Summary
Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülenO2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başınaO2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.
Abstract
Kulometrik mikrorespirometri, istikrarlı bir ortamı korurken küçük organizmalarınO2 tüketimini ölçmek için basit ve ucuz bir yöntemdir. Bir kulometrik mikrorespirometre,O2'nin tüketildiği ve organizma tarafından üretilen CO2'nin emici bir ortam tarafından uzaklaştırıldığı hava geçirmez bir odadan oluşur. Ortaya çıkan basınç düşüşü elektrolitik O2 üretimini tetikler ve üretilenO2 miktarı, onu üretmek için kullanılan yük miktarı kaydedilerek ölçülür. Bu çalışmada yöntem, aparatın hassasiyeti ve yüksek stabilite için optimize edilmiş çevresel koşullar ile küçük gruplar halinde test edilen Drosophila melanogaster'e uyarlanmıştır. Bu aparattaki yabani tip sinekler tarafından tüketilen O2 miktarı, önceki çalışmalarla ölçülenle tutarlıdır. Daha küçük ve daha az aktif olduğu bilinen CASK mutantları tarafından kütleye özgüO2 tüketimi, konjenik kontrollerden farklı değildi. Bununla birlikte, CASK mutantlarının küçük boyutu, uçuş başınaO2 tüketiminde önemli bir azalmaya neden oldu. Bu nedenle, mikrorespirometre D. melanogaster'de O2 tüketimini ölçebilir, genotipler arasındaki mütevazı farklılıkları ayırt edebilir ve metabolik hızları ölçmek için çok yönlü bir araç ekler.
Introduction
Metabolik hızı ölçme yeteneği, bir organizmanın çevresel bağlamında tam olarak anlaşılması için çok önemlidir. Örneğin, yaşam süresi1'deki rolünü, diyetin metabolizmadakirolünü 2 veya hipoksik stres eşiğini3 anlamak için metabolik hızı ölçmek gerekir.
Metabolizma hızını ölçmek için iki genel yaklaşım vardır4. Doğrudan kalorimetri, ısı üretimini ölçerek doğrudan enerji harcamasını ölçer. Dolaylı kalorimetri, enerji üretimini başka yollarla, genellikle O 2 tüketiminin (VO2), CO2 üretiminin veya her ikisinin respirometrik ölçümü yoluyla ölçer. Drosophila melanogaster5 dahil olmak üzere küçük ektotermlere doğrudan kalorimetri uygulanmış olsa da, respirometri teknik olarak daha basittir ve daha yaygın olarak kullanılır.
Yabani tip ve mutant D. melanogaster'de metabolik hızı ölçmek için çeşitli respirometri formları başarıyla kullanılmış ve sıcaklık6, sosyal çevre 3, diyet 3,7 ve nörogelişimsel bozuklukların8 metabolik etkileri hakkında fikir vermiştir. Bunlar, maliyet ve karmaşıklık açısından önemli ölçüde farklılık gösteren iki sınıfa ayrılır. Manometri, sineklerin bir CO2 emici içeren ve ince bir kılcal damar yoluyla bir sıvı rezervuarına bağlanan kapalı bir odaya yerleştirildiği en basit ve en ucuz 9,10'dur. O 2 tüketildikçe ve CO2 emildikçe, odadaki basınç azalır ve sıvı kılcal damara çekilir. Kılcal damarın sıvı dolu hacmi bu nedenle VO2 ile orantılıdır. Kılcal damardaki sıvının uyguladığı kuvveti telafi eden daha ayrıntılı versiyonlar da D. melanogaster 1'de kullanılmıştır. Manometri, basit ve ucuz olma avantajlarına sahiptir, ancak basınca duyarlı olduğu için sabit çevre koşulları gerektirir. Ayrıca, tüketilen O2 yerine konmadığı için, O2'nin (PO2) kısmi basıncı odaların içinde kademeli olarak azalır.
Gaz analizi kullanan respirometri de D. melanogaster için düzenli olarak kullanılmaktadır. Bu durumda, gazlar sinek içeren kapalı odalardan düzenli aralıklarla örneklenir ve bir kızılötesi analizöregönderilir 2,6,11. Bu tip aparatlar, ticari olarak temin edilebilmesi, çevresel koşullara daha az duyarlı olması ve numune alma sırasında gazların yenilenmesi ve böylece PO2'nin stabil kalması gibi avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, ekipmanın çalıştırılması pahalı ve karmaşık olabilir.
Yakın zamanda geliştirilen bir kulometrik mikrorespirometre12, mevcut sistemlere ucuz, hassas ve istikrarlı bir alternatif sunar. Uygulamada, bir organizmaO2 tükettiği hava geçirmez bir odaya yerleştirilir ve solunan CO2 emici bir malzeme tarafından uzaklaştırılır, bu da oda basıncında net bir azalmaya neden olur. İç basınç önceden ayarlanmış bir eşiğe (AÇIK eşik) düştüğünde, akım bir elektrolitikO2 jeneratöründen geçirilir ve basıncı elektrolizi durduran ikinci bir eşiğe (OFF-eşik) döndürür. O2 jeneratörü boyunca yük transferi, odayı yeniden basınçlandırmak için gereken O2 miktarı ile doğru orantılıdır ve bu nedenle organizma4 tarafından tüketilenO2'yi ölçmek için kullanılabilir. Yöntem oldukça hassastır, V O2'yi hassas bir şekilde ölçer ve O2'nin düzenli olarak değiştirilmesi, PO2'yi saatler veya günler boyunca neredeyse sabit bir seviyede tutabilir.
Bu çalışmada kullanılan kulometrik mikrorespirometre, çok modlu (basınç, sıcaklık ve nem) bir elektronik sensör kullanır. Sensör, basınçtaki küçük değişiklikleri algılayan ve düşük basınç eşiğine12 ulaşıldığındaO2 üretimini etkinleştiren bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılır. Bu aparat raf parçalarından monte edilir, çok çeşitli odalar ve deney ortamları ile kullanılabilir ve vücut kütlesi ve sıcaklığının Tenebrio molitor böceği üzerindeki etkilerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışmada, mikrorespirometre, T. molitor kütlesinin yaklaşık% 1'ine sahip olan D. melanogaster'de O2 tüketimini ölçmek için uyarlanmıştır. O2 üretimini aktive etme eşiği düşürülerek aparatın hassasiyeti arttırılmıştır ve sıcaklık kontrollü bir su banyosunda deneyler yapılarak ve odaların içindeki nem% 100 veya buna yakın tutularak çevresel stabilite arttırılmıştır.
Membranla ilişkili guanilat kinazlar (MAGUK) ailesinin bir parçası olan CASK (Calmodulin'e bağımlı Serin Protein Kinaz) proteini, farklı çoklu protein komplekslerinde moleküler bir iskeledir ve CASK'deki mutasyonlar, insanlarda ve D. melanogaster'de nörogelişimsel bozukluklarla ilişkilidir 13,14. Canlı bir D. melanogaster mutantı, CASKΔ18, dopaminerjik nöronların 15 aktivitesini bozar ve konjenik kontrollere kıyasla aktivite seviyelerini %50'den fazla azaltır14,16. CASK mutantlarının azalmış aktivite seviyeleri ve katekolaminlerin metabolizmayı düzenlemedeki rolü17 nedeniyle, standart metabolik hızlarının ve dolayısıylaO2 tüketiminin kontrollere kıyasla önemli ölçüde azalacağını varsaydık.
O2 tüketimi CASKΔ18 ve bunların vahşi tip türdeşleri w(ex33) cinsinden ölçülmüştür. Sinek grupları respirometri odalarına yerleştirildi, O 2 tüketimi ölçüldü, O2 tüketimi hesaplandı ve hem kütleye özgü hem de sinek başına ifade edildi. Cihaz, önceki çalışmalarla tutarlı olan vahşi tip sineklerde V O2 kaydetti ve vahşi tip ve CASK mutant sineklerinin sinek başınaO2 tüketimini ayırt edebildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sinek yetiştirme ve toplama
- Sinekleri 25 °C'de standart Drosophila gıdası içeren dar şişelerde muhafaza edin.
NOT: Her genotip için numune büyüklüğü, her biri aşağıda açıklandığı gibi kurulmuş 15-25 sinek içeren tek bir respirometre odasından oluşan en az dokuz kopyadan oluşmalıdır. - Sinekleri 2-3 günde bir aktarın.
- CO2 ile sinekleri uyuşturun, her genotipten 15-25 erkekten oluşan grupları toplayın ve her grubu taze, mayasız gıda şişelerine yerleştirin.
NOT: Üreme durumuna bağlı değişkenliği azaltmak için erkekler kullanılmıştır. Yöntem her iki cinsiyet için de geçerlidir. - Sineklerin 25 °C'de en az 24 saat iyileşmesine izin verin.
NOT: Deney sırasında sinekler 1-4 günlük olmalıdır. Adım 1.3'te açıklanan toplama sıklığı, sineklerin yaş aralığını daraltmak için ayarlanabilir.
2. Respirometre odasının kurulumu ve montajı
- Su banyosunu açın ve deney için istenen sıcaklığa ayarlayın.
NOT: Aşağıdaki deneyler 25 °C'de 50 mL Schlenk tüpleri kullanılarak oda olarak gerçekleştirilmiştir. Bileşenler, Şekil 1A, 1B ve 1C'de gösterildiği gibi monte edilmelidir. - Bir laboratuvar bezine (doğrudan eklemin üzerine değil) %70 etanol püskürterek ve sensör tapasındaki tozu ve eski gresi silerek odaların ve sensör tapalarının buzlu cam bağlantılarını iyice temizleyin (Şekil 1A). Etanolü yeni bir laboratuvar mendiliyle silin.
- Nemi stabilize etmek için haznenin dibine arıtılmış suya batırılmış 1 cm'lik pamuk rulosu yerleştirin.
- Pamuk rulosunun dibinde küçük bir havuz oluşturacak kadar su (~0,5 mL) ekleyin.
- Haznenin eklemine dökülen suyu silin.
- Sinekleri bir huni kullanarak etiketli polipropilen tüplere aktarın.
- Tüpü pamuklu bir rulo ile takın.
NOT: Tüpler, 5,5 cm uzunluğa kadar kesilmiş ve deney odası ile serbest hava değişimine izin vermek için sıcak bir bıçakla delinmiş 5 mL'lik bir polipropilen test tüpünden oluşur. CO2 anestezisinin metabolik anormalliklere neden olduğu bilinmektedir, bu nedenle sinekler anestezi olmadan transfer edilir ve bu da sinekleri kaybetmemek için daha fazla özen gerektirir.
- Tüpü pamuklu bir rulo ile takın.
- Her respirometre odasına (ıslak pamuğun üstüne) sinekli bir havalandırmalı tüp ekleyin.
- Soda kireç kartuşlarını (tüp başına 4-5 topak) doldurun ve haznenin içindeki sinekleri içeren tüpün üstüne yerleştirin.
NOT: Soda kireç kartuşları, elektrikli matkapla 4-5 kez delinmiş 800 μL santrifüj tüplerinden oluşur. - O2 jeneratörlerini havalandırma delikleri seviyesinin altında doymuş bakır sülfat (CuS04) çözeltisi ile doldurun
NOT: O2 jeneratörleri, dişlerin altına 4 delik açılmış vidalı kapaklı santrifüj tüplerinden oluşur. Platin (Pt) ve Bakır (Cu) elektrotlar iki pimli konektöre lehimlenir, kapakta açılan deliklere yerleştirilir ve epoksi ile yapıştırılır. CuS04'ün elektrolizi, deney organizması tarafından tüketilenO2'yi üretir. CuS04 omurgasızlar için toksiktir, dökülmeleri veya sızıntıları önleyin ve hemen temizleyin. - Doldurulmuş O2 jeneratörünü sensör fişindeki iki pimli konektöre bağlayın.
NOT: Bakır katot, kontrolörün negatif çıkışı ve platin anot ile pozitif kabloya bağlanmalıdır. Ters bağlantılar, denemenin başarısız olmasına neden olur. - Sensör tapasının buzlu cam bağlantısının karşı taraflarına iki küçük damla şeffaf silikon gres yerleştirin.
- Tapayı hazneye yerleştirin ve mafsaldaki gresi yaymak için tapayı (veya hazneyi) orta basınçla döndürün.
- Fazla gresi bir laboratuvar bezi ile silin.
- Haznelerdeki tapaları sabitlemek için plastik Keck kelepçelerini eklemlere takın. Monte edilen oda Şekil 1C'deki gibi görünmelidir.
- Günün deneyi için kullanılan oda sayısı için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
NOT: Kaydedilebilecek oda sayısı, bilgisayardaki kullanılabilir odacıkların, denetleyicilerin ve USB girişlerinin sayısıyla sınırlıdır. Mevcut deneyler için, yedi oda normalde paralel olarak çalıştırıldı. Mutantlar gibi deneysel sinekler uygun kontrollerle eşleştirilmelidir. Aynı şekilde kurulmuş ancak sinekler olmadan kurulmuş bir oda, çevresel varyasyon için bir kontrol olarak her deneye dahil edilmelidir. Farklı tedaviler (mutant, vahşi tip, sinek) içeren odalar deneyler arasında döndürülmelidir. - Monte edilmiş odaları, musluklar açıkken su banyosundaki bir rafa yerleştirin (Şekil 1E).
NOT: Sirkadiyen varyasyonu önlemek için, burada açıklanan tüm deneyler için banyoya 9:30 ile 9:50 saatleri arasında odalar yerleştirildi. - Muslukları açık bırakın (Kolu musluklara paralel tutun).
NOT: Musluklara su girmemesine dikkat edin. - Musluklar açıkken odaların yaklaşık 30 dakika dengelenmesine izin verin.
NOT: Hazne dengelenirken, elektronik aksamı bağlayın ve aşağıda açıklandığı gibi veri toplamayı ayarlayın.
3. Denetleyicileri ve bilgisayarı kurma
- O2 jeneratörlerine akım sağlayan anahtarların KAPALI konumda olduğundan emin olun (konektörden uzakta; Şekil 1D).
- Her denetleyici kutusunu kullanılabilir bir Evrensel seri veri yolu (USB) bağlantı noktasına takın.
NOT: Başka bir yerde açıklanan kontrol ünitelerinin yapımı ve programlanması12. - 6 iletkenli kablolar kullanarak kontrolörleri respirometre odalarına bağlayın.
- Denetleyicilerin organik ışık yayan diyot (OLED) ekranlarının (Şekil 1D) çevresel parametreleri gösterip göstermediğini kontrol edin.
- Kontrolör üzerindeki anahtarı kullanarak O2 jeneratörlerini kısaca açın (Şekil 1D).
- Akım değeri sıfırdan 35 ila 55 mA arasına yükselirse, kontrolör ve oda deneylere hazırdır.
- Aşağıda açıklandığı gibi, denetleyiciler tarafından hangi COM bağlantı noktalarının kullanıldığını belirleyin.,
- Microsoft Windows'ta Başlat simgesine tıklayın.
- Ayarlar simgesine tıklayın.
- Bluetooth ve Cihazlar'ı tıklayın.
- Denetleyicilerin ve COM bağlantı noktalarının aygıt listesinde göründüğünden emin olun.
- Masaüstünde PuTTY'yi açın ve aşağıda açıklandığı gibi respirometrenin her kanalı için bir günlük dosyası oluşturun.
NOT: PuTTY, COM bağlantı noktaları aracılığıyla bilgisayara veri aktarmak için kullanılan ücretsiz bir güvenli kabuk ve telnet istemcisidir.- "Seri hat" kutusuna bağlantı noktasının numarasını yazarak bir denetleyici için COM bağlantı noktasını seçin (Şekil 2A).
- Günlüğe kaydetme'ye tıklayın.
- "Oturum günlüğü"nde Yazdırılabilir Çıktı'yı seçin (Şekil 2B).
- Günlük Dosyası Adı altında, Gözat'ı tıklatın.
- Tercih edilen klasörde, açıklayıcı bilgiler içeren bir dosya adı oluşturun (örneğin, tarih, tür, COM bağlantı noktası numarası).
- Kaydet'i tıklayın.
- Aç'a tıklayın. Günlüğe kaydedilen virgülle ayrılmış verileri gösteren bir pencere açılacaktır (Şekil 2C).
- Deneme için kullanılan diğer tüm denetleyiciler için tekrarlayın. Her COM bağlantı noktasına giriş ayrı bir pencere olarak görünecektir (Şekil 2D).
4. Deneyleri çalıştırma
- Hazneler 30 dakika dengelendikten sonra, muslukları kapatarak kapatın.
- Sabit bir ortam sağlamak için banyoyu ve odaları polistiren köpük kutu ile örtün.
- Bir saat daha dengelenmesine izin verin.
- Kontrol kutusundaki anahtarı kullanarak her odanın O2 jeneratörüne giden akımı açın.
- O2 jeneratörleri etkinleştirildiğinde, basıncın önceden ayarlanmış KAPALI basınca yükseldiğinden emin olun.
NOT: Bu deney serisinde "KAPALI" basınç olarak atmosfer basıncının biraz üzerinde olan 1017 hPa kullanılmıştır. Ortam basıncına dönüş, odalardan gaz sızıntısını gösterecektir. Ayrıca, ortam barometrik basıncından bağımsız olarak deneylerde aynı basıncın kullanılmasına izin verir. "AÇIK" basınç 1016 hPa idi, yani O2 jeneratörü etkinleştirilmeden önce basıncın yalnızca 1 hPa düşmesi gerekiyordu. Bu, Drosophila'daO2 tüketimini ölçmek için yeterli hassasiyet sağladı. Bir oda "KAPALI" ayarına basınçlandırıldığında, akım sıfıra düşmelidir. - Denemenin 3 saat veya daha uzun süre çalışmasına izin verin.
NOT: Yüksek sıcaklıklarda daha yüksek VO2 , daha kısa deney sürelerine izin verebilir. Ekipmanın çalıştığından emin olmak için ara sıra izleyin, ancak odaların yakınında sıcaklık kararlılığını etkileyebilecek aşırı aktiviteden kaçının.
5. Bitirme deneyi
- Tüm kontrolörlerde O2 jeneratörlerini kapatın.
NOT: Önce odalar açıkken O2 jeneratörlerini çalıştırmaktan kaçının. - Odaların mührünü açmak için muslukları açın.
- Son bir taban çizgisi sağlamak için PuTTY pencerelerini 5-15 dakika daha açık bırakın.
- Her denetleyici için PuTTY penceresini kapatın ve kayıtları sonlandırın.
NOT: Tüm deneyler 16:50 ile 17:10 arasında sona erdi. - Sensörleri kablolardan ayırın.
- Odaları kuru rafa taşıyın.
- Sensör fişlerini bölmelerden birer birer çıkarın.
- O2 jeneratörlerini ayırın ve tüp rafına yerleştirin.
- Sensör tapasındaki gresi silin ve rafta saklayın.
- Hazne bağlantılarındaki gresi temizleyin ve sinek ve soda kireçli tüpleri çıkarın.
- Anestezi, CO 2 ile her tüpte sinekler, bir ağırlık teknesine dokunun ve bir mikro terazide tartın.
- Her tüp için sineklerin ağırlığını ve sayısını kaydedin.
- Sinekleri atın veya ek prosedürler için bir kenara koyun.
- Kartuşlardaki soda kirecini atık kabına boşaltın.
- O2 jeneratörünü açın ve CuS04 çözeltisini atık kabına atın.
- Elektrotları ve tüpü arıtılmış suyla durulayın.
- Kurutma için tüp raflarını yerleştirin.
6. Yük transfer verilerinin analizi
- Verileri, her kayıt ayrı bir çalışma sayfası içerecek şekilde bir elektronik tabloya virgülle ayrılmış metin olarak içe aktarın.
- O2 jeneratörünün her darbesi için akım ve zaman verilerini kaydedin. Hazne basınçlandırıldıktan sonraki ilk darbeden başlayarak, her akım darbesinin başlangıç ve bitiş zamanını (sıra numaraları olarak) kaydedin. Bu, akım sıfırın üzerine çıktığında (genellikle yaklaşık 45-50 mA'ya) sıfırın üzerindeki son satıra kadar olan satır numarasıdır.
- Aşağıdaki verileri kaydetmek için çalışma sayfasında bir tablo oluşturun:
- Darbe sırasındaki ortalama akım genliği: = ORTALAMA([ilk darbe satırı]:[son darbe satırı]) her darbe için (mevcut sütundan).
- Darbe süresi: ([Son darbe satırı] - [ilk darbe satırı[-bir satır]])/her darbe için 1000 (milisaniye cinsinden süre sütunundan).
- Toplam deney süresi: [son darbenin başlangıcındaki süre] - [hazne basınçlandırıldıktan sonra ilk darbenin sonundaki süre] (dakika cinsinden süre sütunundan).
- Ardından her darbe için yük transferini (Q) hesaplayın (ortalama akım X süresi)
- Toplam Yükü (Qtot) hesaplamak için tüm darbelerden gelen yükü toplayın.
7.O2 tüketiminin analizi
- Tüm veriler için yeni bir elektronik tablo oluşturun ve her oda için aşağıdakileri girin veya hesaplayın:
- Qtot (toplam ücret)
- Benler (= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= mol × 22413 mL / mol)
- Toplam süre (yukarıdaki veri analizinden)
- mL min-1 (= mlO2 ÷ toplam süre)
- Gram cinsinden ağırlık (deneyden sonra ölçülen sinekler uyuşturulur ve tartılır)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 gram cinsinden ÷ ağırlığı)
- mL/h/g (yukarıdaki × 60)
- mg/sinek (= sineklerin ağırlığı ÷ sinek sayısı)
- μL sinek-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ sinek sayısı).
- Her tedavi için verileri tablo haline getirin (örn. genotip)
- ANOVA, t-testi veya Mann-Whitney u-testi 13 kullanarak tedavileri karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Respirometre kontrolörünün basınç ve akım çıkışları, Şekil 3A'da bir deneyde bir oda için gösterilmiştir. İlk, uzun akım darbesi, odayı ortam basıncından (yaklaşık 992 hPa) önceden ayarlanmış 1017 hPa'lık KAPALI eşiğine kadar basınçlandırdı. Sinekler O 2 ve CO 2 tükettikçe, basınç 1016 hPa'lık AÇIK eşiğine ulaşana kadar yavaşça azaldı ve bu da O2 jeneratörü aracılığıyla akımı etkinleştirdi. Gösterilen örnekte, her bir darbenin ortalama genliği 50.1 mA, süre 16.1 s'dir ve darbe başına yaklaşık 0.81 coulomb (C) yük transferi sağlar. Bu oda için toplam yük transferi, toplam 240.0 dakikalık bir süre boyunca 3.28 C idi. Sineklerin kütlesi ve sayısı (toplam 14.9 mg ağırlığında 23 sinek) ile Prosedürlerde açıklanan hesaplamaları kullanarak, bu odadaki grup içinO2 tüketimi 3.19 mL h-1 g-1 veya 2.07 μL h-1 sinek-1 idi.
Ekipman, minimum eğitimle kolayca kurulabilir ve birçok montaj ve kapatma döngüsü için güvenilir bir şekilde çalışır. Bununla birlikte, ekipmanın bakımı düzenli olarak yapılmalı ve denetlenmeli ve deney koşulları dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Örneğin, bir bağlantı veya vana arızası nedeniyle gaz geçirmez bir contanın kaybı, hızlı basınçlandırma döngülerine ve sahte olarak yüksek VO2'ye yol açabilir (Şekil 3B). Ek olarak, oda içinde sıcaklık ve nem sabit kalmalıdır. Sıcaklık veya nem düşerse, ortaya çıkan basınç düşüşü hatalı bir şekilde tüketilen bir O2 olarak yorumlanacaktır. Tersine, sıcaklık veya nemdeki yukarı doğru kayma, O2 tüketiminin neden olduğu basınç düşüşünü önleyecek ve VO2 sinyalini yapay olarak azaltacak veya ortadan kaldıracaktır (Şekil 3C).
Yöntem, CASK lokusu14'ten transpoze edilebilir bir elemanın kesin olmayan eksizyonu ile üretilen ve hareketin büyük ölçüde azaldığı CASKΔ18 mutantlarının VO2'sini test etmek için kullanıldı14,16. Transpoze elemanın hassas eksizyonu ile oluşturulan vahşi tip w (ex33) kontrollerinde, ortalama kütleye özgüO2 tüketimi 3.65 ± 0.24 mL·g-1·h-1 (n = 16 oda; Şekil 4A).
Gözle görülür şekilde azalmış hareketlerine rağmen, CASKΔ18 mutantlarının VO2'si kontrollerinkinden biraz daha düşüktü, ancak önemli ölçüde daha düşüktü (ortalama ± s.e.m.= 3.23 ± 0.13 mL·g-1·h-1; n = 11 grup; P = 0.08 Mann-Whitney u-testi).
Metabolik hızın vücut kütlesi cinsinden ifade edilmesinin geçerliliği sorgulandığından18,O2 tüketimi de sinek bazında analiz edilmiştir (Şekil 4B). Bu analiz kullanılarak, CASKΔ18'de vahşi tip kontrollere kıyasla VO2 önemli ölçüde azalmıştır (örn33: 2.22 ± 0.13 μL·sinek-1·h-1; FIÇIΔ18: 1.58 ± 0.10 μL·sinek-1·h-1; P = 0.0003, Mann-Whitney u-testi). Bununla birlikte, CASKΔ18 sineklerinin ortalama kütlesi, ex33 kontrollerinden %>20 daha düşüktü (Şekil 4C; ex33 0.61 ± 0.01 mg; FIÇIΔ18 0.51± 0.02 mg; P = 0.0005, Mann-Whitney u-testi), bu nedenle genotipler arasındaki metabolik hız farkı muhtemelen boyutlarındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır.
Şekil 1: Respirometre kurulumu. (A) Montajdan önce sensör fişi (yukarıda) ve 50 mL hazne (aşağıda 50 mL Schlenk tüpünden oluşur) şeması. Hazneyi ve sensör fişini bağlayacak ve her deneyden önce temizlenmesi gereken 19/22 buzlu cam bağlantılarının yerlerini not edin. Hazneyi açmak veya sızdırmaz hale getirmek için gerekli olan vana da belirtilmiştir. (B) Deney için monte edilmiş ve hazır olan hazne ve bileşenlerin şeması: ıslak pamuk rulosu, sinek içeren polipropilen tüp, pamuk tıpa ile tıkalı, soda-kireç kartuşu ve CuS2 ile doldurulmuş O4 jeneratörü. (C) Monte edilmiş odanın fotoğrafı. Fişi hazneye sabitleyen Keck kelepçesi, hazneyi tutan halka sehpa kelepçesi tarafından kısmen gizlenir. (D) O2 jeneratörü aracılığıyla akımı kontrol eden anahtarı gösteren kontrolörün fotoğrafı ve OLED ekranı görüntülemek için pencere. (E) Bir su banyosunda monte edilmiş odalar. Üçü mutant içeren, üçü vahşi tip kontrollere sahip ve sinekler hariç tüm bileşenleri içeren bir oda olmak üzere yedi oda gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Veri toplama kurulumu. (A) Veri toplama için seri bağlantı noktasını seçmek için PuTTY arabirimi. Kontrolörün çıkışına uyması için 9600 BAUD hızıyla COM3 seçilmiştir. (B) Günlük dosyasını ayarlamak için PuTTY arayüzü. Verilerin bir metin dosyasına kaydedilmesini sağlamak için "Yazdırılabilir çıktı" seçilir, "Gözat" düğmesi kullanılarak veri klasörü seçilir ve bir dosya adı oluşturulur. (C) Deneme sırasında PuTTY günlük dosyası. Veriler saniyede yaklaşık iki kez alınır ve her satır aşağıdaki virgülle ayrılmış bilgileri içerir: Sensör Numarası, alımın başlangıcından bu yana geçen süre (ms), oda sıcaklığı (°C), oda basıncı (hPa), Nem (yüzde bağıl) ve akım (mA). (D) Deney odaları için yedi pencere ve ayrıca banyo sıcaklığını, ortam hava sıcaklığını, basıncı ve nemi kaydeden bir kanal ile tipik bir deney sırasında veri kaydı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikrorespirometreden alınan veriler. (A) 23 w (ex33) sinek içeren tek bir respirometre odasında O2 jeneratörü (siyah çizgi, sağ eksen) boyunca basınç (gri çizgi, sol eksen) ve akım. Başlangıçta, odayı ~992 hPa'dan 1017 hPa'lık KAPALI eşiğine basınçlandırmak için uzun bir akım darbesi gerekir. Sinekler O 2 tükettikçe, basınç 1016 hPa'lık AÇIK eşiğine ulaşana kadar düştü, bu da odayı 1017 hPa'ya yeniden basınçlandıran O2 jeneratörü aracılığıyla akımı etkinleştirdi. Bu deneyde işlem altı kez tekrarlandı. (B) Farklı bir deney serisinden alınmış, hasarlı bir vananın neden olduğu sızdıran bir oda örneği. Hazne basıncı koruyamadı (gri çizgi), bu da elektrolitik akımın sürekli döngüsüne (siyah çizgi) neden oldu. Panel A'dan farklı bir zaman ölçeğine dikkat edin. (C) Nemdeki kaymanın etkisi. Odadaki 20 mg uğur böceği (Hippodamia convergens) tarafından O2 tüketimi, Şekil 3A'ya benzer bir döngü basıncı modeli üretmiş olmalıydı, ancak nemdeki sürekli artış (siyah çizgi), oda basıncında (gri çizgi) VO2'yi maskeleyen yapay bir artışa neden oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yabani tip ve CASK mutantı D. melanogaster'den elde edilen nicel veriler. (A) Yabani tip (w(ex33)) ve mutant (CASKΔ18) sinekler için kütleye özgü VO2. Tüm parsellerde, kutuların alt ve üst kısımları sırasıyla birinci ve üçüncü çeyrekleri, bıyıklar uç değerleri gösterir ve örneklem büyüklükleri (her biri 17-24 sinek içeren oda sayıları) genotiplerin üzerinde parantez içinde verilmiştir. CASK Δ18 sinekleri ex33'ten istatistiksel olarak anlamlı derecede farklı değildir (medyan: ex33: 3.420 mL·g-1·h-1, CASKΔ18 : 3.029 mL·g-1·h-1; p = 0.08 Mann-Whitney u-testi). (B) Sineğe özel VO2. CASKΔ18sinekleri, w(ex33)'den (2.078 mL·sinek-1·h-1; p = 0.0003, Mann-Whitney u-testi; yıldızlarla gösterilen anlamlılık) önemli ölçüde dahaaz O2 (medyan 1.650 mL·sinek-1·h-1) tüketir. (C) Kütle, CASKΔ18 ve vahşi tip arasında farklılık gösterdi (medyan: 0.526 mg, ex33: 0.623 mg; p = 0.0005, Mann-Whitney u-testi; yıldızlarla gösterilen anlamlılık). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1. 25 °C'de vahşi tip sineklerden Drosophila respirometri verilerinin araştırılması. Bir istisna18 dışında, çalışmalarO2 tüketimini ölçenlerle sınırlıdır. Çoğu durumda, VO2'yi grafiklerden tahmin etmek gerekliydi ve orijinal kağıtlardan şekil numaraları verildi. Tüm genotipler "yabani tip" olarak kabul edilse de, kaynaklar ve yayılma yöntemleri değişmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki prosedür, elektronik bir kulometrik mikrorespirometre kullanılarak D. Melanogaster'de O2 tüketiminin ölçümünü göstermektedir. Yabani tip D. melanogaster'de O2 tüketimi için elde edilen veriler, diğerleri tarafından bildirilenden biraz daha düşük olmasına rağmen, çeşitli yöntemler kullanılarak önceki yayınların çoğunda açıklanan aralıklar içindeydi (Tablo 1) 3,6.
Kritik adımlar, yöntemin iki mutlak gereksinimini ele aldı: gaz sızdırmaz conta ve çevresel kararlılık. Gaz geçirmez bir ortamın bakımı basittir ancak özen gerektirir. Schlenk şişeleri ve tüpleri, respirometri odaları olarak idealdir. Cam yapı, özellikle uzun süreli deneylerde kritik olan birçok plastik19 türünde bulunan gaz geçirgenliğini önler. Standart bağlantılar, sensörleri ve elektronik bağlantıları içeren fişlerle gaz geçirmez bağlantılara izin verir. Musluklar güvenilir contalar sağlar ve deneyler sırasında gerektiğinde açılıp kapatılabilir. Her deney için gaz sızdırmazlığı sağlamak için musluklar incelendi, derzler iyice temizlendi, makul miktarlarda temiz silikon gres uygulandı ve derzler Keck kelepçeleriyle sabitlendi.
Yöntemin hassasiyeti, oda içindeki sıcaklık ve nemin stabilitesi ile sınırlıdır. Her iki parametredeki değişiklikler, VO2 sinyaline müdahale eden basınç dalgalanmalarına neden olacaktır. Bir çevre odasının12 veya sirkülasyonlu su banyosunun kullanılması daha kararlı sıcaklık kontrolü sağlar. Başkaları tarafından yapılan önceki çalışmalar, yöntemin, sıcaklık ±0.01 °C20 içinde tutulduğunda nmol·h-1 seviyesindeO2 tüketimini ölçebildiğini göstermiştir. Nemi stabilize etmek için, suya batırılmış rulo pamuk parçaları nemi yaklaşık% 100'de tuttu. Sıcaklık ve nemin, odaların elektrolitik olarak üretilen O2 ile basınçlandırılmasından ve kayıtların başlamasından önce en az 90 dakika stabilize olmasına izin verildi. Tüm deneyler, çevresel koşulları izlemek için tüm bileşenlerle bir araya getirilmiş ancak sinek içermeyen bir oda içeriyordu.
Sıcaklığı, basıncı ve nemi düzenli olarak sürekli izlemek, sorun gidermeyi büyük ölçüde basitleştirir. Örneğin, hasarlı bir vananın neden olduğu yapay olarak yüksek görünür V O2 (Şekil 3B) veya kararsız oda nemi (Şekil 3C) nedeniyle görünür VO2 kaybı tespit edilebildi ve düzeltilebildi.
Burada açıklanan kulometrik mikrorespirometrenin çeşitli avantajları vardır. Birincisi, kanal başına yaklaşık 100 ABD doları toplam maliyetle (oda, sensör ve kontrolörden oluşan) nispeten ucuzdur. İkincisi, her kanal verileri bağımsız olarak alıp ilettiğinden, sistem ölçeklenebilir, oda sayısı yalnızca çevre denetleyicisinin boyutu (su banyosu veya çevre odası) ve bilgisayardaki kullanılabilir USB bağlantı noktalarının sayısı (genellikle >100'e kadar genişletilebilir) ile sınırlıdır. Ayrıca, odalar ve kontrolörler bağımsız olduğundan, herhangi birinin başarısızlığı diğerlerini etkilemeyecektir. Üçüncüsü, kontrolörler ortam basıncına uyum sağlamak veya hassasiyeti gerektiği gibi ayarlamak için kolayca yeniden programlanabilir. Bununla ilgili olarak, odaların içindeki basınç sabit bir değere ayarlanmıştır, bu nedenle deneysel basınç, ortam barometrik basıncından bağımsız olarak deneyler boyunca sabit olacaktır. Dördüncüsü, zaman, sıcaklık, basınç, nem ve akımla ilgili sabit veri akışı, her oda için bu parametrelerin ayrıntılı analizine izin vererek, daha uzun deneylerde VO2'deki zamansal değişikliklerin giderilmesini veya analizini kolaylaştırır. Son olarak, oda içindeki çevresel koşullar saatlerce veya günlerce sabit bir seviyede tutulabilir, çünkü tüketilen O2 sürekli olarak değiştirilir. Bu çalışmada, oda basıncı %0,1'den az olan 1016'dan 1017 hPa'ya dalgalanmıştır ve bunun sonucunda PO2'de ortaya çıkan değişiklik %0,5'ten azdır. 28 mL O2 üretebilen her bir O2 jeneratöründekiCuS04 miktarına ve bu çalışmadaki sinek gruplarının ortalama VO2'sine bağlı olarak, 1.15 mL / gün (ortalama = oda başına 21.8 sinek), metabolik hız bir seferde 24 güne kadar incelenebilir. Sineklere yeterli beslenmenin sağlandığını varsayarsak, bu, metabolizmanın bir sineğin ömrünün çoğu için sürekli olarak incelenebileceği anlamına gelir.
Şu anda, D. melanogaster'deki metabolizma çalışmalarının çoğu gaz analizine veya manometriye dayanmaktadır. Stop-flow ve sürekli akışlı respirometreler 2,3,6 gibi gaz analizine dayanan yöntemler, yöntemin iyi kurulmuş olması ve ekipmanın ticari olarak temin edilebilmesi avantajına sahiptir. Bununla birlikte, akışı düzenlemek için manifoldlar ve moleküler akış sensörleri ve gaz konsantrasyonlarını ölçmek için gaz analizörleri dahil olmak üzere pahalı ve karmaşık ekipman gerektirirler. Alternatif olarak, basit manometreler9 çok daha ucuzdur. En basit biçimde, D. melanogaster için yaygın olarak kullanılan, sinekler uyuşturulur ve CO2 emici malzeme içeren ve bir kılcal tüp ile bir sıvı rezervuarına bağlanan küçük bir odaya yerleştirilir. O2 tüketildiğinde ve ortaya çıkan CO2 emildiğinde, odadaki basınç düşer ve bu da sıvıyı kılcal boruya çeker. Sıvının yüksekliği daha sonra tüketilenO2 miktarı ile orantılıdır. Deney sırasında tüketilen O2 yerine konmadığından, PO2 deney boyunca sürekli olarak azalır. Rutin deneyler P O2'yi V O2'yi olumsuz yönde etkileyecek kadar azaltamasa da, uzun süreli deneyler veya yüksek sıcaklıklarda yapılan deneyler O2'yi tüketebilir ve VO2'nin keskin bir şekilde düştüğükritik P O2'ye ulaşabilir 3. Diğer bir konu ise kılcal damardaki sıvının ağırlığının aşağı doğru bir kuvvet uygulayarak, uygulanan aşağı doğru kuvvetle orantılı olarak sıvının yüksekliğini azaltması ve potansiyel hatalara neden olmasıdır. Bu etkiyi telafi etmek için yöntemler tanımlanmıştır 4,21, ancak hantaldır ve yaygın olarak kullanılmamaktadır. Gaz analizi ve manometrinin doğrudan karşılaştırılması, iki yöntemin önemli ölçüde farklı sonuçlar ürettiğini, ancak yazarların22 sapma için tatmin edici bir açıklama üretemediğini gösterdi.
Avantajlarına rağmen, kulometrik mikrorespirometrenin de sınırlamaları vardır. Birincisi, bazı stop-flow gaz analiz sistemlerinden farklı olarak, ticari olarak mevcut değildir. Bileşenlerin elde edilmesi kolaydır ve ne tasarım ne de programlama karmaşık değildir, ancak inşa edilmesi potansiyel olarak basit manometrik sistemlerden daha karmaşıktır9. İkincisi, doğru verilerin elde edilmesi,O2 üretiminin birden fazla döngüsünü içermelidir, bu nedenle her deney birkaç saat sürmelidir. Bu aynı zamanda manometri kullanan deneyler için de geçerlidir. Son olarak, yine manometri gibi, odaların içindeki sıcaklık ve nem sabit olmalıdır. Bununla birlikte, kulometrik mikrorespirometre maliyet ve karmaşıklık açısından bir orta yol sunar, monte edildikten sonra sağlam ve güvenilirdir veO2 tüketimini hassas bir şekilde ölçer.
CASKΔ18 mutantları ile yapılan deneyler hem negatif (kütleye özgü VO2) hem de pozitif (sineğe özgü VO2) sonuçlar göstermektedir. CASKΔ18mutantlarının yürümesindeki %>50'lik azalma, metabolizmanın bozulmasından kaynaklanıyorsa, VO2'nin benzer miktarda azalacağı tahmin edilebilir. Yine de kütleye özgüO2 tüketimindeki değişim mütevazıydı (medyan VO2'de% 9.6 azalma) ve istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bu negatif sonuç, nispeten normal metabolizmaya sahip CASKΔ18 mutantları ile tutarlıdır ve davranışsal fenotip azalmış lokomotor tahrikten kaynaklanır. Yöntemin yeterli duyarlılıktan yoksun olması mümkün olsa da, boyuttaki nispeten küçük bir farkın (medyan kütlede% 15.5 azalma) neden olduğu VO2'nin azalması oldukça önemliydi.
Yürüme, önemli ölçüde artan enerji harcaması 5,23 ile ilişkilidir, öyleyse neden VO2 CASK mutantlarında nispeten normaldir? CASK mutantlarında16 aşırı tımarlamanın yürümedeki azalmayı dengeleyebilmesi veya sinekler küçük tüplerde gruplar halinde test edildiğinde yürüme fenotipinin daha az belirgin olması mümkündür, ancak bu hipotezler deneysel doğrulamayı beklemektedir. Bununla birlikte, CASK lokusundaki mutasyonların metabolizma üzerinde güçlü, doğrudan etkileri olmadığı ve kulometrik mikrorespirometrenin D. melanogaster'de metabolizmayı incelemek için etkili bir araç olduğu sonucuna vardık.
Bu aparat ortak bileşenlerden kolayca yapıldığından,O2 tüketimini hassas bir şekilde ölçtüğünden, son derece portatiftir, sabit sıcaklığa sahip herhangi bir ortamda kullanılabilir ve 0.5 mg sinek kadar küçük organizmalarla kullanıldığından (bu çalışma) ve 500 mg akrep kadar büyük (DJS yayınlanmamış), çeşitli organizmaların metabolizmasını incelemek için çok yönlü bir araç ekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Arizona Üniversitesi'nden Dr. Linda Restifo'ya CASK mutantlarınınO2 tüketimini test etmeyi önerdiği ve CASK mutantlarını ve onların konjenik kontrollerini gönderdiği için teşekkür ederiz. Yayın ücretleri, College Park Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Bölüm Yeniden Yatırım Fonu tarafından sağlandı. Uzay ve bazı ekipmanlar Shady Grove'daki Üniversiteler tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
