Mesure de la consommation d’O₂ chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

Summary

La respirométrie coulométrique est idéale pour mesurer le taux métabolique des petits organismes. Lorsqu’elle a été adaptée pour Drosophila melanogaster dans la présente étude, la consommation d’O₂ mesurée se situait dans la fourchette rapportée pour le type sauvage D. melanogaster par des études antérieures. La consommation d’O₂ par mouche par les mutants CAS, qui sont plus petits et moins actifs, était significativement inférieure à celle du type sauvage.

Abstract

La microrespirométrie coulométrique est une méthode simple et peu coûteuse pour mesurer la consommation d’O₂ de petits organismes tout en maintenant un environnement stable. Un microrespiromètre coulométrique est constitué d’une chambre hermétique dans laquelle l’O 2 est consommé et le CO₂ produit par l’organisme est éliminé par un milieu absorbant. La diminution de pression qui en résulte déclenche la production électrolytique d’O2, et la quantité d’O2 produite est mesurée en enregistrant la quantité de charge utilisée pour la générer. Dans la présente étude, la méthode a été adaptée à Drosophila melanogaster testée en petits groupes, avec la sensibilité de l’appareil et les conditions environnementales optimisées pour une grande stabilité. La quantité_d’O2 consommée par les mouches sauvages dans cet appareil est cohérente avec celle mesurée par des études antérieures. La consommation d’O₂ spécifique à la masse par les mutants CASK qui sont plus petits et connus pour être moins actifs, n’était pas différente de celle des témoins congéniques. Cependant, la petite taille des mutants CASK a entraîné une réduction significative de la consommation d’O₂ par mouche. Par conséquent, le microrespiromètre est capable de mesurer la consommation d’O₂ chez D. melanogaster, de distinguer des différences modestes entre les génotypes et d’ajouter un outil polyvalent pour mesurer les taux métaboliques.

Introduction

La capacité de mesurer le taux métabolique est cruciale pour une compréhension complète d’un organisme dans son contexte environnemental. Par exemple, il est nécessaire de mesurer le taux métabolique afin de comprendre son rôle dans la durée de vie¹, le rôle de l’alimentation dans le métabolisme², ou encore le seuil du stress hypoxique³.

Il existe deux approches générales pour mesurer le taux métabolique⁴. La calorimétrie directe mesure directement la dépense énergétique en mesurant la production de chaleur. La calorimétrie indirecte mesure la production d’énergie par d’autres moyens, souvent par mesure respirométrique de la consommation d’O2 (V,_O2), de_CO2 ou des deux. Bien que la calorimétrie directe ait été appliquée à de petits ectothermes, y compris Drosophila melanogaster⁵, la respirométrie est techniquement plus simple et plus couramment utilisée.

Plusieurs formes de respirométrie ont été utilisées avec succès pour mesurer le taux métabolique chez D. melanogaster de type sauvage et mutant et ont fourni un aperçu des effets métaboliques de la température⁶, de l’environnement social 3, de l’alimentation ^{3,7 et des} troubles neurodéveloppementaux⁸. Ceux-ci se répartissent en deux classes, dont le coût et la complexité varient considérablement. La manométrie est la plus simple et la moins coûteuse^9,10, dans laquelle les mouches sont placées dans une chambre scellée qui contient un absorbant de CO₂ et qui est reliée par un mince capillaire à un réservoir de fluide. Au fur et à mesure que l’O 2 est consommé et que le CO₂ est absorbé, la pression dans la chambre diminue et le fluide est aspiré dans le capillaire. Le volume rempli de liquide du capillaire est donc proportionnel à V_O2. Des versions plus élaborées, qui compensent la force exercée par le fluide dans le capillaire, ont également été utilisées sur D. melanogaster¹. La manométrie a l’avantage d’être simple et peu coûteuse, mais, parce qu’elle est sensible à la pression, elle nécessite des conditions environnementales constantes. De plus, comme l’O 2 consommé n’est pas remplacé, la pression partielle d’O₂ (P_O2) diminue progressivement à l’intérieur des chambres.

La respirométrie utilisant l’analyse des gaz est également régulièrement utilisée pour D. melanogaster. Dans ce cas, les gaz sont échantillonnés à intervalles réguliers dans des chambres scellées contenant des mouches et envoyés à un analyseur infrarouge ^2,6,11. Ce type d’appareil présente l’avantage d’être disponible dans le commerce, d’être moins sensible aux conditions environnementales et de rafraîchir les gaz pendant l’échantillonnage afin que le P_O2 reste stable. Cependant, l’équipement peut être coûteux et complexe à utiliser.

Un microrespiromètre coulométrique récemment mis au point¹² offre une alternative peu coûteuse, sensible et stable aux systèmes existants. En pratique, un organisme est placé dans une chambre hermétique où il consomme de l’O 2 et le CO₂ expiré est éliminé par un matériau absorbant, ce qui entraîne une diminution nette de la pression de la chambre. Lorsque la pression interne diminue jusqu’à un seuil prédéfini (seuil ON), le courant passe à travers un générateur électrolytique d’O2, ramenant la pression à un deuxième seuil (seuil OFF) arrêtant l’électrolyse. Le transfert de charge à travers le générateur d’O2 est directement proportionnel à la quantité d’O2 nécessaire pour repressuriser la chambre et peut donc être utilisé pour mesurer l’O2 consommé par l’organisme⁴. La méthode est très sensible, mesure la V O2 avec précision, et le remplacement régulier de l’O₂ peut maintenir la P_O2 à un niveau presque constant pendant des heures ou des jours.

Le microrespiromètre coulométrique utilisé dans cette étude utilise un capteur électronique multimodal (pression, température et humidité). Le capteur est actionné par un microcontrôleur qui détecte les petits changements de pression et active la génération d’O₂ lorsqu’un seuil de basse pression est atteint¹². Cet appareil est assemblé à partir de pièces prêtes à l’emploi, peut être utilisé avec une grande variété de chambres et d’environnements expérimentaux, et a été utilisé avec succès pour examiner les effets de la masse corporelle et de la température sur le coléoptère Tenebrio molitor. Dans la présente étude, le microrespiromètre a été adapté pour mesurer la consommation d’O₂ chez D. melanogaster, qui représente environ 1 % de la masse de T. molitor. La sensibilité de l’appareil a été augmentée en abaissant le seuil d’activation de la génération d’O2, et la stabilité de l’environnement a été améliorée en effectuant des expériences dans un bain-marie à température contrôlée et en maintenant l’humidité à l’intérieur des chambres à 100 % ou presque.

La protéine CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), qui fait partie de la famille des guanylate kinases associées à la membrane (MAGUK), est un échafaudage moléculaire dans différents complexes multiprotéiques, et les mutations de CASK sont associées à des troubles neurodéveloppementaux chez l’homme et chez D. melanogaster^13,14. Un mutant viable de D. melanogaster, CASK^Δ18, perturbe l’activité des neurones dopaminergiques 15 et réduit les niveaux d’activité de plus de 50 % par rapport aux témoins congéniques^14,16. En raison des niveaux d’activité réduits des mutants CASK et du rôle des catécholamines dans la régulation du métabolisme^{, nous avons} émis l’hypothèse que leur taux métabolique standard, et donc leur consommation d’O₂, seraient considérablement réduits par rapport aux témoins.

La consommation_d’O2 a été mesurée dans le fût^Δ18 et leurs congénères de type sauvage, w(ex33). Des groupes de mouches ont été placés dans des chambres de respirométrie, la consommation d’O2 a été mesurée, la consommation d’O2 a été calculée et exprimée à la fois en fonction de la masse et par mouche. L’appareil a enregistré la V O2 chez les mouches de type sauvage, ce qui était cohérent avec les études précédentes, et il a pu faire la différence entre la consommation_d’O2 par mouche des mouches mutantes de type sauvage et CASK mutantes.

Protocol

1. Élevage et collecte de mouches

1. Maintenir les mouches à 25 °C dans des flacons étroits contenant de la nourriture standard pour drosophiles .
   NOTA : La taille de l’échantillon pour chaque génotype doit comprendre au moins neuf répétitions, chacune consistant en une seule chambre respirométrique contenant 15 à 25 mouches, configurée comme décrit ci-dessous.
2. Transférez les mouches tous les 2-3 jours.
3. Anesthésier les mouches avec du CO₂, prélever des groupes de 15 à 25 mâles de chaque génotype et placer chaque groupe dans des flacons d’aliments frais et sans levure.
   NOTE : Les mâles ont été utilisés pour réduire la variabilité due à l’état reproducteur. La méthode s’applique aux deux sexes.
4. Laisser les mouches se rétablir à 25 °C pendant au moins 24 h.
   REMARQUE : Au moment de l’expérience, les mouches devraient être âgées de 1 à 4 jours. La fréquence des collectes décrite à l’étape 1.3 peut être réglée de manière à réduire la tranche d’âge des mouches.

