dichtungen für jedes Experiment zu gewährleisten, wurden die Absperrhähne inspiziert, die Verbindungen gründlich gereinigt, angemessene Mengen an sauberem Silikonfett aufgetragen und die Verbindungen mit Keck-Klemmen gesichert.

Die Empfindlichkeit des Verfahrens wird durch die Stabilität von Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Kammer begrenzt. Änderungen in einem der beiden Parameter führen zu Druckschwankungen, die das V_O2-Signal stören. Die Verwendung einer Klimakammer¹² oder eines zirkulierenden Wasserbades sorgt für eine stabilere Temperaturregelung. Frühere Arbeiten anderer haben gezeigt, dass die Methode den_O2-Verbrauch auf dem nmol·^h-1-Niveau messen kann, wenn die Temperatur innerhalb von ±0,01 °C²⁰ gehalten wurde. Um die Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren, hielten Baumwollrollenstücke, die in Wasser getaucht wurden, die Luftfeuchtigkeit bei fast 100 %. Temperatur und Luftfeuchtigkeit wurden für mindestens 90 Minuten stabilisiert, bevor die Kammern mit elektrolytisch erzeugtem_O2 unter Druck gesetzt wurden und mit den Aufzeichnungen begonnen wurde. Alle Experimente enthielten eine Kammer, die mit allen Komponenten zusammengebaut war, aber keine Fliegen enthielt, um die Umweltbedingungen zu überwachen.

Die ständige regelmäßige Überwachung von Temperatur, Druck und Luftfeuchtigkeit vereinfacht die Fehlersuche erheblich. So konnten beispielsweise der künstlich hohe scheinbare V-O2-Wert durch einen beschädigten Absperrhahn (Bild 3B) oder der scheinbare Verlust von_V-O2 aufgrund einer instabilen Kammerfeuchte (Abbildung 3C) erkannt und korrigiert werden.

Das hier beschriebene coulometrische Mikrorespirometer hat mehrere Vorteile. Erstens ist es relativ kostengünstig, mit ungefähren Gesamtkosten von 100 US-Dollar pro Kanal (bestehend aus Kammer, Sensor und Controller). Zweitens, da jeder Kanal Daten unabhängig voneinander erfasst und überträgt, ist das System skalierbar, wobei die Anzahl der Kammern nur durch die Größe des Umgebungsreglers (Wasserbad oder Klimakammer) und die Anzahl der verfügbaren USB-Anschlüsse im Computer begrenzt ist (in der Regel auf >100 erweiterbar). Da die Kammern und Kontrolleure unabhängig voneinander sind, wirkt sich der Ausfall einer von ihnen nicht auf die anderen aus. Drittens können die Regler einfach umprogrammiert werden, um sich an den Umgebungsdruck anzupassen oder die Empfindlichkeit nach Bedarf anzupassen. In diesem Zusammenhang wird der Druck in den Kammern auf einen festen Wert eingestellt, so dass der experimentelle Druck über alle Experimente hinweg unabhängig vom barometrischen Umgebungsdruck konstant bleibt. Viertens ermöglicht der stetige Datenstrom in Bezug auf Zeit, Temperatur, Druck, Feuchte und Strom eine detaillierte Analyse dieser Parameter für jede Kammer, was die Fehlersuche oder die Analyse von zeitlichen Änderungen von V_O2 in längeren Experimenten erleichtert. Schließlich können die Umgebungsbedingungen im Inneren der Kammer über viele Stunden oder Tage auf einem konstanten Niveau gehalten werden, da verbrauchtes_O2 kontinuierlich ausgetauscht wird. In der vorliegenden Studie schwankte der Kammerdruck von 1016 bis 1017 hPa, was weniger als 0,1 % entspricht, wobei die resultierende Variation von P_O2 weniger als 0,5 % betrug. Basierend auf der Menge an CuSO₄ in jedem_O2-Generator, der 28 ml O2 erzeugen kann, und dem durchschnittlichen V_O2 von Fliegengruppen in dieser Studie, 1,15 ml/Tag (Mittelwert =_21,8 Fliegen pro Kammer), kann die Stoffwechselrate bis zu 24 Tage lang untersucht werden. Unter der Annahme, dass die Fliegen ausreichend ernährt werden, bedeutet dies, dass der Stoffwechsel während des größten Teils der Lebensspanne einer Fliege kontinuierlich untersucht werden kann.

Derzeit basieren die meisten Studien zum Stoffwechsel von D. melanogaster auf Gasanalysen oder Manometrie. Methoden, die auf der Gasanalyse beruhen, wie z. B. Stop-Flow- und Continuous-Flow-Respirometer ^2,3,6, haben den Vorteil^, dass die Methode gut etabliert ist und Geräte kommerziell erhältlich sind. Sie erfordern jedoch teure und komplexe Geräte, darunter Verteiler und molekulare Durchflusssensoren zur Regulierung des Durchflusses und Gasanalysatoren zur Messung der Gaskonzentrationen. Alternativ sind einfache Manometer⁹ weitaus kostengünstiger. In der einfachsten Form, die üblicherweise für D. melanogaster verwendet wird, werden die Fliegen betäubt und in eine kleine Kammer gebracht, die CO_{2 -}absorbierendes Material enthält und die durch ein Kapillarrohr mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Wenn O2 verbraucht und das entstehende_CO2 absorbiert wird, sinkt der Druck in der Kammer, wodurch Flüssigkeit in das Kapillarrohr gezogen wird. Die Höhe des Fluids ist dann proportional zur verbrauchten_O2-Menge. Da das verbrauchte O2 während des Experiments nicht ersetzt wird, nimmt P_O2 im Laufe des Versuchs kontinuierlich ab. Obwohl Routineexperimente P O2 möglicherweise nicht ausreichend reduzieren, um V O2 negativ zu beeinflussen, können längere Experimente oder Experimente bei erhöhten Temperaturen O₂ abbauen und den kritischen P_O2 erreichen, bei dem V _O2 stark abnimmt³. Ein weiteres Problem besteht darin, dass das Gewicht der Flüssigkeit in der Kapillare eine nach unten gerichtete Kraft ausübt, wodurch sich die Höhe der Flüssigkeit proportional zur nach unten ausgeübten Kraft verringert, was zu potenziellen Fehlern führt. Methoden zur Kompensation dieses Effekts wurden beschrieben ^4,21, sind aber umständlich und nicht weit verbreitet. Der direkte Vergleich von Gasanalyse und Manometrie zeigte, dass die beiden Methoden signifikant unterschiedliche Ergebnisse lieferten, aber die Autoren waren nicht in der Lage, eine zufriedenstellende Erklärung für die Diskrepanz zu finden²².

Trotz seiner Vorteile hat das coulometrische Mikrorespirometer auch seine Grenzen. Erstens ist es im Gegensatz zu einigen Stop-Flow-Gasanalysesystemen nicht im Handel erhältlich. Die Komponenten sind leicht zu beschaffen und weder das Design noch die Programmierung sind kompliziert, aber es ist potentiell komplexer zu konstruieren als die einfachen manometrischen Systeme⁹. Zweitens muss die Erfassung genauer Daten mehrere Zyklen der_O2-Erzeugung umfassen, so dass jedes Experiment mehrere Stunden dauern muss. Dies gilt auch für Experimente mit Hilfe der Manometrie. Schließlich müssen wie bei der Manometrie die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit in den Kammern stabil sein. Nichtsdestotrotz bietet das coulometrische Mikrorespirometer einen Mittelweg in Bezug auf Kosten und Komplexität, ist im montierten Zustand robust und zuverlässig und misst den_O2-Verbrauch präzise.

Die ^{Experimente mit CASK-Δ18-Mutanten} zeigen sowohl negative (massenspezifisches V O2) als auch positive (fliegenspezifisches V_O2) Ergebnisse. Wenn die >50%ige Reduktion des Gehens von CASK-Δ18-Mutantenauf einen beeinträchtigten Stoffwechsel zurückzuführen wäre, könnte vorhergesagt werden, dass V_O2 um eine ähnliche Menge reduziert würde. Die Veränderung des massenspezifischen O2-Verbrauchs war jedoch moderat (9,6 % Reduktion des mittleren_V-O2) und statistisch nicht signifikant. Dieses negative Ergebnis stimmt mit ^{CASK-Δ18-Mutanten} überein, die einen relativ normalen Stoffwechsel aufweisen, wobei der Verhaltensphänotyp auf einen verminderten Bewegungsantrieb zurückzuführen ist. Obwohl es möglich ist, dass die Methode nicht ausreichend sensitiv ist, war die Reduktion von V_O2, die durch einen relativ geringen Größenunterschied (15,5 % Verringerung der Medianmasse) verursacht wurde, hochsignifikant.

Gehen ist mit einem signifikant erhöhten Energieverbrauch verbunden^5,23, warum also ist V_O2 in CASK-Mutanten relativ normal? Es ist möglich, dass diese exzessive Fellpflege in CASK-Mutanten¹⁶ die Verringerung des Gehens ausgleichen könnte, oder dass der Gehphänotyp weniger offensichtlich ist, wenn Fliegen in Gruppen in kleinen Röhrchen getestet werden, aber diese Hypothesen warten auf eine experimentelle Überprüfung. Nichtsdestotrotz kommen wir zu dem Schluss, dass Mutationen im CAK-Locus keine starken, direkten Auswirkungen auf den Stoffwechsel haben und dass das coulometrische Mikrorespirometer ein effektives Werkzeug zur Untersuchung des Stoffwechsels in D. melanogaster ist.

Da dieses Gerät einfach aus gemeinsamen Komponenten aufgebaut werden kann, den_O2-Verbrauch präzise misst, sehr tragbar ist, in jeder Umgebung mit stabiler Temperatur verwendet werden kann und mit Organismen von nur 0,5 mg Fliegen (die vorliegende Studie) und bis zu 500 mg Skorpione (DJS unveröffentlicht) verwendet wurde, ist es ein vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung des Stoffwechsels verschiedener Organismen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers