Messung desO2-Verbrauchs in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Zusammenfassung

Die coulometrische Respirometrie ist ideal für die Messung der Stoffwechselrate kleiner Organismen. Bei der Adaption für Drosophila melanogaster in der vorliegenden Studie lag der gemessene_O2-Verbrauch innerhalb des Bereichs, der in früheren Studien für Wildtyp D. melanogaster berichtet wurde. Der_O2-Verbrauch pro Fliege war bei CASK-Mutanten , die kleiner und weniger aktiv sind, signifikant niedriger als beim Wildtyp.

Zusammenfassung

Die coulometrische Mikrorespirometrie ist eine einfache, kostengünstige Methode zur Messung des_{O2-Verbrauchs} kleiner Organismen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines stabilen Milieus. Ein coulometrisches Mikrorespirometer besteht aus einer luftdichten Kammer, in der O2 verbraucht und das vom Organismus produzierte_CO2 durch ein absorbierendes Medium entfernt wird. Der resultierende Druckabfall löst die elektrolytische_{O2-Produktion} aus, und die Menge an erzeugtem_O2 wird gemessen, indem die Menge der Ladung aufgezeichnet wird, die zu ihrer Erzeugung verwendet wurde. In der vorliegenden Studie wurde die Methode an Drosophila melanogaster angepasst, die in kleinen Gruppen getestet wurde, wobei die Empfindlichkeit der Apparatur und die Umgebungsbedingungen für eine hohe Stabilität optimiert wurden. Die Menge an_O2, die von Wildtyp-Fliegen in diesem Apparat verbraucht wird, stimmt mit der in früheren Studien gemessenen Menge überein. Der massenspezifische_O2-Verbrauch von CASK-Mutanten, die kleiner sind und von denen bekannt ist, dass sie weniger aktiv sind, unterschied sich nicht von kongenen Kontrollen. Die geringe Größe der CASK-Mutanten führte jedoch zu einer signifikanten Reduzierung des_{O2-Verbrauchs} pro Fliege. Daher ist das Mikrorespirometer in der Lage, den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, kann bescheidene Unterschiede zwischen Genotypen unterscheiden und ist ein vielseitiges Werkzeug zur Messung der Stoffwechselraten.

Einleitung

Die Fähigkeit, die Stoffwechselrate zu messen, ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis eines Organismus in seinem Umweltkontext. Zum Beispiel ist es notwendig, die Stoffwechselrate zu messen, um ihre Rolle in der Lebensspanne¹, die Rolle der Ernährung im Stoffwechsel² oder die Schwelle für hypoxischen Stress³ zu verstehen.

Es gibt zwei allgemeine Ansätze zur Messung der Stoffwechselrate⁴. Die direkte Kalorimetrie misst den Energieverbrauch direkt durch die Messung der Wärmeproduktion. Die indirekte Kalorimetrie misst die Energieerzeugu....

Protokoll

1. Fliegenaufzucht und -sammlung

1. Halten Sie Fliegen bei 25 °C in schmalen Fläschchen mit Standardfutter für Drosophila .
   HINWEIS: Die Probengröße für jeden Genotyp sollte mindestens neun Wiederholungen umfassen, die jeweils aus einer einzigen Respirometerkammer mit 15-25 Fliegen bestehen, die wie unten beschrieben eingerichtet sind.
2. Transferieren Sie die Fliegen alle 2-3 Tage.
3. Betäuben Sie Fliegen mit CO₂, sammeln Sie Gruppen von 15-25 Männchen jedes Genotyps und legen Sie jede Gruppe in frische, nicht hefehaltige Futterfläschchen.
   HINWEIS: Männchen wurden verwendet, um die Variabilität aufgrund ....

Ergebnisse

Die Druck- und Stromausgänge des Respirometer-Controllers sind für eine Kammer in einem Experiment in Abbildung 3A dargestellt. Der erste, lange Stromimpuls beaufschlagte die Kammer vom Umgebungsdruck (ca. 992 hPa) bis zur voreingestellten Ausschaltschwelle von 1017 hPa. Als die Fliegen O 2 verbrauchten und CO₂ absorbiert wurde, sank der Druck langsam, bis er die EIN-Schwelle von 1016 hPa erreichte, wodurch Strom durch den_O2-Generator aktiviert wurde. Im geze.......

Diskussion

Das obige Verfahren zeigt die Messung des_{O2-Verbrauchs} in D. Melanogaster mit einem elektronischen coulometrischen Mikrorespirometer. Die resultierenden Daten für den_O2-Verbrauch bei Wildtyp-D. melanogaster lagen innerhalb der Bereiche, die in den meisten früheren Veröffentlichungen mit verschiedenen Methoden beschrieben wurden (Tabelle 1), wenn auch etwas niedriger als die^{von anderen berichteten 3,6}.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
19/22 Thermometeradapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensorstecker
2 ml Schraubverschlussröhrchen	Fisher	3464	O2 Generator
2-poliger Stecker	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 Generator: geschnitten auf 2-polige
4-polige Buchse	TE Connectivity	215299-4	Sensorstecker
5 ml Polypropylen-Rohr	Falcon	352063	Auf 5,5 cm geschnitten und perforiert
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Kammer
6-adriges Kabel	Zenith	6-adrig 26 ga	Kabel
6-polige Schottbuchse	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-polige Buchse	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensorstecker
6-poliger Stecker	Switchcraft	16982-6PG-522	Kabel
800 ul Zentrifugenröhrchen	Fisher	05-408-120	Natronkalkpatrone
ABS Kunststoffgehäuse	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Jeder	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Stecker
Platine	Lheng	5 x 7 cm	Controller
Kupfersulfat	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Datenerfassung
Watterollen	Kajukajudo	#2	In zwei Hälften schneiden, um Fliegenschläuche zu stopfen In Viertel geschnitten für Feuchtigkeit
Klimakammer	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electroden in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Klemmen	uxcell	a20092300ux0418	Sichert die Glasverbindung der Kammer zum Verstopfen von
niedrigviskosem Epoxid	Loctite	E-30CL	Sensorstecker
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silikonfett	Dow-Corning	Hochvakuum Fett	Dichtungen Kammer-Stecker-Verbindung
Soda	Lime Jorvet	JO553	CO2 Absorption
Kippschalter	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB-Kabel	Säbel	CB-UM63	Controller
USB-Hub	Atolla	Hub 3.0	Controller mit Computer verbinden
Wasserbad	Amersham	56-1165-33	Temperaturregelung
Wasserbad Tank	Glaskäfige	15 Liter randloses	Acrylbad für Respirometer