2. Installation et assemblage de la chambre du respiromètre

1. Allumez le bain-marie et réglez-le à la température souhaitée pour l’expérience.
   NOTE : Les expériences ci-dessous ont été menées à 25 °C en utilisant des tubes de Schlenk de 50 ml comme chambres. Les composants doivent être assemblés comme indiqué dans les figures 1A, 1B et 1C.
2. Nettoyez soigneusement les joints en verre dépoli des chambres et des bouchons de capteur en pulvérisant de l’éthanol à 70 % sur une lingette de laboratoire (et non directement sur le joint) et en essuyant la poussière et la vieille graisse du bouchon du capteur (Figure 1A). Essuyez l’éthanol avec une nouvelle lingette de laboratoire.
3. Placez un morceau de coton de 1 cm imbibé d’eau purifiée dans le fond de la chambre pour stabiliser l’humidité.
   1. Ajoutez suffisamment d’eau (~0,5 ml) pour former une petite piscine au fond du rouleau de coton.
4. Essuyez l’eau qui s’est renversée sur le joint de la chambre.
5. Transférez les mouches dans des tubes en polypropylène étiquetés à l’aide d’un entonnoir.
   1. Branchez le tube à l’aide d’un rouleau de coton.
      REMARQUE : Les tubes sont constitués d’un tube à essai en polypropylène de 5 ml, coupé à 5,5 cm de longueur et perforé avec un couteau chaud pour permettre le libre échange d’air avec la chambre expérimentale. L’anesthésie au CO₂ est connue pour provoquer des anomalies métaboliques, de sorte que les mouches sont transférées sans anesthésie, ce qui nécessite plus de soins pour éviter de perdre les mouches.
6. Ajoutez un tube ventilé contenant des mouches dans chaque chambre du respiromètre (au-dessus du coton humide).
7. Remplissez des cartouches de chaux sodée (4-5 granulés par tube) et placez-les sur le dessus du tube contenant les mouches à l’intérieur de la chambre.
   REMARQUE : Les cartouches de chaux sodée sont constituées de tubes à centrifuger de 800 μL perforés 4 à 5 fois à l’aide d’une perceuse électrique.
8. Remplir les générateurs O₂ avec une solution de sulfate de cuivre saturé (CuSO₄) sous le niveau des orifices d’aération
   REMARQUE : Les générateurs O₂ sont constitués de tubes à centrifuger à bouchon à vis avec 4 trous percés sous les filetages. Les électrodes en platine (Pt) et en cuivre (Cu) sont soudées à un connecteur à deux broches, insérées dans des trous percés dans le capuchon et fixées avec de l’époxy. L’électrolyse du CuSO₄ génère l’O₂ consommé par l’organisme expérimental. CuSO₄ est toxique pour les invertébrés, évite les déversements ou les fuites et nettoie immédiatement.
9. Connectez le générateur O₂ rempli au connecteur à deux broches sur la fiche du capteur.
   REMARQUE : La cathode en cuivre doit se connecter à la sortie négative du contrôleur et à l’anode en platine au fil positif. Les connexions inversées entraîneront l’échec de l’expérience.
10. Placez deux petites noisettes de graisse silicone transparente sur les côtés opposés du joint en verre dépoli de la fiche du capteur.
11. Insérez le bouchon dans la chambre et faites pivoter le bouchon (ou la chambre) avec une pression modérée pour répandre la graisse dans le joint.
    1. Essuyez l’excès de graisse avec une lingette de laboratoire.
12. Fixez les pinces Keck en plastique sur les joints pour fixer les bouchons dans les chambres. La chambre assemblée doit ressembler à la figure 1C.
13. Répétez les étapes ci-dessus pour le nombre de chambres utilisées pour l’expérience du jour.
    REMARQUE : Le nombre de chambres pouvant être enregistrées est limité par le nombre de chambres, de contrôleurs et d’entrées USB disponibles pour l’ordinateur. Pour les expériences actuelles, sept chambres ont normalement été exécutées en parallèle. Les mouches expérimentales telles que les mutantes doivent être appariées avec des témoins appropriés. Une chambre installée à l’identique mais sans mouches doit être incluse dans chaque expérience pour contrôler les variations environnementales. Les chambres contenant différents traitements (mutant, wildtype, no-fly) doivent faire l’objet d’une rotation entre les expériences.
14. Placer les chambres assemblées dans une grille au bain-marie avec les robinets d’arrêt ouverts (Figure 1E).
    REMARQUE : Pour éviter les variations circadiennes, les chambres ont été placées dans le bain entre 9h30 et 9h50 pour toutes les expériences décrites ici.
15. Laissez les robinets d’arrêt ouverts (gardez la poignée parallèle au robinet d’arrêt).
    REMARQUE : Veillez à ne pas laisser l’eau pénétrer dans les robinets d’arrêt.
16. Laissez les chambres s’équilibrer avec les robinets d’arrêt ouverts pendant environ 30 min.
    REMARQUE : Pendant que la chambre est en équilibre, connectez l’électronique et configurez l’acquisition de données comme décrit ci-dessous.

3. Configuration des contrôleurs et de l’ordinateur

1. Assurez-vous que les interrupteurs fournissant du courant aux générateurs O₂ sont en position OFF (loin du connecteur ; Graphique 1D).
2. Branchez chaque boîtier de contrôleur sur un port USB (Universal Serial Bus) disponible.
   NOTE : Construction et programmation des unités de contrôle décrites ailleurs¹².
3. Connectez les contrôleurs aux chambres du respiromètre à l’aide de câbles à 6 conducteurs.
4. Vérifiez que les écrans à diodes électroluminescentes organiques (OLED) des contrôleurs (Figure 1D) affichent les paramètres environnementaux.
5. Allumez brièvement les générateurs O₂ à l’aide de l’interrupteur du contrôleur (Figure 1D).
   1. Si la valeur du courant passe de zéro à entre 35 et 55 mA, le contrôleur et la chambre sont prêts pour les expériences.
6. Déterminez quels ports COM sont utilisés par les contrôleurs, comme décrit ci-dessous.
   1. Cliquez sur l’icône Démarrer dans Microsoft Windows.
   2. Cliquez sur l’icône Paramètres .
   3. Cliquez sur Bluetooth et appareils.
   4. Assurez-vous que les contrôleurs et leurs ports COM apparaissent dans la liste des périphériques.
7. Ouvrez PuTTY sur le bureau et configurez un fichier journal pour chaque canal du respiromètre comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : PuTTY est un shell sécurisé gratuit et un client telnet qui est utilisé pour transférer des données à l’ordinateur via des ports COM.
   1. Sélectionnez le port COM d’un contrôleur en tapant le numéro du port dans la zone « Ligne série » (Figure 2A).
   2. Cliquez sur Journalisation.
   3. Sélectionnez Sortie imprimable dans « Enregistrement de session » (Figure 2B).
   4. Sous Nom du fichier journal, cliquez sur Parcourir.
   5. Dans le dossier de votre choix, créez un nom de fichier contenant des informations descriptives (par exemple, la date, l’espèce, le numéro de port COM).
   6. Cliquez sur Save (Enregistrer).
   7. Cliquez sur Ouvrir. Une fenêtre s’ouvre et affiche les données délimitées par des virgules en cours d’enregistrement (Figure 2C).
   8. Répétez l’opération pour tous les autres contrôleurs utilisés dans le cadre de l’expérience. L’entrée de chaque port COM s’affiche sous la forme d’une fenêtre distincte (Figure 2D).

