Summary
ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .
Abstract
מיקרו-רספירומטריה קולומטרית היא שיטה פשוטה וזולה למדידת צריכת O2 של אורגניזמים קטנים תוך שמירה על סביבה יציבה. מיקרו-רספירומטר קולומטרי מורכב מתא אטום שבו O 2 נצרך וה- CO2 המיוצר על ידי האורגניזם מוסר על ידי מדיום סופג. ירידת הלחץ כתוצאה מכך מפעילה ייצור אלקטרוליטי O 2, וכמות O2 המיוצרת נמדדת על ידי רישום כמות המטען המשמש ליצירתו. במחקר הנוכחי הותאמה השיטה לדרוזופילה מלנוגסטר שנבדקה בקבוצות קטנות, כאשר רגישות המכשיר ותנאי הסביבה מותאמים ליציבות גבוהה. כמות O2 הנצרכת על ידי זבובי בר במנגנון זה עקבית עם זו שנמדדה על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 ספציפית למסה על ידי מוטנטים של TASK, שהם קטנים יותר וידועים כפחות פעילים, לא הייתה שונה מקבוצת ביקורת קונגנית. עם זאת, הגודל הקטן של מוטנטים CASK הביא לירידה משמעותית בצריכת O2 על בסיס זבוב. לכן, המיקרו-רספירומטר מסוגל למדוד את צריכת O2 ב-D. melanogaster, יכול להבחין בהבדלים צנועים בין גנוטיפים, ומוסיף כלי רב-תכליתי למדידת קצב חילוף החומרים.
Introduction
היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים1, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים2, או את הסף ללחץ היפוקסי3.
ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים4. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (VO2), ייצור CO2 או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כולל Drosophila melanogaster5, רספירומטריה היא פשוטה יותר מבחינה טכנית ונפוצה יותר.
מספר צורות של רספירומטריה שימשו בהצלחה למדידת קצב חילוף החומרים בטבע ובמוטציה D. melanogaster וסיפקו תובנה לגבי ההשפעות המטבוליות של טמפרטורה6, סביבה חברתית 3, תזונה 3,7 והפרעות נוירו-התפתחותיות8. אלה נופלים לשני סוגים, אשר משתנים במידה ניכרת בעלות ובמורכבות. מנומטריה היאה-9,10 הפשוטה והזולה ביותר, שבה הזבובים מוכנסים לתא אטום המכיל סופגCO2 ומחובר באמצעות נימים דקים למאגר נוזלים. כאשר O 2 נצרך ו- CO2 נספג, הלחץ בחדר יורד ונוזל נשאב לתוך הנימים. הנפח המלא בנוזל של הנימים הוא אפוא פרופורציונלי ל- VO2. גרסאות משוכללות יותר, המפצות על הכוח המופעל על ידי הנוזל בנימים, שימשו גם על D. melanogaster1. למנומטריה יש את היתרונות של היותה פשוטה וזולה, אך מכיוון שהיא רגישה ללחץ, דורשת תנאי סביבה קבועים. יתר על כן, מכיוון שנצרך O 2 אינו מוחלף, הלחץ החלקי של O2 (PO2) יורד בהדרגה בתוך החדרים.
רספירומטריה באמצעות ניתוח גז משמשת באופן קבוע גם עבור D. melanogaster. במקרה זה, גזים נדגמים במרווחי זמן קבועים מחדרים אטומים המכילים זבובים ונשלחים לאנלייזר אינפרא אדום 2,6,11. לסוג זה של מכשיר יש את היתרונות שהוא זמין מסחרית, הוא פחות רגיש לתנאי הסביבה, וגזים מתחדשים במהלך הדגימה כך ש- PO2 נשאר יציב. עם זאת, הציוד יכול להיות יקר ומורכב לתפעול.
מיקרו-רספירומטרקולומטרי 12 שפותח לאחרונה מספק חלופה זולה, רגישה ויציבה למערכות קיימות. בפועל, אורגניזם ממוקם לתוך תא אטום שבו הוא צורך O 2 ואת CO2 נשוף מוסר על ידי חומר סופג, וכתוצאה מכך ירידה נטו בלחץ החדר. כאשר הלחץ הפנימי יורד לסף מוגדר מראש (ON-threshold), הזרם מועבר דרך מחולל אלקטרוליטי O2, ומחזיר את הלחץ לסף שני (OFF-threshold) העוצר אלקטרוליזה. העברת מטען על פני מחולל O 2 עומדת ביחס ישר לכמות O 2 הנדרשת ללחץ מחדש על התא ולכן ניתן להשתמש בה כדי למדוד את O2 הנצרך על ידי האורגניזם4. השיטה רגישה מאוד, מודדת V O2 במדויק, וההחלפה הקבועה של O2 יכולה לשמור על PO2 ברמה כמעט קבועה במשך שעות או ימים.
המיקרו-רספירומטר הקולומטרי המשמש במחקר זה משתמש בחיישן אלקטרוני רב-מודאלי (לחץ, טמפרטורה ולחות). החיישן מופעל על ידי מיקרו-בקר המזהה שינויים קטנים בלחץ ומפעיל דורO 2 כאשר מגיעים לסף לחץ נמוך12. מכשיר זה מורכב מחלקי המדף, ניתן להשתמש בו עם מגוון רחב של תאים וסביבות ניסוי, ושימש בהצלחה לבחינת ההשפעות של מסת הגוף והטמפרטורה על החיפושית Tenebrio molitor. במחקר הנוכחי, המיקרו-רספירומטר הותאם למדידת צריכת O2 ב- D. melanogaster, שיש לו כ -1% מהמסה של T. molitor. רגישות המנגנון הוגברה על ידי הפחתת הסף להפעלת דורO 2 , והיציבות הסביבתית שופרה על ידי ביצוע ניסויים באמבט מים מבוקר טמפרטורה ועל ידי שמירה על לחות בתוך התאים ברמה של 100% או קרוב לכך.
חלבון CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), חלק ממשפחת הקינאזות הגואנילטות הקשורות לקרום (MAGUK), הוא פיגום מולקולרי בקומפלקסים רב-חלבוניים שונים, ומוטציות ב-CASK קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות בבני אדם וב-D. melanogaster13,14. מוטציה בת קיימא של D. melanogaster, CASKΔ18, משבשת את הפעילות של נוירונים דופמינרגיים 15 ומפחיתה את רמות הפעילות ביותר מ-50% בהשוואה לבקרות קונגניות14,16. בגלל רמות הפעילות הנמוכות יותר של מוטציות CASK ותפקידם של קטכולאמינים בוויסות חילוף החומרים17 שיערנו שקצב חילוף החומרים הסטנדרטי שלהם, ולכן צריכת O2, יופחתו באופן דרמטי בהשוואה לבקרות.
צריכת O2 נמדדה ב-CASKΔ18 ובקונגנרים הפראיים שלהם, w(ex33). קבוצות של זבובים הוכנסו לתאי רספירומטריה, צריכת O 2 נמדדה, צריכת O2 חושבה והתבטאה הן על בסיס מסה ספציפית והן על בסיס זבוב. המנגנון תיעד VO2 בזבובי בר שהיה עקבי עם מחקרים קודמים, והוא יכול היה להבדיל בין צריכת O2 לכל זבוב של זבובי בר לבין צריכת מוטציות CASK לכל זבוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול ואיסוף זבובים
- יש לשמור על זבובים בטמפרטורה של 25°C בבקבוקונים צרים המכילים מזון דרוזופילה סטנדרטי.
הערה: גודל הדגימה עבור כל גנוטיפ צריך לכלול לפחות תשעה עותקים משוכפלים, שכל אחד מהם מורכב מתא רספירומטר יחיד המכיל 15-25 זבובים, המוגדרים כמתואר להלן. - מעבירים את הזבובים כל 2-3 ימים.
- מרדימים זבובים עםCO2, אוספים קבוצות של 15-25 זכרים מכל גנוטיפ, ומניחים כל קבוצה בבקבוקוני מזון טריים ללא שמרים.
הערה: זכרים שימשו כדי להפחית את השונות עקב מצב הרבייה. השיטה חלה על שני המינים. - אפשרו לזבובים להתאושש ב-25°C למשך 24 שעות לפחות.
הערה: בזמן הניסוי, הזבובים צריכים להיות בני 1-4 ימים. ניתן להגדיר את תדירות האוספים המתוארת בשלב 1.3 כך שתצמצם את טווח הגילאים של הזבובים.
2. התקנה והרכבה של תא רספירומטר
- הפעל את אמבט המים והגדר אותו לטמפרטורה הרצויה לניסוי.
הערה: הניסויים להלן נערכו ב 25 ° C באמצעות 50 מ"ל צינורות Schlenk כמו תאים. יש להרכיב רכיבים כפי שמוצג באיורים 1A, 1B ו-1C. - נקו היטב את חיבורי הזכוכית הטחונים של התאים ותקעי החיישנים על-ידי ריסוס אתנול 70% על מגבון מעבדה (לא ישירות על המפרק) וניגוב אבק ושומן ישן מתקע החיישן (איור 1A). נגבו אתנול עם מגבון מעבדה טרי.
- הניחו חתיכת גליל כותנה ספוג במים מטוהרים בקוטר 1 ס"מ לתחתית התא כדי לייצב את הלחות.
- מוסיפים מספיק מים (~ 0.5 מ"ל) כדי ליצור בריכה קטנה בתחתית גליל הכותנה.
- נגבו את כל המים שנשפכו על מפרק החדר.
- העבירו את הזבובים לצינורות פוליפרופילן מסומנים באמצעות משפך.
- חבר את הצינור עם גליל כותנה.
הערה: הצינורות מורכבים ממבחנה מפוליפרופילן בנפח 5 מ"ל, גזוז לאורך 5.5 ס"מ ומחורר בסכין חמה כדי לאפשר חילופי אוויר חופשיים עם תא הניסוי. הרדמה CO2 ידועה כגורמת להפרעות מטבוליות, ולכן זבובים מועברים ללא הרדמה הדורשת טיפול רב יותר כדי למנוע את אובדן הזבובים.
- חבר את הצינור עם גליל כותנה.
- הוסיפו צינור מאוורר אחד עם זבובים לכל תא רספירומטר (על גבי כותנה רטובה).
- מלאו את מחסניות הסודה ליים (4-5 כדורים לכל צינור) והניחו אותן על החלק העליון של הצינור המכיל זבובים בתוך התא.
הערה: מחסניות סודה ליים מורכבות מצינורות צנטריפוגות של 800 מיקרוליטר המחוררים 4-5 פעמים באמצעות מקדחה חשמלית. - מלא גנרטורים O2 בתמיסת נחושת גופרתית רוויה (CuSO4) מתחת לרמה של חורי אוורור
הערה: O2 גנרטורים מורכבים מצינורות צנטריפוגות עם מכסה בורג עם 4 חורים שנקדחו מתחת לחוטים. אלקטרודות פלטינה (Pt) ונחושת (Cu) מולחמות למחבר בעל שני פינים, מוכנסות לחורים שנקדחו במכסה ומודבקות באפוקסי. אלקטרוליזה של CuSO4 מייצרת את O2 הנצרך על ידי האורגניזם הניסיוני. CuSO4 רעיל לחסרי חוליות, יש להימנע מנזילות או דליפה ולנקות מיד. - חבר את מחולל O2 המלא למחבר שני פינים בתקע החיישן.
הערה: קתודה נחושת חייב להתחבר עם הפלט השלילי של הבקר ואת אנודת פלטינה לחוט חיובי. קשרים הפוכים יגרמו לכישלון הניסוי. - הניחו שתי טפיחות קטנות של שומן סיליקון שקוף משני הצדדים של מפרק הזכוכית הטחונה של תקע החיישן.
- הכנס את התקע לתא וסובב את התקע (או התא) בלחץ מתון כדי לפזר את השומן במפרק.
- נגבו את עודפי השומן במגבון מעבדה.
- הצמד פלסטיק Keck מהדק על המפרקים כדי לאבטח תקעים בתאים. התא המורכב צריך להיראות כמו איור 1C.
- חזור על השלבים לעיל עבור מספר התאים המשמשים לניסוי היום.
הערה: מספר התאים שניתן להקליט מוגבל על-ידי מספר החדרים, הבקרים וכניסות ה-USB הזמינים למחשב. בניסויים הנוכחיים, שבעה תאים הופעלו בדרך כלל במקביל. זבובי ניסוי כגון מוטנטים צריכים להיות מותאמים לבקרות מתאימות. תא הבנוי באופן זהה אך ללא זבובים צריך להיכלל בכל ניסוי כבקרה לשונות סביבתית. תאים המכילים טיפולים שונים (מוטנטיים, wildtype, no-fly) צריכים להיות מסובבים בין ניסויים. - הכניסו תאים מורכבים למתלה באמבט המים עם סטופקוקים פתוחים (איור 1E).
הערה: כדי למנוע שינויים צירקדיים, תאים הוכנסו לאמבטיה בין השעות 9:30 ל-9:50 בבוקר עבור כל הניסויים המתוארים כאן. - השאירו סטופקוקים פתוחים (השאירו את הידית מקבילה לסטופקוק).
הערה: היזהר לא לאפשר למים להיכנס לסטופקוקים. - אפשרו לתאים להתאזן עם סטופקוקים פתוחים למשך כ-30 דקות.
הערה: כאשר התא מאוזן יתר על המידה, חבר את האלקטרוניקה והגדר רכישת נתונים כמתואר להלן.
3. הגדרת בקרים ומחשב
- ודא שהמתגים המספקים זרם לגנרטורים O2 נמצאים במצב OFF (הרחק מהמחבר; איור 1D).
- חבר כל קופסת בקר ליציאת אפיק טורי אוניברסלי (USB) זמינה.
הערה: בנייה ותכנות של יחידות בקר המתוארות במקום אחר12. - חבר בקרים לתאי ספירומטר באמצעות כבלים בעלי 6 מוליכים.
- בדקו שצגי הדיודה פולטת האור האורגני (OLED) של הבקרים (איור 1D) מציגים פרמטרים סביבתיים.
- הפעילו לזמן קצר גנרטורים O2 באמצעות המתג של הבקר (איור 1D).
- אם הערך הנוכחי עולה מאפס ל בין 35 ל 55 mA, הבקר והתא מוכנים לניסויים.
- קבע אילו יציאות COM נמצאות בשימוש על-ידי הבקרים, כמתואר להלן.,
- לחץ על סמל התחל ב- Microsoft Windows.
- לחץ על סמל הגדרות .
- לחץ על Bluetooth והתקנים.
- ודא שהבקרים ויציאות ה-COM שלהם מופיעים ברשימת ההתקנים.
- פתח את PuTTY בשולחן העבודה והגדר קובץ יומן עבור כל ערוץ של ה- respirometer כמתואר להלן.
הערה: PuTTY הוא לקוח מעטפת מאובטחת ו- Telnet ללא תשלום המשמש להעברת נתונים למחשב באמצעות יציאות COM.- בחר יציאת COM עבור בקר על-ידי הקלדת מספר היציאה בתיבה "קו טורי" (איור 2A).
- לחץ על Logging.
- בחר פלט להדפסה ב"רישום הפעלות" (איור 2B).
- תחת שם קובץ יומן רישום, לחץ על עיון.
- בתיקייה של הבחירה, צור שם קובץ המכיל מידע תיאורי (לדוגמה, תאריך, מין, מספר יציאת COM).
- לחץ על שמור.
- לחץ על פתח. ייפתח חלון המציג רישום נתונים המופרדים באמצעות פסיקים (איור 2C).
- חזור על הפעולה עבור כל הבקרים האחרים הנמצאים בשימוש עבור הניסוי. הקלט לכל יציאת COM יופיע כחלון נפרד (איור 2D).
4. הרצת ניסויים
- לאחר שהתאים התאזן למשך 30 דקות, אטמו אותם על ידי סגירת סטופקוקים.
- כסו את האמבטיה והתאים בקופסת קצף פוליסטירן כדי לשמור על סביבה יציבה.
- אפשר לאזן עוד שעה.
- הפעל את הזרם לגנרטור O2 של כל תא באמצעות המתג בתיבת הבקר.
- לאחר הפעלת הגנרטורים O2 , ודא שהלחץ עולה ללחץ OFF מוגדר מראש.
הערה: 1017 hPa, שהוא מעט מעל הלחץ האטמוספרי, שימש כלחץ "OFF" בסדרת ניסויים זו. חזרה ללחץ הסביבה תצביע על דליפה של גז מהתאים. יתר על כן, הוא מאפשר להשתמש באותו לחץ על פני ניסויים ללא קשר ללחץ ברומטרי הסביבה. לחץ "ON" היה 1016 hPa, כלומר הלחץ היה צריך לרדת רק 1 hPa לפני שהגנרטור O2 הופעל. זה סיפק רגישות מספקת למדידת צריכת O2 בדרוזופילה. ברגע שתא נלחץ להגדרת "OFF", הזרם אמור לרדת לאפס. - תן לניסוי לרוץ במשך 3 שעות או יותר.
הערה: VO2 גבוה יותר בטמפרטורות גבוהות יכול לאפשר זמני ניסוי קצרים יותר. יש לפקח מדי פעם כדי לוודא שהציוד מתפקד, אך להימנע מפעילות מוגזמת בקרבת התאים שעלולה להשפיע על יציבות הטמפרטורה.
5. ניסוי גמר
- כבה גנרטורים O2 בכל הבקרים.
הערה: בצע תחילה כדי להימנע מהפעלת גנרטורים O2 כאשר התאים פתוחים. - פתח את הסטופקוק כדי לפתוח את החדרים.
- השאירו את חלונות PuTTY פתוחים למשך 5-15 דקות נוספות כדי לספק קו בסיס סופי.
- סגור את חלון PuTTY עבור כל בקר, סיום הקלטות.
הערה: כל הניסויים הסתיימו בין 16:50 ל-17:10. - נתק חיישנים מכבלים.
- העבירו את התאים למתלה יבש.
- הסר את תקעי החיישנים אחד בכל פעם מהחדרים.
- נתק את הגנרטורים O2 והנח אותם במדף הצינורות.
- נגבו את השומן מתקע החיישן והשאירו אותו בארון התקשורת.
- נקו שומן ממפרקי התא והסירו צינורות עם זבובים וסודה ליים.
- מרדימים זבובים בכל צינור עםCO2, מקישים על סירת משקולות ושוקלים על מיקרו-איזון.
- רשום את המשקל ומספר הזבובים עבור כל צינור.
- השליכו זבובים או הניחו אותם בצד להליכים נוספים.
- יש להשליך סודה ליים מהמחסניות למיכל הפסולת.
- פתח את הגנרטור O2 והשלך את פתרון CuSO4 למיכל הפסולת.
- יש לשטוף אלקטרודות וצינורית במים מטוהרים.
- הניחו את מתלי הצינור לייבוש.
6. ניתוח נתוני העברת חיובים
- יבא נתונים כטקסט מופרד באמצעות פסיקים לגיליון אלקטרוני, כאשר כל רשומה מהווה גליון עבודה נפרד.
- רשום את נתוני הזרם והזמן עבור כל פעימה של מחולל O2 . החל מהפעימה הראשונה לאחר הפעלת לחץ על התא, רשום את שעת ההתחלה ושעת הסיום (כמספרי שורות) של כל פעימת זרם. זהו מספר השורה כאשר הזרם עולה מעל אפס (בדרך כלל לכ- 45-50 mA) לשורה האחרונה שהיא מעל אפס.
- צור טבלה בגליון העבודה כדי לתעד את הנתונים הבאים:
- משרעת הזרם הממוצעת במהלך הדופק: = AVERAGE([שורה ראשונה של פולס]:[שורה אחרונה של פולס]) עבור כל פולס (מהעמודה הנוכחית).
- משך פעימה: ([שורה אחרונה של דופק] - [שורה ראשונה של פולס[-שורה אחת]])/1000 עבור כל פולס (מהזמן בעמודה אלפיות השנייה).
- זמן ניסוי כולל: [זמן בתחילת הפעימה האחרונה] - [זמן בסוף הפעימה הראשונה לאחר לחץ התא] (מטור הזמן בדקות).
- לאחר מכן חשב העברת מטען (Q) עבור כל פעימה (משך זרם X ממוצע)
- סכם את החיוב מכל הפעימות כדי לחשב את החיוב הכולל (Qtot).
7. ניתוח של צריכת O2
- הגדר גיליון אלקטרוני חדש עבור כל הנתונים והזן או חשב את הפרטים הבאים עבור כל תא:
- Qtot (חיוב כולל)
- שומות (= Q ÷ 96485 × 4)
- מ"ל O2 (= שומות × 22413 מ"ל/מול)
- סה"כ זמן (מתוך ניתוח הנתונים לעיל)
- mL min-1 (= ml O2 ÷ זמן כולל)
- משקל בגרמים (זבובים מורדמים ונשקלים שנמדדו לאחר הניסוי)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ משקל בגרמים)
- mL/h/g (הנ"ל × 60)
- מ"ג/זבוב (= משקל הזבובים ÷ מספר הזבובים)
- μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ מספר הזבובים).
- טבול נתונים עבור כל טיפול (גנוטיפ, למשל)
- השווה טיפולים באמצעות ANOVA, t-test או Mann-Whitney u-test 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הלחץ ותפוקות הזרם של בקר הרספירומטר מוצגים עבור תא אחד בניסוי אחד באיור 3A. פעימת הזרם הארוך הראשונה לחצה על התא מלחץ הסביבה (כ-992 hPa) לסף OFF שנקבע מראש של 1017 hPa. כאשר הזבובים שצרכו O 2 ו-CO 2 נספגו, הלחץ ירד לאט עד שהגיע לסף ON של 1016 hPa, אשר הפעיל זרם דרך מחולל O2. בדוגמה המוצגת, המשרעת הממוצעת של כל פעימה היא 50.1 mA, משך הזמן הוא 16.1 שניות, מה שמניב העברת מטען של כ-0.81 קולומבים (C) לכל פולס. העברת המטען הכוללת עבור תא זה הייתה 3.28 צלזיוס על פני זמן כולל של 240.0 דקות. באמצעות החישובים המתוארים בנהלים עם המסה ומספר הזבובים (23 זבובים במשקל כולל של 14.9 מ"ג), צריכת O 2 עבור הקבוצה בחדר זה הייתה 3.19 מ"ל h-1 g-1 או 2.07 μL h-1 fly-1.
ניתן להתקין את הציוד בקלות, עם מינימום הדרכה, וביצועים אמינים עבור מחזורים רבים של הרכבה וכיבוי. עם זאת, יש לתחזק ולבדוק את הציוד באופן קבוע, ולשלוט היטב בתנאי הניסוי. לדוגמה, אובדן של אטם אטום לגז, כתוצאה מכשל של מפרק או סטופק, יכול להוביל למחזורי לחץ מהירים ול-VO2 גבוה באופן מזויף (איור 3B). בנוסף, הטמפרטורה והלחות חייבות להישאר יציבות בתוך התא. אם הטמפרטורה או הלחות יורדות, ירידת הלחץ המתקבלת תתפרש בטעות כ-O2 נצרך. לעומת זאת, סחף כלפי מעלה בטמפרטורה או בלחות ינטרל את ירידת הלחץ הנגרמת על-ידי צריכת O2 , ויפחית או יבטל באופן מלאכותי את אותV O2 (איור 3C).
השיטה שימשה לבדיקת VO2 של מוטציות CASKΔ18, שנוצרו על ידי כריתה לא מדויקת של אלמנט טרנספוזי ממוקד CASK 14, ושבו התנועה מופחתת באופן דרסטי14,16. בבקרות מסוג פראי w(ex33), שנוצרו על ידי כריתה מדויקת של היסוד הניתן לטרנספוזיה, צריכת O2 הממוצעת הספציפית למסה הייתה 3.65 ± 0.24 מ"ל·g-1·h-1 (n = 16 תאים; איור 4A).
למרות התנועה המופחתת שלהם באופן ניכר, VO2 של מוטציות CASKΔ18 היה מעט אך לא נמוך משמעותית מזה של קבוצת הביקורת (ממוצע ± s.e.m. = 3.23 ± 0.13 mL·g-1·h-1; n = 11 קבוצות; P = 0.08 מבחן U-Mann-Whitney).
מאחר שהתוקף של ביטוי קצב חילוף החומרים במונחים של מסת גוף הוטל בספק18, צריכת O2 נותחה גם על בסיס פר זבוב (איור 4B). באמצעות ניתוח זה, VO2 הופחת באופן משמעותי ב-CASKΔ18 בהשוואה לבקרות מסוג Wild (ex33: 2.22 ±-0.13 μL·fly-1·h-1; CASKΔ18: 1.58 ± 0.10 μL·fly-1·h-1; P = 0.0003, מבחן U-Mann-Whitney). עם זאת, המסה הממוצעת של זבובי CASKΔ18 הייתה נמוכה ב>20% מזו של קבוצת הביקורת ex33 (איור 4C; ex33 0.61 ± 0.01 מ"ג; CASKΔ18 0.51± 0.02 מ"ג; P = 0.0005, Mann-Whitney u-test), כך שההבדל בקצב חילוף החומרים בין גנוטיפים נובע כנראה מההבדל בגודלם.
איור 1: הגדרת רספירומטר . (A) דיאגרמה של תקע חיישן (למעלה) ותא של 50 מ"ל (המורכב מצינור Schlenk של 50 מ"ל, להלן) לפני ההרכבה. שימו לב למיקומם של חיבורי זכוכית טחונים 19/22 שיחברו את התא ואת תקע החיישן, ושיש לנקות לפני כל ניסוי. סטופרקוק, אשר הכרחי לפתיחה או אטימה של החדר, מצוין גם. (B) תרשים של תא ורכיבים, שהורכבו ומוכנים לניסוי, וראו: גליל כותנה רטוב, צינור פוליפרופילן המכיל זבובים, מחובר לפקק כותנה, מחסנית סודה-ליים וגנרטור O2 מלא ב-CuSO4. (ג) תצלום החדר המורכב. מהדק הקק המאבטח את התקע לתא מוסתר חלקית על ידי מהדק מעמד הטבעת המחזיק את התא. (D) צילום של בקר המציג מתג השולט בזרם דרך מחולל O2 וחלון לצפייה בתצוגת OLED. (ה) תאים מורכבים באמבט מים. שבעה תאים מוצגים, כאשר שלושה מכילים מוטנטים, שלושה עם בקרות מסוג בר, ותא אחד מכיל את כל המרכיבים למעט זבובים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת רכישת נתונים. (A) ממשק PuTTY לבחירת היציאה הטורית לרכישת נתונים. COM3 נבחר, עם קצב BAUD של 9600 כדי להתאים לפלט של הבקר. (B) ממשק PuTTY להגדרת קובץ יומן. "פלט להדפסה" נבחר כדי לאפשר רישום נתונים לקובץ טקסט, תיקיית נתונים נבחרת באמצעות כפתור "עיון" ונוצר שם קובץ. (C) קובץ יומן PuTTY במהלך ניסוי. הנתונים מתקבלים בערך פעמיים בשנייה, וכל שורה מכילה את המידע המופרד בפסיקים הבאים: מספר חיישן, זמן (ms) מאז תחילת הרכישה, טמפרטורת החדר (°C), לחץ תא (hPa), לחות (אחוז יחסי) וזרם (mA). (D) רישום נתונים במהלך ניסוי טיפוסי, עם שבעה חלונות לתאי ניסוי, בתוספת ערוץ אחד המתעד את טמפרטורת האמבטיה, טמפרטורת האוויר בסביבה, לחץ ולחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נתונים ממיקרו-רספירומטר. (A) לחץ (קו אפור, ציר שמאלי) וזרם על פני מחולל O2 (קו שחור, ציר ימני) בתא ספירומטר יחיד המכיל 23 w(ex33) זבובים. בהתחלה, נדרש פולס זרם ארוך כדי ללחוץ על התא מ ~ 992 hPa לסף OFF של 1017 hPa. כאשר הזבובים צרכו את O 2, הלחץ ירד עד שהגיע לסף ON של 1016 hPa, אשר הפעיל זרם דרך מחולל O2, אשר לחץ מחדש את התא ל 1017 hPa. התהליך חזר על עצמו שש פעמים בניסוי זה. (B) דוגמה לתא דולף שנגרם על ידי סטופרקוק פגום, שנלקחה מסדרת ניסויים אחרת. התא לא הצליח לשמור על לחץ (קו אפור), וכתוצאה מכך נוצר מחזור קבוע של זרם אלקטרוליטי (קו שחור). שים לב לציר זמן שונה מלוח A. (C) השפעת סחף בלחות. צריכת O2 על-ידי חיפושית גברת במינון 20 מ"ג (Hippodamia convergens) בתא הייתה אמורה לייצר דפוס מחזורי של לחץ בדומה לאיור 3A, אולם העלייה המתמדת בלחות (קו שחור) גרמה לעלייה מלאכותית בלחץ התא (קו אפור) שהסתירה את VO2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נתונים כמותיים ממוטציה מסוג בר ומוטציה מסוג CASK D. melanogaster. (A) VO2 ספציפי למסה עבור זבובי בר (w(ex33)) ומוטנטים (CASKΔ18). בכל החלקות, תחתיות וראשי תיבות מציינים רביעון ראשון ושלישי, בהתאמה, שפם מציין ערכים קיצוניים, וגדלי המדגם (מספר תאים, שכל אחד מהם מכיל 17-24 זבובים) ניתנים בסוגריים מעל הגנוטיפים. זבובי CASK Δ18 אינם שונים באופן מובהק סטטיסטית מ- ex33 (חציון: ex33: 3.420 mL·g-1·h-1, CASKΔ18 : 3.029 mL·g-1·h-1; p = 0.08 Mann-Whitney u-test). (B) VO2 ספציפי לזבוב. זבובי CASKΔ18צרכו הרבה פחות O 2 (חציון 1.650 מ"ל·זבוב-1·h-1) מאשר w(ex33) (2.078 מ"ל·זבוב-1·h-1; p = 0.0003, מבחן U-Mann-Whitney; מובהקות מסומנת בכוכביות). (C) המסה הייתה שונה בין CASKΔ18 לבין סוג הבר (חציון: 0.526 מ"ג, ex33: 0.623 מ"ג; p = 0.0005, מבחן U-Mann-Whitney; מובהקות מסומנת בכוכביות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1. סקר נתוני ספירומטריה של דרוזופילה מזבובי בר ב 25 מעלות צלזיוס. למעטחריג אחד 18, המחקרים מוגבלים לאלה המודדים את צריכת O2 . ברוב המקרים, היה צורך להעריך VO2 מתוך גרפים, ומספרים מספרים מן המסמכים המקוריים מסופקים. למרות שכל הגנוטיפים נחשבו ל"טיפוס פראי", המקורות ושיטות הריבוי היו מגוונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך לעיל מדגים מדידה של צריכת O2 ב- D. Melanogaster באמצעות מיקרו-רספירומטר קולומטרי אלקטרוני. הנתונים שהתקבלו עבור צריכת O2 במלנוגסטר מסוג D פראי היו בטווח שתואר ברוב הפרסומים הקודמים בשיטות מגוונות (טבלה 1), אם כי נמוכים במקצת מאלה שדווחו על ידי אחרים 3,6.
צעדים קריטיים התייחסו לשתי הדרישות המוחלטות של השיטה: איטום אטום לגז ויציבות סביבתית. שמירה על סביבה אטומה לגז היא פשוטה אך דורשת טיפול. צלוחיות וצינורות שלנק מתאימים באופן אידיאלי כתאי רספירומטריה. בניית זכוכית מונעת חדירות גז הקיימת בסוגים רבים של פלסטיק19, שהיא קריטית במיוחד בניסויים ממושכים. המפרקים הסטנדרטיים מאפשרים חיבורים אטומים לגז עם התקעים המכילים את החיישנים והחיבורים האלקטרוניים. סטופקוקים מספקים אטמים אמינים וניתן לפתוח או לסגור אותם לפי הצורך במהלך ניסויים. כדי להבטיח אטמים אטומים לגזים לכל ניסוי, נבדקו סטופקוקים, המפרקים נוקו ביסודיות, הושמו כמויות מושכלות של שומן סיליקון נקי, והמפרקים אובטחו באמצעות מהדקים של Keck.
רגישות השיטה מוגבלת על ידי יציבות הטמפרטורה והלחות בתוך החדר. שינויים בכל אחד מהפרמטרים יגרמו לתנודות לחץ המפריעות לאות VO2 . שימוש בתא סביבתי12 או אמבט מים במחזור מספק בקרת טמפרטורה יציבה יותר. עבודות קודמות של אחרים הוכיחו כי השיטה יכולה למדוד צריכת O2 ברמת nmol·h-1 כאשר הטמפרטורה נשמרה בתוך ±0.01 ° C20. כדי לייצב את הלחות, חתיכות של גליל כותנה טבול במים שמרו על לחות של כמעט 100%. הטמפרטורה והלחות הורשו להתייצב למשך 90 דקות לפחות לפני שהתאים עברו לחץ עם O2 שנוצר אלקטרוליטית וההקלטות החלו. כל הניסויים כללו תא אחד שהורכב מכל המרכיבים אך לא הכיל זבובים, כדי לנטר את תנאי הסביבה.
ניטור מתמיד של הטמפרטורה, הלחץ והלחות באופן קבוע מפשט מאוד את פתרון הבעיות. לדוגמה, ניתן היה לזהות ולתקן את ה-V O2 הנראה גבוה באופן מלאכותי שנגרם על-ידי סטופקוק פגום (איור 3B) או אובדן לכאורה של VO2 עקב לחות לא יציבה בתא (איור 3C).
למיקרו-רספירומטר הקולומטרי המתואר כאן יש מספר יתרונות. ראשית, הוא זול יחסית, עם עלות כוללת משוערת של 100 דולר לערוץ (הכולל תא, חיישן ובקר). שנית, מכיוון שכל ערוץ רוכש ומשדר נתונים באופן עצמאי, המערכת ניתנת להרחבה, כאשר מספר התאים מוגבל רק על ידי גודל הבקר הסביבתי (אמבט מים או תא סביבתי) ומספר יציאות ה- USB הזמינות במחשב (בדרך כלל ניתן להרחבה ל- >100). כמו כן, מכיוון שהתאים והבקרים עצמאיים, כישלון של כל אחד מהם לא ישפיע על האחרים. שלישית, ניתן לתכנת מחדש את הבקרים בקלות כך שיתאימו ללחץ הסביבה או יתאימו את הרגישות לפי הצורך. בהקשר זה, הלחץ בתוך התאים מוגדר לערך קבוע, כך שהלחץ הניסיוני יהיה קבוע על פני ניסויים ללא קשר ללחץ הברומטרי הסביבתי. רביעית, זרם קבוע של נתונים לגבי זמן, טמפרטורה, לחץ, לחות וזרם מאפשר ניתוח מפורט של פרמטרים אלה עבור כל חדר, ומקל על פתרון בעיות או ניתוח של שינויים זמניים ב- VO2 בניסויים ארוכים יותר. לבסוף, התנאים הסביבתיים בתוך החדר יכולים להישמר ברמה קבועה במשך שעות או ימים רבים, כי נצרך O2 מוחלף ללא הרף. במחקר הנוכחי, לחץ התא נע בין 1016 ל 1017 hPa, שהוא פחות מ -0.1%, כאשר השונות המתקבלת ב- PO2 הייתה פחות מ -0.5%. בהתבסס על כמות CuSO4 בכל מחולל O 2, אשר יכול לייצר 28 מ"ל של O2, ואת הממוצע VO2 של קבוצות זבובים במחקר זה, 1.15 מ"ל ליום (ממוצע = 21.8 זבובים לכל חדר), קצב חילוף החומרים ניתן ללמוד עד 24 ימים בכל פעם. בהנחה שהזבובים מקבלים תזונה נאותה, משמעות הדבר היא שניתן לחקור את חילוף החומרים ברציפות במשך רוב תוחלת החיים של הזבוב.
כיום, רוב המחקרים על מטבוליזם ב D. melanogaster מבוססים על ניתוח גז או מנומטריה. לשיטות המסתמכות על ניתוח גזים, כגון ספיקת עצירה וספירומטרים של זרימה רציפה 2,3,6 יש יתרון בכך שהשיטה מבוססת היטב והציוד זמין מסחרית. עם זאת, הם דורשים ציוד יקר ומורכב, כולל סעפות וחיישני זרימה מולקולריים כדי לווסת את הזרימה, ומנתחי גז למדידת ריכוזי גזים. לחלופין, מנומטרים פשוטים9 הם הרבה פחות יקרים. בצורה הפשוטה ביותר, הנפוצה בשימוש עבור D. melanogaster, הזבובים מורדמים וממוקמים בתא קטן המכיל חומר סופג CO2 ואשר מחובר למאגר נוזלים על ידי צינור נימי. כאשר O 2 נצרך, וכתוצאה מכך CO2 נספג, הלחץ יורד בתא, אשר שואב נוזל לתוך צינור נימים. גובה הנוזל הוא אז פרופורציונלי לכמות O2 הנצרכת. מכיוון ש-O2 הנצרך אינו מוחלף במהלך הניסוי, PO2 יורד ברציפות במהלך הניסוי. למרות שניסויים שגרתיים עשויים שלא להפחית את P O2 במידה מספקת כדי להשפיע לרעה על V O2, ניסויים ממושכים או ניסויים בטמפרטורות גבוהות עלולים לרוקן את O2 ולהגיע ל-P O2 הקריטי שבו V O2 יורד בחדות3. בעיה נוספת היא שמשקל הנוזל בנימים מפעיל כוח כלפי מטה, ומקטין את גובה הנוזל ביחס לכוח היורד המופעל, וכתוצאה מכך טעויות אפשריות. שיטות לפצות על השפעה זו תוארו 4,21, אך הן מסורבלות ואינן בשימוש נרחב. השוואה ישירה של ניתוח גזים ומנומטריה הצביעה על כך ששתי השיטות הניבו תוצאות שונות באופן משמעותי, אך המחברים לא הצליחו לספק הסבר מניח את הדעת לאי-התאמה22.
למרות יתרונותיו, למיקרו-רספירומטר הקולומטרי יש גם מגבלות. ראשית, בניגוד לכמה מערכות ניתוח גז עצירה, הוא אינו זמין מסחרית. הרכיבים קלים לרכישה ולא התכנון ולא התכנות מסובכים, אך ייתכן שהמבנה מורכב יותר מהמערכות המנומטריות הפשוטות9. שנית, השגת נתונים מדויקים חייבת לכלול מחזורים מרובים של דור O2 , כך שכל ניסוי חייב להימשך מספר שעות. זה נכון גם לגבי ניסויים באמצעות מנומטריה. לבסוף, שוב כמו מנומטריה, הטמפרטורה והלחות בתוך החדרים חייבים להיות יציבים. עם זאת, המיקרו-רספירומטר הקולומטרי מציע דרך ביניים מבחינת עלות ומורכבות, הוא חזק ואמין לאחר הרכבתו, ומודד צריכת O2 במדויק.
הניסויים עם מוטציות CASKΔ18 הדגימו תוצאות שליליות (V O2 ספציפי למסה) וחיוביות (VO2 ספציפי לזבוב). אם הירידה של >50% בהליכה של מוטנטים מסוג CASKΔ18נבעה מפגיעה בחילוף החומרים, ניתן היה לחזות כי VO2 יופחת בשיעור דומה. עם זאת, השינוי בצריכת O2 ספציפי למסה היה צנוע (ירידה של 9.6% בחציון VO2), ולא מובהק סטטיסטית. תוצאה שלילית זו עולה בקנה אחד עם מוטציות CASKΔ18 בעלות חילוף חומרים תקין יחסית, כאשר הפנוטיפ ההתנהגותי נובע מירידה בדחף המוטורי. למרות שייתכן שהשיטה חסרה רגישות מספקת, ההפחתה של VO2 שנגרמה על ידי הבדל קטן יחסית בגודל (ירידה של 15.5% במסה החציונית) הייתה משמעותית ביותר.
הליכה קשורה להוצאה אנרגטית מוגברת משמעותית5,23, אז מדוע VO2 נורמלי יחסית במוטציות CASK? ייתכן שטיפוח יתר במוטציות CASK16 יכול לאזן את הירידה בהליכה, או שפנוטיפ ההליכה פחות בולט כאשר זבובים נבדקים בקבוצות בצינורות קטנים, אך השערות אלה ממתינות לאימות ניסיוני. עם זאת, אנו מסיקים כי למוטציות בלוקוס CASK אין השפעה חזקה וישירה על חילוף החומרים, וכי המיקרו-רספירומטר הקולומטרי הוא כלי יעיל לחקר חילוף החומרים ב-D. melanogaster.
מכיוון שמכשיר זה בנוי בקלות מרכיבים נפוצים, מודד צריכת O2 במדויק, הוא נייד מאוד, ניתן להשתמש בו בכל סביבה עם טמפרטורה יציבה, ונעשה בו שימוש עם אורגניזמים קטנים כמו 0.5 מ"ג זבובים (המחקר הנוכחי) וגדולים עד 500 מ"ג עקרבים (DJS טרם פורסם), הוא מוסיף כלי רב-תכליתי לחקר חילוף החומרים של אורגניזמים מגוונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר לינדה רסטיפו מאוניברסיטת אריזונה על שהציעה לבדוק את צריכת O2 של מוטציות CASK ועל שליחת מוטנטי CASK והבקרות הקונגניות שלהם. דמי הפרסום ניתנו על ידי הקרן המחלקתית להשקעה מחדש מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קולג' פארק. שטח וכמה ציוד סופקו על ידי האוניברסיטאות בשיידי גרוב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