4. Exécution d’expériences

1. Une fois que les chambres se sont équilibrées pendant 30 minutes, scellez-les en fermant les robinets d’arrêt.
2. Couvrez la baignoire et les chambres avec une boîte en mousse de polystyrène pour maintenir un environnement stable.
3. Laisser reposer encore une heure.
4. Allumez le courant vers le générateur O₂ de chaque chambre à l’aide de l’interrupteur situé sur le boîtier de contrôle.
5. Une fois que les générateurs O₂ sont activés, assurez-vous que la pression augmente jusqu’à la pression d’arrêt préréglée.
   NOTE : 1017 hPa, qui est légèrement au-dessus de la pression atmosphérique, a été utilisée comme pression « OFF » dans cette série d’expériences. Le retour à la pression ambiante indiquera une fuite de gaz des chambres. De plus, il permet d’utiliser la même pression d’une expérience à l’autre, quelle que soit la pression barométrique ambiante. La pression « ON » était de 1016 hPa, ce qui signifie qu’il suffisait de baisser de 1 hPa pour que le générateur d’O2 soit activé. Cela a fourni une sensibilité adéquate pour mesurer la consommation d’O2 chez la drosophile. Une fois qu’une chambre est pressurisée au réglage « OFF », le courant devrait tomber à zéro.
6. Laissez l’expérience se dérouler pendant 3 h ou plus.
   REMARQUE : Une V_O2 plus élevée à des températures élevées peut permettre des durées d’expérience plus courtes. Surveillez de temps en temps pour vous assurer que l’équipement fonctionne, mais évitez toute activité excessive à proximité des chambres qui pourrait affecter la stabilité de la température.

5. Expérience de finition

1. Éteignez les générateurs O₂ sur tous les contrôleurs.
   REMARQUE : Évitez d’abord de faire fonctionner les générateurs O₂ lorsque les chambres sont ouvertes.
2. Ouvrez les robinets d’arrêt pour desceller les chambres.
3. Laissez les fenêtres PuTTY ouvertes pendant encore 5 à 15 minutes pour fournir une base de référence finale.
4. Fermez la fenêtre PuTTY pour chaque contrôleur, mettant fin aux enregistrements.
   REMARQUE : Toutes les expériences se sont terminées entre 16 h 50 et 17 h 10.
5. Débranchez les capteurs des câbles.
6. Déplacez les chambres sur une grille sèche.
7. Retirez les fiches du capteur une par une des chambres.
8. Débranchez les générateurs O₂ et placez-les dans le rack à tubes.
9. Essuyez la graisse de la fiche du capteur et conservez-la dans le rack.
10. Nettoyez la graisse des joints de la chambre et retirez les tubes contenant des mouches et de la chaux sodée.
11. Anesthésier les mouches dans chaque tube avec du CO_2, tapoter sur un bateau de poids et peser sur une microbalance.
    1. Enregistrez le poids et le nombre de mouches pour chaque tube.
12. Jetez les mouches ou mettez-les de côté pour des procédures supplémentaires.
13. Videz la chaux sodée des cartouches dans le conteneur à déchets.
14. Ouvrez le générateur O₂ et jetez la solution CuSO₄ dans le conteneur à déchets.
    1. Rincez les électrodes et le tube avec de l’eau purifiée.
    2. Placez les grilles tubulaires pour le séchage.

6. Analyse des données de transfert de charge

1. Importez des données sous forme de texte délimité par des virgules dans une feuille de calcul, chaque enregistrement étant constitué d’une feuille de calcul distincte.
2. Enregistrez les données actuelles et temporelles pour chaque impulsion du générateur_d’O2 . En commençant par la première impulsion après la mise sous pression de la chambre, notez l’heure de début et l’heure de fin (sous forme de numéros de ligne) de chaque impulsion actuelle. Il s’agit du numéro de ligne lorsque le courant passe au-dessus de zéro (généralement à environ 45-50 mA) jusqu’à la dernière ligne qui est au-dessus de zéro.
3. Créez un tableau sur la feuille de calcul pour noter les données suivantes :
   1. L’amplitude moyenne du courant pendant l’impulsion : = AVERAGE([première ligne d’impulsion] :[dernière ligne d’impulsion]) pour chaque impulsion (à partir de la colonne actuelle).
   2. Durée de l’impulsion : ([Dernière ligne d’impulsion] - [première ligne d’impulsion[-une ligne]])/1000 pour chaque impulsion (à partir de la colonne temps en millisecondes).
   3. Durée totale de l’expérience : [temps au début de la dernière impulsion] - [temps à la fin de la première impulsion après la mise sous pression de la chambre] (à partir de la colonne temps en minutes).
4. Calculez ensuite le transfert de charge (Q) pour chaque impulsion (durée X du courant moyen)
5. Additionnez la charge de toutes les impulsions pour calculer la charge totale (Q_tot).

7. Analyse de la consommation_d’O2

1. Configurez une nouvelle feuille de calcul pour toutes les données et saisissez ou calculez les éléments suivants pour chaque chambre :
   1. Q_tot (charge totale)
   2. Taupes (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL O₂ (= moles × 22413 mL/mol)
   4. Temps total (à partir de l’analyse des données ci-dessus)
   5. mL ^min-1 (= ml Ø₂ ÷ temps total)
   6. Poids en grammes (mouches anesthésiées et pesées mesurées après l’expérience)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 ÷ poids en grammes)
   8. mL/h/g (le × ci-dessus 60)
   9. mg/mouche (= poids des mouches ÷ nombre de mouches)
   10. μL fly-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ nombre de mouches).
2. Compiler les données pour chaque traitement (génotype, p. ex.)
3. Comparez les traitements à l’aide de l’ANOVA, du test t ou du test u de Mann-Whitney ¹³.

Representative Results

Les sorties de pression et de courant du contrôleur du respiromètre sont illustrées pour une chambre dans une expérience à la figure 3A. La première impulsion de courant long a pressurisé la chambre de la pression ambiante (environ 992 hPa) au seuil d’arrêt prédéfini de 1017 hPa. Au fur et à mesure que les mouches consommaient de l’O 2 et que le CO₂ était absorbé, la pression diminuait lentement jusqu’à ce qu’elle atteigne le seuil ON de 1016 hPa, ce qui activait le courant à travers le générateur d’O2. Dans l’exemple ci-dessus, l’amplitude moyenne de chaque impulsion est de 50,1 mA, la durée est de 16,1 s, ce qui donne un transfert de charge d’environ 0,81 coulombs (C) par impulsion. Le transfert de charge total pour cette chambre a été de 3,28 °C sur une durée totale de 240,0 minutes. En utilisant les calculs décrits dans les procédures avec la masse et le nombre de mouches (23 mouches pesant 14,9 mg au total), la consommation d’O2 pour le groupe dans cette chambre était de 3,19 mL ^h-1 g-1 ou 2,07 μL h-1 ^fly-1.

L’équipement peut être installé facilement, avec un minimum de formation, et fonctionne de manière fiable pendant de nombreux cycles d’assemblage et d’arrêt. Néanmoins, l’équipement doit être entretenu et inspecté régulièrement, et les conditions expérimentales doivent être contrôlées avec soin. Par exemple, la perte d’un joint d’étanchéité au gaz, due à la défaillance d’un joint ou d’un robinet d’arrêt, peut entraîner des cycles de pressurisation rapides et une V2_O2 trop élevée (figure 3B). De plus, la température et l’humidité doivent rester stables à l’intérieur de la chambre. Si la température ou l’humidité diminue, la chute de pression qui en résulte sera interprétée à tort comme la consommation d’O₂. À l’inverse, une dérive vers le haut de la température ou de l’humidité contrecarrera la diminution de pression causée par la consommation d’O2 et réduira ou éliminera artificiellement le signal V_O2 (Figure 3C).

La méthode a été utilisée pour tester V_O2 de mutants CASK ^Δ18, qui ont été générés par l’excision imprécise d’un élément transposable du locus CASK 14, et dans lesquels la locomotion est considérablement réduite^14,16. Dans les témoins w(ex33) de type sauvage, générés par excision précise de l’élément transposable, la consommation moyenne d’O₂ spécifique de la masse était de 3,65 ± 0,24 mL·g-1·^h-1 (n = 16 chambres ; Graphique 4A).

Malgré leur locomotion visiblement réduite, le V_O2 des mutants CASK^Δ18 était légèrement mais pas significativement inférieur à celui des témoins (moyenne ± s.e.m. = 3,23 ± 0,13 mL·g-1·^h-1 ; n = 11 groupes ; P = 0,08 test u de Mann-Whitney).

Étant donné que la validité de l’expression du taux métabolique en termes de masse corporelle a été remise en question¹⁸,_{la consommation} d’O2 a également été analysée par mouche (Figure 4B). À l’aide de cette analyse, la V_O2 a été significativement réduite dans le CASK^Δ18 par rapport aux témoins de type sauvage (ex33 : 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·^h-1 ; FÛT^Δ18 : 1,58 ± 0,10 μL·fly-1·^h-1 ; P = 0,0003, test de Mann-Whitney). Cependant, la masse moyenne des mouches CASK^Δ18 était inférieure de >20 % à celle des témoins ex33 (Figure 4C ; ex33 0,61 ± 0,01 mg ; FÛT^Δ18 0,51± 0,02 mg ; P = 0,0005, u-test de Mann-Whitney), de sorte que la différence de taux métabolique entre les génotypes est probablement due à la différence de leur taille.

Figure 1 : Configuration du respiromètre. (A) Schéma de la fiche du capteur (ci-dessus) et de la chambre de 50 mL (constituée d’un tube Schlenk de 50 mL, ci-dessous) avant l’assemblage. Notez l’emplacement des joints en verre dépoli 19/22 qui relieront la chambre et la fiche du capteur, et qui doivent être nettoyés avant chaque expérience. Le robinet d’arrêt, nécessaire à l’ouverture ou à l’étanchéité de la chambre, est également indiqué. (B) Schéma de la chambre et des composants, assemblés et prêts pour l’expérience, montrant : un rouleau de coton humide, un tube en polypropylène contenant des mouches, bouché avec un bouchon en coton, une cartouche de chaux sodée et un générateur d’O₂ rempli de CuSO₄. (C) Photographie de la chambre assemblée. La pince Keck fixant le bouchon à la chambre est partiellement masquée par la pince du support annulaire qui maintient la chambre. (D) Photographie du contrôleur montrant l’interrupteur contrôlant le courant à travers le générateur O₂ et la fenêtre pour visualiser l’écran OLED. (E) Chambres assemblées dans un bain-marie. Sept chambres sont représentées, dont trois contenant des mutants, trois avec des témoins de type sauvage et une chambre contenant tous les composants à l’exception des mouches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Configuration de l’acquisition de données. (A) Interface PuTTY pour la sélection du port série pour l’acquisition de données. COM3 a été sélectionné, avec un débit en bauds de 9600 pour correspondre à la sortie du contrôleur. (B) Interface PuTTY pour la mise en place du fichier journal. « Sortie imprimable » est sélectionné pour permettre l’enregistrement des données dans un fichier texte, le dossier de données est sélectionné à l’aide du bouton « Parcourir » et un nom de fichier est créé. (C) Fichier journal PuTTY au cours d’une expérience. Les données sont acquises environ deux fois par seconde, et chaque ligne contient les informations suivantes délimitées par des virgules : numéro du capteur, temps (ms) depuis le début de l’acquisition, température de la chambre (°C), pression de la chambre (hPa), humidité (pourcentage relatif) et courant (mA). (D) Enregistrement des données au cours d’une expérience typique, avec sept fenêtres pour les chambres expérimentales, plus un canal enregistrant la température du bain, la température de l’air ambiant, la pression et l’humidité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Données du microrespiromètre. (A) Pression (ligne grise, axe de gauche) et courant aux bornes du générateur d’O₂ (ligne noire, axe de droite) dans une seule chambre de respiromètre contenant 23 mouches w(ex33). Au début, une longue impulsion de courant est nécessaire pour pressuriser la chambre de ~992 hPa au seuil OFF de 1017 hPa. Au fur et à mesure que les mouches consommaient de l’O 2, la pression a chuté jusqu’à ce qu’elle atteigne le seuil ON de 1016 hPa, ce qui a activé le courant à travers le générateur d’O₂, ce qui a repressurisé la chambre à 1017 hPa. Le processus a été répété six fois dans cette expérience. (B) Un exemple d’une chambre qui fuit causée par un robinet d’arrêt endommagé, tiré d’une autre série d’expériences. La chambre n’a pas réussi à maintenir la pression (ligne grise), ce qui a entraîné un cycle constant du courant électrolytique (ligne noire). Notez que l’échelle de temps est différente de celle du panneau A. (C) Effet de la dérive de l’humidité. La consommation d’O2 par la coccinelle (Hippodamia convergens) de 20 mg dans la chambre aurait dû produire un cycle de pression similaire à celui de la figure 3A, mais l’augmentation constante de l’humidité (ligne noire) a provoqué une augmentation artificielle de la pression de la chambre (ligne grise) qui masquait V_O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Données quantitatives de D. melanogaster de type sauvage et mutant de type CAS. (A) V_O2 spécifique à la masse pour les mouches de type sauvage (w(ex33)) et mutantes (CASK^Δ18). Dans toutes les parcelles, le bas et le haut des cases indiquent respectivement le premier et le troisième quartile, les moustaches indiquent les valeurs extrêmes et la taille des échantillons (nombre de chambres, chacune contenant 17 à 24 mouches) est indiquée entre parenthèses au-dessus des génotypes. Les mouches CASK Δ18 ne sont pas statistiquement significativement différentes de l’ex33 (médiane : ex33 : 3,420 mL·g-1·h-1 , CASK^Δ18 : 3,029 mL·g-1·h-1 ; p = 0,08 u-test de ^Mann-Whitney). (B) V_O2 spécifique à la mouche. Les mouches ^Δ18en fûtont consommé significativement moins d’O 2 (médiane de 1,650 mL·fly-1·h-1) que w(ex33) (2,078 mL·fly-1·h-1 ; p = 0,0003, test u de ^Mann-Whitney ; signification indiquée par des astérisques). (C) La masse différait entre le CASK^Δ18 et le type sauvage (médiane : 0,526 mg, ex33 : 0,623 mg ; p = 0,0005, test u de Mann-Whitney ; signification indiquée par des astérisques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1. Étude des données de respirométrie de la drosophile sur des mouches sauvages à 25 °C. À une exception^près18, les études sont limitées à celles mesurant la consommation d’O2. Dans la plupart des cas, il a été nécessaire d’estimer la V_O2 à partir de graphiques, et les chiffres des documents originaux sont fournis. Bien que tous les génotypes aient été considérés comme « de type sauvage », les sources et les méthodes de propagation variaient. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La procédure ci-dessus illustre la mesure de la consommation d’O₂ chez D. Melanogaster à l’aide d’un microrespiromètre coulométrique électronique. Les données obtenues pour la consommation_d’O2 chez le D. melanogaster de type sauvage se situaient dans les fourchettes décrites dans la plupart des publications antérieures utilisant diverses méthodes (tableau 1), bien qu’un peu inférieures à celles rapportées^{par d’autres 3,6}.

Les étapes critiques répondaient aux deux exigences absolues de la méthode : l’étanchéité au gaz et la stabilité environnementale. Le maintien d’un environnement étanche au gaz est simple mais nécessite des soins. Les flacons et les tubes Schlenk conviennent parfaitement comme chambres de respirométrie. La construction en verre évite la perméabilité aux gaz présente dans de nombreux types de plastique¹⁹, ce qui est particulièrement critique dans les expériences prolongées. Les joints standard permettent des connexions étanches au gaz avec les fiches contenant les capteurs et les connexions électroniques. Les robinets d’arrêt fournissent des joints fiables et peuvent être ouverts ou fermés selon les besoins pendant les expériences. Pour assurer l’étanchéité au gaz de chaque expérience, les robinets d’arrêt ont été inspectés, les joints ont été nettoyés à fond, des quantités judicieuses de graisse de silicone propre ont été appliquées et les joints ont été fixés avec des pinces Keck.

La sensibilité de la méthode est limitée par la stabilité de la température et de l’humidité à l’intérieur de la chambre. Les changements dans l’un ou l’autre paramètre entraîneront des fluctuations de pression qui interfèrent avec le signal V_O2. L’utilisation d’une chambre climatique¹² ou d’un bain-marie à circulation permet un contrôle plus stable de la température. Des travaux antérieurs réalisés par d’autres ont démontré que la méthode peut mesurer la consommation d’O2 au niveau de nmol·^h-1 lorsque la température est maintenue à moins de ±0,01 °C²⁰. Pour stabiliser l’humidité, des morceaux de rouleau de coton immergés dans l’eau maintenaient l’humidité à près de 100%. La température et l’humidité ont été autorisées à se stabiliser pendant au moins 90 minutes avant que les chambres ne soient pressurisées avec de l’O₂ généré par électrolyse et que les enregistrements ne commencent. Toutes les expériences comprenaient une chambre qui a été assemblée avec tous les composants, mais qui ne contenait pas de mouches, afin de surveiller les conditions environnementales.

La surveillance constante et régulière de la température, de la pression et de l’humidité simplifie considérablement le dépannage. Par exemple, il a été possible de détecter et de corriger la V2 apparente artificiellement_{élevée causée par} un robinet d’arrêt endommagé (figure 3B) ou la perte apparente de_VO2 due à l’instabilité de l’humidité de la chambre (figure 3C).

Le microrespiromètre coulométrique décrit ici présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il est relativement peu coûteux, avec un coût total approximatif de 100 $ par canal (comprenant la chambre, le capteur et le contrôleur). Deuxièmement, comme chaque canal acquiert et transmet des données indépendamment, le système est évolutif, le nombre de chambres n’étant limité que par la taille du contrôleur environnemental (bain-marie ou chambre environnementale) et le nombre de ports USB disponibles dans l’ordinateur (généralement extensible à >100). De plus, comme les chambres et les contrôleurs sont indépendants, la défaillance de l’un d’entre eux n’affectera pas les autres. Troisièmement, les contrôleurs peuvent être facilement reprogrammés pour s’adapter à la pression ambiante ou pour ajuster la sensibilité selon les besoins. Dans le même ordre d’idées, la pression à l’intérieur des chambres est réglée sur une valeur fixe, de sorte que la pression expérimentale sera constante d’une expérience à l’autre, quelle que soit la pression barométrique ambiante. Quatrièmement, le flux constant de données concernant le temps, la température, la pression, l’humidité et le courant permet une analyse détaillée de ces paramètres pour chaque chambre, ce qui facilite le dépannage ou l’analyse des changements temporels de V_O2 dans des expériences plus longues. Enfin, les conditions environnementales à l’intérieur de la chambre peuvent être maintenues à un niveau constant pendant plusieurs heures ou jours, car l’O₂ consommé est continuellement remplacé. Dans la présente étude, la pression de la chambre a fluctué de 1016 à 1017 hPa, soit moins de 0,1 %, la variation de P_O2 qui en résulte étant inférieure à 0,5 %. Sur la base de la quantité de CuSO₄ dans chaque générateur d’O 2, qui peut générer 28 mL d’O₂, et de la V_O2 moyenne des groupes de mouches dans cette étude, 1,15 mL / jour (moyenne =_21,8 mouches par chambre), le taux métabolique peut être étudié jusqu’à 24 jours à la fois. En supposant que les mouches reçoivent une nutrition adéquate, cela signifie que le métabolisme peut être étudié en continu pendant la majeure partie de la durée de vie d’une mouche.

À l’heure actuelle, la plupart des études sur le métabolisme de D. melanogaster sont basées sur l’analyse des gaz ou la manométrie. Les méthodes qui reposent sur l’analyse des gaz, telles que les respiromètres à débit d’arrêt et à débit continu ^2,3,6, présentent l’avantage que la méthode est bien établie et que l’équipement est disponible dans le commerce. Cependant, ils nécessitent des équipements coûteux et complexes, notamment des collecteurs et des capteurs de débit moléculaire pour réguler le débit, ainsi que des analyseurs de gaz pour mesurer les concentrations de gaz. Alternativement, les manomètres simples⁹ sont beaucoup moins chers. Dans la forme la plus simple, couramment utilisée pour D. melanogaster, les mouches sont anesthésiées et placées dans une petite chambre qui contient un matériau absorbant le CO₂ et qui est reliée à un réservoir de liquide par un tube capillaire. Au fur et à mesure que l’O 2 est consommé et que le CO₂ résultant est absorbé, la pression chute dans la chambre, ce qui attire le fluide dans le tube capillaire. La hauteur du fluide est alors proportionnelle à la quantité d’O₂ consommée. Étant donné que l’O₂ consommé n’est pas remplacé pendant l’expérience, le P_O2 diminue continuellement au cours de l’expérience. Bien que les expériences de routine ne réduisent pas suffisamment la P O2 pour affecter négativement la V O2, des expériences prolongées ou des expériences à des températures élevées peuvent épuiser l’O2 et atteindre la P O2 critique à laquelle la V _O2 diminue fortement³. Un autre problème est que le poids du fluide dans le capillaire exerce une force vers le bas, réduisant la hauteur du fluide proportionnellement à la force exercée vers le bas, ce qui entraîne des erreurs potentielles. Des méthodes pour compenser cet effet ont été décrites ^4,21, mais elles sont lourdes et ne sont pas largement utilisées. La comparaison directe de l’analyse des gaz et de la manométrie a indiqué que les deux méthodes produisaient des résultats significativement différents, mais les auteurs n’ont pas été en mesure de fournir une explication satisfaisante de la divergence²².

Malgré ses avantages, le microrespiromètre coulométrique présente également des limites. Tout d’abord, contrairement à certains systèmes d’analyse de gaz à flux arrêté, il n’est pas disponible dans le commerce. Les composants sont faciles à acquérir et ni la conception ni la programmation ne sont compliquées, mais il est potentiellement plus complexe à construire que les systèmes manométriques simples⁹. Deuxièmement, l’acquisition de données précises doit inclure plusieurs cycles de génération_d’O2 , de sorte que chaque expérience doit durer plusieurs heures. Il en va de même pour les expériences utilisant la manométrie. Enfin, toujours comme pour la manométrie, la température et l’humidité à l’intérieur des chambres doivent être stables. Néanmoins, le microrespiromètre coulométrique offre un juste milieu en termes de coût et de complexité, est robuste et fiable une fois assemblé, et mesure précisément la consommation d’O₂ .

Les expériences avec des mutants CASK^Δ18 démontrent à la fois des résultats négatifs (V O2 spécifique à la masse) et positifs (V_O2 spécifique à la mouche). Si la réduction de >50 % de la marche des mutants CASK^Δ18résultait d’un métabolisme compromis, on pourrait prédire que V_O2 serait réduit d’une quantité similaire. Pourtant, l’évolution de la consommation d’O2 spécifique à la masse était modeste (réduction de 9,6 % de_{la V2} médiane) et n’était pas statistiquement significative. Ce résultat négatif est cohérent avec le fait que les mutants CASK^Δ18 ont un métabolisme relativement normal, le phénotype comportemental résultant d’une diminution de la pulsion locomotrice. Bien qu’il soit possible que la méthode n’ait pas une sensibilité suffisante, la réduction de V_O2 causée par une différence de taille relativement faible (réduction de 15,5 % de la masse médiane) a été très significative.

La marche est associée à une augmentation significative de la dépense énergétique ^5,23, alors pourquoi le V_O2 est-il relativement normal chez les mutants CASK ? Il est possible qu’un toilettage excessif chez les mutants CASK¹⁶ puisse contrebalancer la réduction de la marche, ou que le phénotype de marche soit moins apparent lorsque les mouches sont testées en groupes dans de petits tubes, mais ces hypothèses attendent une vérification expérimentale. Néanmoins, nous concluons que les mutations dans le locus CASK n’ont pas d’effets forts et directs sur le métabolisme, et que le microrespiromètre coulométrique est un outil efficace pour étudier le métabolisme chez D. melanogaster.

Parce que cet appareil est facile à construire à partir de composants communs, qu’il mesure avec précision la consommation d’O₂ , qu’il est très portable, qu’il peut être utilisé dans n’importe quel environnement à température stable et qu’il a été utilisé avec des organismes aussi petits que 0,5 mg de mouches (la présente étude) et aussi gros que des scorpions de 500 mg (DJS non publié), il ajoute un outil polyvalent pour étudier le métabolisme de divers organismes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers