Summary
छोटे जीवों की चयापचय दर को मापने के लिए कोलोमेट्रिक श्वासरोमिति आदर्श है। जब वर्तमान अध्ययन में ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए अनुकूलित किया गया, तो मापा गया ओ2 खपत पिछले अध्ययनों द्वारा वाइल्डटाइप डी मेलानोगास्टर के लिए रिपोर्ट की गई सीमा के भीतर थी। कास्क उत्परिवर्ती द्वारा प्रति-फ्लाई ओ2 खपत, जो छोटे और कम सक्रिय हैं, वाइल्डटाइप की तुलना में काफी कम थे।
Abstract
एक स्थिर वातावरण को बनाए रखते हुए छोटे जीवों की ओ2 खपत को मापने के लिए कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमेट्री एक सीधी, सस्ती विधि है। एक कूलमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर में एक एयरटाइट कक्ष होता है जिसमें ओ 2 का सेवन किया जाता है और जीव द्वारा उत्पादित सीओ2 को एक शोषक माध्यम द्वारा हटा दिया जाता है। परिणामी दबाव में कमी इलेक्ट्रोलाइटिक ओ 2 उत्पादन को ट्रिगर करती है, और उत्पादित ओ2 की मात्रा को इसे उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चार्ज की मात्रा को रिकॉर्ड करके मापा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, विधि को छोटे समूहों में परीक्षण किए गए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें तंत्र की संवेदनशीलता और उच्च स्थिरता के लिए अनुकूलित पर्यावरणीय स्थितियां हैं। इस उपकरण में वाइल्डटाइप मक्खियों द्वारा खपत ओ2 की मात्रा पिछले अध्ययनों द्वारा मापी गई मात्रा के अनुरूप है। कास्क उत्परिवर्ती द्वारा द्रव्यमान-विशिष्ट ओ2 खपत, जो छोटे हैं और कम सक्रिय होने के लिए जाने जाते हैं, कॉन्जेनिक नियंत्रण से अलग नहीं थे। हालांकि, सीएएस्क उत्परिवर्ती के छोटे आकार के परिणामस्वरूप प्रति-फ्लाई आधार पर ओ2 खपत में उल्लेखनीय कमी आई। मेलानोगास्टर में ओ2 खपत को मापने में सक्षम माइक्रोरेस्पिरोमीटर है, जीनोटाइप के बीच मामूली अंतर को अलग कर सकता है, और चयापचय दर को मापने के लिए एक बहुमुखी उपकरण जोड़ता है।
Introduction
चयापचय दर को मापने की क्षमता अपने पर्यावरणीय संदर्भ में एक जीव की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, जीवनकाल1 में इसकी भूमिका, चयापचय2 में आहार की भूमिका, या हाइपोक्सिक तनाव3 के लिए दहलीज को समझने के लिए चयापचय दर को मापना आवश्यक है।
चयापचय दरको मापने के लिए दो सामान्य दृष्टिकोण हैं। प्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री गर्मी उत्पादन को मापकर सीधे ऊर्जा व्यय को मापता है। अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री अन्य साधनों के माध्यम से ऊर्जा उत्पादन को मापता है, अक्सर ओ 2 खपत (वीओ 2), सीओ2 उत्पादन या दोनों के श्वसनमीट्रिक माप के माध्यम से। यद्यपि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर5 सहित छोटे एक्टोथर्म पर प्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री लागू की गई है, श्वसनमिति तकनीकी रूप से सरल और अधिक सामान्य रूप से उपयोग की जाती है।
मेलानोगास्टर में चयापचय दर को मापने के लिए श्वसन के कई रूपों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और तापमान6, सामाजिक वातावरण 3, आहार3,7, और न्यूरोडेवलपमेंटलविकारों 8 के चयापचय प्रभावों में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। ये दो वर्गों में आते हैं, जो लागत और जटिलता में काफी भिन्न होते हैं। मैनोमेट्री सबसे सरल और कम से कम महंगा 9,10 है, जिसमें मक्खियों को एक सील कक्ष में रखा जाता है जिसमें सीओ 2 शोषक होता है और जो एक पतली केशिका के माध्यम से एक द्रव जलाशय से जुड़ा होता है। चूंकि ओ 2 का सेवन किया जाता है और सीओ2 अवशोषित होता है, कक्ष में दबाव कम हो जाता है और केशिका में तरल पदार्थ खींचा जाता है। केशिका का द्रव से भरा आयतन इसलिए वीओ 2 के आनुपातिक है। अधिक विस्तृत संस्करण, जो केशिका में तरल पदार्थ द्वारा लगाए गए बल की भरपाई करते हैं, का उपयोग डी मेलानोगास्टर1 पर भी किया गया है। मैनोमेट्री में सरल और सस्ती होने के फायदे हैं, लेकिन, क्योंकि यह दबाव के प्रति संवेदनशील है, निरंतर पर्यावरणीय परिस्थितियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, क्योंकि खपत ओ 2 को प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है, ओ 2 (पी ओ 2) का आंशिक दबाव धीरे-धीरे कक्षों के अंदर कम हो जाता है।
गैस विश्लेषण का उपयोग करके श्वसनमिति का उपयोग नियमित रूप से डी मेलानोगास्टर के लिए भी किया जाता है। इस मामले में, मक्खियों वाले सील कक्षों से नियमित अंतराल पर गैसों का नमूना लिया जाता है और इन्फ्रारेड विश्लेषक 2,6,11 को भेजा जाता है। इस प्रकार के उपकरण के फायदे हैं कि यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रति कम संवेदनशील है, और नमूने के दौरान गैसों को ताज़ा किया जाता है ताकि पीओ 2 स्थिर रहे। हालांकि, उपकरण संचालित करने के लिए महंगा और जटिल हो सकता है।
हाल ही में विकसित एक कूलमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर12 मौजूदा प्रणालियों के लिए एक सस्ता, संवेदनशील और स्थिर विकल्प प्रदान करता है। व्यवहार में, एक जीव को एक एयरटाइट कक्ष में रखा जाता है जहां वह ओ 2 का उपभोग करता है और उत्सर्जित सीओ2 को एक शोषक सामग्री द्वारा हटा दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कक्ष दबाव में शुद्ध कमी होती है। जब आंतरिक दबाव पूर्व-निर्धारित सीमा (ओएन-थ्रेशोल्ड) तक कम हो जाता है, तो विद्युत प्रवाह को इलेक्ट्रोलाइटिक ओ2 जनरेटर के माध्यम से पारित किया जाता है, जिससे इलेक्ट्रोलिसिस को रोकने वाली दूसरी सीमा (ऑफ-थ्रेशोल्ड) पर दबाव वापस आ जाता है। ओ 2 जनरेटर में चार्ज ट्रांसफर सीधे कक्ष को फिर से दबाव डालने के लिए आवश्यक ओ 2 की मात्रा के समानुपाती होता है और इसलिए इसका उपयोग जीव4 द्वारा खपत ओ 2 को मापने के लिए किया जा सकता है। विधि अत्यधिक संवेदनशील है, वी ओ 2 को सटीक रूप से मापता है, और ओ 2 का नियमित प्रतिस्थापन घंटों या दिनों के लिए लगभग स्थिर स्तर पर पीओ 2 को बनाए रख सकता है।
इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर एक बहु-मोडल (दबाव, तापमान और आर्द्रता) इलेक्ट्रॉनिक सेंसर को नियोजित करता है। सेंसर एक माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित होता है जो दबाव में छोटे बदलावों का पता लगाता है और कम दबाव सीमा12 तक पहुंचने पर ओ2 पीढ़ी को सक्रिय करता है। इस उपकरण को शेल्फ भागों से इकट्ठा किया जाता है, इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के कक्षों और प्रयोगात्मक वातावरण के साथ किया जा सकता है, और बीटल टेनेब्रियो मोलिटर पर शरीर द्रव्यमान और तापमान के प्रभावों की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, माइक्रोरेस्पिरोमीटर को डी मेलानोगास्टर में ओ2 खपत को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें टी मोलिटर के द्रव्यमान का लगभग 1% है। ओ2 पीढ़ी को सक्रिय करने के लिए सीमा को कम करके उपकरण की संवेदनशीलता में वृद्धि की गई है, और तापमान-नियंत्रित जल स्नान में प्रयोगों का संचालन करके और 100% या उसके आसपास कक्षों के अंदर आर्द्रता बनाए रखकर पर्यावरणीय स्थिरता को बढ़ाया गया है।
सीएएस्क (कैलमोडुलिन-निर्भर सेरीन प्रोटीन काइनेज) प्रोटीन, झिल्ली से जुड़े गुआनिलेट किनेसेस (एमएजीयूके) के परिवार का हिस्सा है, जो विभिन्न बहु-प्रोटीन परिसरों में एक आणविक मचान है, और सीएएस्क में उत्परिवर्तन मनुष्यों में न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों से जुड़े हैं। मेलानोगास्टर उत्परिवर्ती, सीएएके18, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 15 की गतिविधि को बाधित करता है और कॉन्जेनिक नियंत्रण14,16 की तुलना में गतिविधि के स्तर को 50% से अधिक कम कर देता है। सीएएस्क उत्परिवर्ती की कम गतिविधि के स्तर और चयापचय को विनियमित करने में कैटेकोलामाइन की भूमिका के कारणहमने अनुमान लगाया कि उनकी मानक चयापचय दर, और इसलिए ओ2 खपत, नियंत्रण की तुलना में नाटकीय रूप से कम हो जाएगी।
O2 की खपत को CASK18 और उनके वाइल्डटाइप कंजेनर्स, w(ex33) में मापा गया था। मक्खियों के समूहों को श्वास-कक्षों में रखा गया था, ओ 2 खपत को मापा गया था, ओ2 खपत की गणना की गई थी और द्रव्यमान-विशिष्ट और प्रति-फ्लाई आधार दोनों पर व्यक्त किया गया था। उपकरण ने वाइल्डटाइप मक्खियों में वी ओ 2 दर्ज किया जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप था, और यह वाइल्डटाइप और सीएएस्क उत्परिवर्ती मक्खियों की प्रति-फ्लाईओ 2 खपत के बीच अंतर कर सकता है।
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Protocol
1. मक्खी पालन और संग्रह
- मानक ड्रोसोफिला भोजन युक्त संकीर्ण शीशियों में मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
नोट: प्रत्येक जीनोटाइप के लिए नमूना आकार में कम से कम नौ प्रतिकृतियां शामिल होनी चाहिए, प्रत्येक में 15-25 मक्खियों वाले एकल श्वासयंत्र कक्ष शामिल हैं, जैसा कि नीचे वर्णित है। - मक्खियों को हर 2-3 दिनों में स्थानांतरित करें।
- सीओ2 के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें, प्रत्येक जीनोटाइप के 15-25 पुरुषों के समूहों को इकट्ठा करें, और प्रत्येक समूह को ताजा, बिना खमीर वाले भोजन की शीशियों में रखें।
नोट: प्रजनन स्थिति के कारण परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पुरुषों का उपयोग किया गया था। विधि दोनों लिंगों पर लागू होती है। - मक्खियों को कम से कम 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें।
नोट: प्रयोग के समय तक, मक्खियों को 1-4 दिन पुराना होना चाहिए। चरण 1.3 में वर्णित संग्रह की आवृत्ति को मक्खियों की आयु सीमा को संकीर्ण करने के लिए सेट किया जा सकता है।
2. श्वासयंत्र कक्ष की स्थापना और असेंबली
- पानी के स्नान को चालू करें और प्रयोग के लिए इसे वांछित तापमान पर सेट करें।
नोट: नीचे दिए गए प्रयोग 25 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल श्लेंक ट्यूबों का उपयोग करके कक्षों के रूप में आयोजित किए गए थे। घटकों को चित्र 1A, 1B और 1C में दिखाए अनुसार इकट्ठा किया जाना है। - प्रयोगशाला पोंछे पर 70% इथेनॉल छिड़ककर (सीधे जोड़ पर नहीं) और सेंसर प्लग से धूल और पुराने तेल को पोंछकर कक्षों और सेंसर प्लग के ग्राउंड ग्लास जोड़ों को अच्छी तरह से साफ करें (चित्रा 1 ए)। एक ताजा प्रयोगशाला पोंछे के साथ इथेनॉल को पोंछ दें।
- नमी को स्थिर करने के लिए शुद्ध पानी में भिगोए गए कपास रोल के 1 सेमी टुकड़े को कक्ष के तल में रखें।
- कपास रोल के तल पर एक छोटा पूल बनाने के लिए पर्याप्त पानी (~ 0.5 एमएल) जोड़ें।
- कक्ष के जोड़ पर फैले किसी भी पानी को पोंछ दें।
- मक्खियों को फ़नल का उपयोग करके लेबल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- ट्यूब को कॉटन रोल से प्लग करें।
नोट: ट्यूबों में 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन टेस्ट ट्यूब होती है, जिसे लंबाई में 5.5 सेमी तक ट्रिम किया जाता है और प्रयोगात्मक कक्ष के साथ हवा के मुक्त आदान-प्रदान की अनुमति देने के लिए गर्म चाकू के साथ छिद्रित किया जाता है। सीओ2 एनेस्थीसिया चयापचय संबंधी असामान्यताओं का कारण बनता है, इसलिए मक्खियों को संज्ञाहरण के बिना स्थानांतरित किया जाता है जिसे मक्खियों को खोने से बचने के लिए अधिक देखभाल की आवश्यकता होती है।
- ट्यूब को कॉटन रोल से प्लग करें।
- प्रत्येक श्वासयंत्र कक्ष (गीले कपास के शीर्ष पर) में मक्खियों के साथ एक हवादार ट्यूब जोड़ें।
- सोडा चूने के कारतूस (प्रति ट्यूब 4-5 छर्रों) भरें और उन्हें कक्ष के अंदर मक्खियों वाली ट्यूब के शीर्ष पर रखें।
नोट: सोडा लाइम कारतूस में 800 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब होते हैं जो पावर ड्रिल के साथ 4-5 बार छिद्रित होते हैं। - वेंट छेद के स्तर से नीचे संतृप्त तांबा सल्फेट (क्यूएसओ4) समाधान के साथ ओ2 जनरेटर भरें
नोट: ओ2 जनरेटर में स्क्रू-कैप सेंट्रीफ्यूज ट्यूब होते हैं जिनमें धागे के नीचे 4 छेद होते हैं। प्लैटिनम (पीटी) और कॉपर (सीयू) इलेक्ट्रोड को दो-पिन कनेक्टर में सोल्डकिया जाता है, कैप में ड्रिल किए गए छेदों में डाला जाता है, और एपॉक्सी के साथ चिपकाया जाता है। क्यूएसओ4 का इलेक्ट्रोलिसिस प्रयोगात्मक जीव द्वारा खपत ओ2 उत्पन्न करता है। क्यूएसओ4 अकशेरुकी जीवों के लिए विषाक्त है, फैलने या रिसाव से बचें और तुरंत साफ करें। - भरे हुए ओ2 जनरेटर को सेंसर प्लग पर दो-पिन कनेक्टर से कनेक्ट करें।
नोट: कॉपर कैथोड को नियंत्रक के नकारात्मक आउटपुट और प्लेटिनम एनोड को सकारात्मक तार से जोड़ना चाहिए। उलट कनेक्शन प्रयोग की विफलता का कारण बनेंगे। - सेंसर प्लग के ग्राउंड ग्लास जोड़ के विपरीत किनारों पर स्पष्ट सिलिकॉन ग्रीस के दो छोटे डाब रखें।
- प्लग को कक्ष में डालें और जोड़ में तेल फैलाने के लिए प्लग (या कक्ष) को मध्यम दबाव के साथ घुमाएं।
- प्रयोगशाला पोंछे के साथ अतिरिक्त तेल को पोंछ दें।
- कक्षों में प्लग को सुरक्षित करने के लिए जोड़ों पर प्लास्टिक केक क्लैंप को स्नैप करें। इकट्ठे कक्ष को चित्र 1 सी की तरह दिखना चाहिए।
- दिन के प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले कक्षों की संख्या के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
नोट: रिकॉर्ड किए जा सकने वाले कक्षों की संख्या कंप्यूटर के लिए उपलब्ध कक्षों, नियंत्रकों और यूएसबी इनपुट की संख्या से सीमित है। वर्तमान प्रयोगों के लिए, सात कक्ष सामान्य रूप से समानांतर में चलाए गए थे। उत्परिवर्ती जैसे प्रयोगात्मक मक्खियों को उचित नियंत्रणों के साथ मिलान किया जाना चाहिए। पर्यावरणीय भिन्नता के नियंत्रण के रूप में प्रत्येक प्रयोग में समान रूप से लेकिन मक्खियों के बिना स्थापित एक कक्ष को शामिल किया जाना चाहिए। विभिन्न उपचारों (उत्परिवर्ती, वाइल्डटाइप, नो-फ्लाई) वाले कक्षों को प्रयोगों के बीच घुमाया जाना चाहिए। - स्टॉपकॉक ्स के साथ पानी के स्नान में एक रैक में इकट्ठे कक्षों को रखें (चित्रा 1 ई)।
नोट: सर्कैडियन भिन्नता से बचने के लिए, यहां वर्णित सभी प्रयोगों के लिए 9:30 और 9:50 बजे के बीच स्नान में कक्ष रखे गए थे। - स्टॉपकॉक को खुला छोड़ दें (हैंडल को स्टॉपकॉक के समानांतर रखें)।
नोट: सावधान रहें कि पानी को स्टॉपकॉक में प्रवेश न करने दें। - कक्षों को लगभग 30 मिनट के लिए खुले स्टॉपकॉक के साथ समानता करने की अनुमति दें।
नोट: जबकि कक्ष समतुल्य है, इलेक्ट्रॉनिक्स को कनेक्ट करें और नीचे वर्णित डेटा अधिग्रहण सेट करें।
3. नियंत्रकों और कंप्यूटर की स्थापना
- सुनिश्चित करें कि ओ2 जनरेटर को करंट की आपूर्ति करने वाले स्विच ऑफ स्थिति में हैं (कनेक्टर से दूर; चित्रा 1 डी)।
- प्रत्येक नियंत्रक बॉक्स को उपलब्ध यूनिवर्सल सीरियल बस (USB) पोर्ट में प्लग करें।
नोट: नियंत्रक इकाइयों का निर्माण और प्रोग्रामिंग कहीं और वर्णित12. - 6-कंडक्टर केबलों का उपयोग करके नियंत्रकों को श्वासयंत्र कक्षों से कनेक्ट करें।
- जाँचें कि नियंत्रकों के कार्बनिक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (OLED) डिस्प्ले (चित्रा 1 D) पर्यावरणीय पैरामीटर प्रदर्शित कर रहे हैं।
- नियंत्रक पर स्विच का उपयोग करके ओ2 जनरेटर को संक्षेप में चालू करें (चित्रा 1 डी)।
- यदि वर्तमान मान शून्य से 35 और 55 एमए के बीच बढ़ता है, तो नियंत्रक और कक्ष प्रयोगों के लिए तैयार हैं।
- निर्धारित करें कि नियंत्रकों द्वारा कौन से COM पोर्ट का उपयोग किया जा रहा है, जैसा कि नीचे वर्णित है।
- Microsoft Windows में प्रारंभ चिह्न क्लिक करें।
- सेटिंग्स चिह्न क्लिक करें।
- ब्लूटूथ और डिवाइस क्लिक करें.
- सुनिश्चित करें कि नियंत्रक और उनके COM पोर्ट डिवाइस की सूची में दिखाई दें।
- डेस्कटॉप पर PuTTY खोलें और नीचे वर्णित के रूप में श्वसनयंत्र के प्रत्येक चैनल के लिए एक लॉग फ़ाइल सेट करें।
नोट: PuTTY एक नि: शुल्क सुरक्षित शेल और टेलनेट क्लाइंट है जिसका उपयोग COM पोर्ट के माध्यम से कंप्यूटर पर डेटा स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है।- "सीरियल लाइन" बॉक्स (चित्रा 2 ए) में पोर्ट की संख्या टाइप करके नियंत्रक के लिए COM पोर्ट का चयन करें।
- लॉगिंग पर क्लिक करें।
- "सत्र लॉगिंग" (चित्रा 2 बी) में मुद्रण योग्य आउटपुट का चयन करें।
- लॉग फ़ाइल नाम के अंतर्गत, ब्राउज़ क्लिक करें.
- पसंद के फ़ोल्डर में, वर्णनात्मक जानकारी (जैसे, दिनांक, प्रजाति, COM पोर्ट नंबर) युक्त एक फ़ाइल नाम बनाएँ।
- सहेजें पर क्लिक करें.
- खोलें पर क्लिक करें. एक विंडो खुलेगी जिसमें अल्पविराम-सीमांकित डेटा लॉग किया जा रहा है (चित्रा 2 सी)।
- प्रयोग के लिए उपयोग में अन्य सभी नियंत्रकों के लिए दोहराएं। प्रत्येक COM पोर्ट के लिए इनपुट एक अलग विंडो (चित्रा 2 D) के रूप में दिखाई देगा।
4. चल रहे प्रयोग
- एक बार जब कक्ष 30 मिनट के लिए बराबर हो जाते हैं, तो स्टॉपकॉक को बंद करके उन्हें सील करें।
- एक स्थिर वातावरण बनाए रखने के लिए पॉलीस्टाइनिन फोम बॉक्स के साथ स्नान और कक्षों को कवर करें।
- एक और घंटे के लिए संतुलन बनाने की अनुमति दें।
- नियंत्रक बॉक्स पर स्विच का उपयोग करके प्रत्येक कक्ष के ओ2 जनरेटर में करंट चालू करें।
- एक बार ओ2 जनरेटर सक्रिय हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि दबाव पूर्व-निर्धारित दबाव तक बढ़ जाता है।
नोट: 1017 एचपीए, जो वायुमंडलीय दबाव से थोड़ा ऊपर है, प्रयोगों की इस श्रृंखला में "ऑफ" दबाव के रूप में उपयोग किया गया था। परिवेश के दबाव में लौटने से कक्षों से गैस के रिसाव का संकेत मिलेगा। इसके अलावा, यह परिवेश बैरोमेट्रिक दबाव की परवाह किए बिना प्रयोगों में एक ही दबाव का उपयोग करने की अनुमति देता है। "ऑन" दबाव 1016 एचपीए था, जिसका अर्थ है कि ओ2 जनरेटर सक्रिय होने से पहले दबाव को केवल 1 एचपीए छोड़ने की आवश्यकता थी। इसने ड्रोसोफिला में ओ2 खपत को मापने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान की। एक बार जब एक कक्ष को "ऑफ" सेटिंग के लिए दबाव डाला जाता है, तो वर्तमान शून्य तक गिर जाना चाहिए। - प्रयोग को 3 या अधिक घंटे तक चलने दें।
नोट: ऊंचे तापमान पर उच्च वीओ 2 कम प्रयोग समय की अनुमति दे सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कभी-कभी निगरानी करें कि उपकरण काम कर रहे हैं लेकिन कक्षों के पास अत्यधिक गतिविधि से बचें जो तापमान स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं।
5. परिष्करण प्रयोग
- सभी नियंत्रकों परO2 जनरेटर बंद करें।
नोट: कक्ष खुले होने पर ओ2 जनरेटर चलाने से बचने के लिए पहले करें। - कक्षों को खोलने के लिए स्टॉपकॉक खोलें।
- अंतिम आधार रेखा प्रदान करने के लिए पुट्टी खिड़कियों को एक और 5-15 मिनट के लिए खुला छोड़ दें।
- रिकॉर्डिंग समाप्त करते हुए, प्रत्येक नियंत्रक के लिए PuTTY विंडो बंद करें।
नोट: सभी प्रयोग 4:50 और 5:10 बजे के बीच समाप्त हुए। - केबल से सेंसर डिस्कनेक्ट करें।
- कक्षों को सूखे रैक में ले जाएं।
- कक्षों से एक बार में सेंसर प्लग को हटा दें।
- ओ2 जनरेटर को डिस्कनेक्ट करें और उन्हें ट्यूब रैक में रखें।
- सेंसर प्लग से ग्रीस पोंछें और इसे रैक में रखें।
- कक्ष जोड़ों से तेल साफ करें और मक्खियों और सोडा चूने के साथ ट्यूबों को हटा दें।
- सीओ 2 के साथ प्रत्येक ट्यूब में मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें, एक वजन नाव पर टैप करें और एक माइक्रोबैलेंस पर वजन करें।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए मक्खियों का वजन और संख्या लॉग करें।
- मक्खियों को छोड़ दें या उन्हें अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए अलग रखें।
- कचरे के कंटेनर में कारतूस से सोडा चूना डंप करें।
- ओ2 जनरेटर खोलें और अपशिष्ट कंटेनर में CuSO4 समाधान को छोड़ दें।
- शुद्ध पानी के साथ इलेक्ट्रोड और ट्यूब को धो लें।
- ट्यूब रैक को सुखाने के लिए रखें।
6. चार्ज ट्रांसफर डेटा का विश्लेषण
- डेटा को स्प्रेडशीट में अल्पविराम-सीमांकित पाठ के रूप में आयात करें, जिसमें प्रत्येक रिकॉर्ड में एक अलग कार्यपत्रक शामिल हो.
- ओ2 जनरेटर के प्रत्येक पल्स के लिए वर्तमान और समय डेटा रिकॉर्ड करें। कक्ष पर दबाव पड़ने के बाद पहली पल्स से शुरू करते हुए, प्रत्येक वर्तमान पल्स के प्रारंभ समय और समाप्ति समय (पंक्ति संख्या के रूप में) रिकॉर्ड करें। यह पंक्ति संख्या है जब धारा शून्य से ऊपर जाती है (आमतौर पर लगभग 45-50 mA तक) अंतिम पंक्ति में जो शून्य से ऊपर होती है।
- निम्न डेटा रिकॉर्ड करने के लिए कार्यपत्रक पर कोई तालिका बनाएँ:
- पल्स के दौरान औसत वर्तमान आयाम: = औसत ([पल्स की पहली पंक्ति]:[पल्स की अंतिम पंक्ति]) प्रत्येक पल्स के लिए (वर्तमान कॉलम से)।
- पल्स अवधि: ([पल्स की अंतिम पंक्ति] - [पल्स की पहली पंक्ति[-एक पंक्ति]])/प्रत्येक पल्स के लिए 1000 (मिलीसेकंड कॉलम में समय से)।
- कुल प्रयोग समय: [अंतिम पल्स की शुरुआत में समय] - [कक्ष दबाव के बाद पहली पल्स के अंत में समय] (मिनट कॉलम में समय से)।
- फिर प्रत्येक पल्स (औसत वर्तमान एक्स अवधि) के लिए चार्ज ट्रांसफर (क्यू) की गणना करें।
- कुल प्रभार (Qtot) की गणना करने के लिए सभी दालों से प्रभार का योग करें।
7. ओ2 खपत का विश्लेषण
- सभी डेटा के लिए एक नई स्प्रेडशीट सेट करें और प्रत्येक कक्ष के लिए निम्नलिखित दर्ज करें या गणना करें:
- Qtot (कुल प्रभार)
- मोल्स (= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= मोल्स × 22413 mL/mol)
- कुल समय (ऊपर दिए गए डेटा विश्लेषण से)
- mL min-1 (= ml O2 कुल समय ÷)
- ग्राम में वजन (प्रयोग के बाद मक्खियों को एनेस्थेटाइज्ड और मापा गया)
- एमएल मिन -1 जी -1 (= एमएल मिन -1 ग्राम में वजन ÷ है)
- mL/h/g (उपरोक्त × 60)
- mg/Fly (= मक्खियों का वजन ÷ मक्खियों की संख्या)
- μL फ्लाई-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ मक्खियों की संख्या)।
- प्रत्येक उपचार के लिए डेटा को सारणीबद्ध करें (जीनोटाइप, उदा।
- एनोवा, टी-टेस्ट, या मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट 13 का उपयोग करके उपचार की तुलना करें।
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Representative Results
श्वासयंत्रक नियंत्रक के दबाव और वर्तमान आउटपुट को चित्र 3 ए में एक प्रयोग में एक कक्ष के लिए दिखाया गया है। पहली, लंबी वर्तमान पल्स ने कक्ष को परिवेश के दबाव (लगभग 992 एचपीए) से 1017 एचपीए की पूर्व-निर्धारित ऑफ सीमा तक दबाव डाला। चूंकि मक्खियों ने ओ 2 का सेवन किया और सीओ 2 को अवशोषित किया गया, दबाव धीरे-धीरे कम हो गया जब तक कि यह 1016 एचपीए की ओएन सीमा तक नहीं पहुंच गया, जिसने ओ2 जनरेटर के माध्यम से प्रवाह को सक्रिय किया। दिखाए गए उदाहरण में, प्रत्येक पल्स का औसत आयाम 50.1 एमए है, अवधि 16.1 एस है, जिससे प्रति पल्स लगभग 0.81 कूलम्ब (सी) का चार्ज ट्रांसफर होता है। इस कक्ष के लिए कुल चार्ज ट्रांसफर 240.0 मिनट के कुल समय में 3.28 सी था। मक्खियों के द्रव्यमान और संख्या (कुल 14.9 मिलीग्राम वजन वाली 23 मक्खियों) के साथ प्रक्रियाओं में वर्णित गणना का उपयोग करते हुए, इस कक्ष में समूह के लिए ओ 2 की खपत 3.19 एमएल एच -1 जी -1 या 2.07 μL एच -1 फ्लाई -1 थी।
उपकरण को न्यूनतम प्रशिक्षण के साथ आसानी से स्थापित किया जा सकता है, और असेंबली और शटडाउन के कई चक्रों के लिए मज़बूती से प्रदर्शन करता है। बहरहाल, उपकरणों को नियमित रूप से बनाए रखा जाना चाहिए और निरीक्षण किया जाना चाहिए, और प्रयोगात्मक स्थितियों को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक जोड़ या स्टॉपकॉक की विफलता के कारण गैसटाइट सील का नुकसान, तेजी से दबाव चक्र और नकली रूप से उच्च वीओ 2 (चित्रा 3 बी) का कारण बन सकता है। इसके अतिरिक्त, तापमान और आर्द्रता कक्ष के अंदर स्थिर रहना चाहिए। यदि तापमान या आर्द्रता कम हो जाती है, तो परिणामी दबाव गिरावट को गलती से ओ2 का सेवन करने के रूप में व्याख्या किया जाएगा। इसके विपरीत, तापमान या आर्द्रता में ऊपर की ओर बहाव ओ 2 खपत के कारण दबाव में कमी का मुकाबला करेगा, और कृत्रिम रूप से वीओ 2 सिग्नल को कम या समाप्त कर देगा (चित्रा 3 सी)।
इस विधि का उपयोग सीएएस्क 18 उत्परिवर्ती के वीओ 2 का परीक्षण करने के लिए किया गया था, जो सीएएस्क लोकस 14 से एक ट्रांसपोसेबल तत्व के गलत छांटने से उत्पन्न हुए थे, और जिसमें हरकत14,16 में काफी कम हो जाती है। जंगली-प्रकार के डब्ल्यू (एक्स 33) नियंत्रणों में, जो ट्रांसपोसेबल तत्व के सटीक छांटने से उत्पन्न होता है, औसत द्रव्यमान-विशिष्ट ओ2 खपत 3.65 ± 0.24 एमएल-जी-1.एच-1 (एन = 16 कक्ष; चित्रा 4 ए)।
उनकी स्पष्ट रूप से कम हरकत के बावजूद, CASK18 उत्परिवर्ती का VO2 थोड़ा लेकिन नियंत्रण की तुलना में काफी कम नहीं था (औसत ± s.e.m.= 3.23 ± 0.13 mL-g-1.h-1; n = 11 समूह; पी = 0.08 मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट)।
क्योंकि शरीर द्रव्यमान के संदर्भ में चयापचय दर को व्यक्त करने की वैधता पर सवाल उठाया गया है18, ओ2 खपत का विश्लेषण प्रति-फ्लाई आधार पर भी किया गया था (चित्रा 4 बी)। इस विश्लेषण का उपयोग करते हुए, जंगली प्रकार के नियंत्रणों की तुलना में कास्कत्रिभुज 18 में वी ओ 2 काफी कम हो गया था (उदा33:2.22 ± 0.13 μL.fly-1.h-1; CASKत्रिभुज 18: 1.58 ± 0.10 μL.fly-1.h-1; पी = 0.0003, मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट)। हालांकि, CASKत्रिभुज 18 मक्खियों का औसत द्रव्यमान ex33 नियंत्रणों की तुलना में >20% कम था (चित्रा 4C; ex33 0.61 ± 0.01 मिलीग्राम; CASKδ 18 0.51± 0.02 मिलीग्राम; पी = 0.0005, मान-व्हिटनी यू-टेस्ट), इसलिए जीनोटाइप के बीच चयापचय दर में अंतर शायद उनके आकार में अंतर के कारण है।
चित्र 1: श्वासयंत्र सेटअप। (ए) असेंबली से पहले सेंसर प्लग (ऊपर) और 50 एमएल कक्ष (नीचे 50 एमएल श्लेंक ट्यूब से मिलकर) का आरेख। 19/22 ग्राउंड ग्लास जोड़ों के स्थानों पर ध्यान दें जो चैंबर और सेंसर प्लग को कनेक्ट करेंगे, और प्रत्येक प्रयोग से पहले इसे साफ किया जाना चाहिए। स्टॉपकॉक, जो कक्ष को खोलने या सील करने के लिए आवश्यक है, को भी इंगित किया गया है। (बी) प्रयोग के लिए इकट्ठे और तैयार कक्ष और घटकों का आरेख, दिखाता है: गीला कपास रोल, मक्खियों युक्त पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब, कपास स्टॉपर के साथ प्लग किया गया, सोडा-चूना कारतूस, और क्यूएसओ4 से भरा ओ2 जनरेटर। (सी) इकट्ठे कक्ष की तस्वीर। प्लग को चैंबर तक सुरक्षित करने वाला केक क्लैंप कक्ष को पकड़ने वाले रिंग स्टैंड क्लैंप द्वारा आंशिक रूप से अस्पष्ट है। (डी) ओएलईडी डिस्प्ले देखने के लिए ओ2 जनरेटर और विंडो के माध्यम से स्विच कंट्रोलिंग करंट दिखाने वाले नियंत्रक की तस्वीर। (ई) पानी के स्नान में इकट्ठे कक्ष। सात कक्ष दिखाए गए हैं, जिनमें तीन उत्परिवर्ती हैं, तीन वाइल्डटाइप नियंत्रण के साथ, और एक कक्ष जिसमें मक्खियों को छोड़कर सभी घटक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: डेटा अधिग्रहण सेटअप। (ए) डेटा अधिग्रहण के लिए सीरियल पोर्ट का चयन करने के लिए पुट्टी इंटरफ़ेस। COM3 का चयन किया गया है, नियंत्रक के आउटपुट से मेल खाने के लिए 9600 की BAUD दर के साथ। (बी) लॉग फ़ाइल सेट अप करने के लिए पुट्टी इंटरफ़ेस। "प्रिंट करने योग्य आउटपुट" को एक पाठ फ़ाइल में डेटा के लॉगिंग को सक्षम करने के लिए चुना जाता है, डेटा फ़ोल्डर को "ब्राउज़" बटन का उपयोग करके चुना जाता है, और एक फ़ाइल नाम बनाया जाता है। (सी) एक प्रयोग के दौरान पुट्टी लॉग फ़ाइल। डेटा प्रति सेकंड लगभग दो बार प्राप्त किया जाता है, और प्रत्येक पंक्ति में निम्नलिखित अल्पविराम-सीमांकित जानकारी होती है: सेंसर संख्या, अधिग्रहण की शुरुआत के बाद से समय (एमएस), कक्ष तापमान (डिग्री सेल्सियस), कक्ष दबाव (एचपीए), आर्द्रता (प्रतिशत सापेक्ष), और वर्तमान (एमए)। (डी) एक विशिष्ट प्रयोग के दौरान डेटा लॉगिंग, प्रयोगात्मक कक्षों के लिए सात खिड़कियों, साथ ही एक चैनल स्नान तापमान, परिवेशी हवा के तापमान, दबाव और आर्द्रता को रिकॉर्ड करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: माइक्रोरेस्पिरोमीटर से डेटा। (ए) 23 डब्ल्यू (एक्स 33) मक्खियों वाले एकल श्वासयंत्र कक्ष में ओ2 जनरेटर (ब्लैक लाइन, राइट एक्सिस) में दबाव (ग्रे लाइन, बाएं अक्ष) और धारा। शुरुआत में, कक्ष को ~ 992 एचपीए से 1017 एचपीए की ऑफ सीमा तक दबाव डालने के लिए एक लंबी वर्तमान पल्स की आवश्यकता होती है। चूंकि मक्खियों ने ओ 2 का सेवन किया, दबाव तब तक गिर गया जब तक कि यह 1016 एचपीए की ओएन सीमा तक नहीं पहुंच गया, जिसने ओ2 जनरेटर के माध्यम से करंट को सक्रिय किया, जिसने चैंबर को 1017 एचपीए तक फिर से दबाव डाला। इस प्रयोग में प्रक्रिया को छह बार दोहराया गया था। (बी) एक क्षतिग्रस्त स्टॉपकॉक के कारण लीक कक्ष का एक उदाहरण, प्रयोगों की एक अलग श्रृंखला से लिया गया है। कक्ष दबाव (ग्रे लाइन) को बनाए रखने में विफल रहा, जिसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोलाइटिक करंट (ब्लैक लाइन) का निरंतर चक्रण हुआ। पैनल A से भिन्न टाइमस्केल नोट करें। (C) आर्द्रता में बहाव का प्रभाव। कक्ष में 20 मिलीग्राम लेडी बीटल (हिप्पोडेमिया कन्वर्जेंस) द्वारा ओ 2 की खपत से चित्रा 3 ए के समान दबाव का एक साइक्लिंग पैटर्न उत्पन्न होना चाहिए था, लेकिन आर्द्रता (ब्लैक लाइन) में लगातार वृद्धि के कारण कक्ष दबाव (ग्रे लाइन) में एक कृत्रिम वृद्धि हुई जो वीओ 2 को ढंकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: जंगली-प्रकार और सीएएस्क उत्परिवर्ती डी मेलानोगास्टर से मात्रात्मक डेटा। (ए) जंगली-प्रकार (डब्ल्यू (एक्स 33)) और उत्परिवर्ती (सीएएस्कत्रिभुज 18) मक्खियों के लिए द्रव्यमान-विशिष्ट वीओ 2। सभी भूखंडों में, बक्से के तल और शीर्ष क्रमशः पहले और तीसरे चतुर्थक को इंगित करते हैं, मूंछें चरम मूल्यों को इंगित करती हैं, और नमूना आकार (कक्षों की संख्या, प्रत्येक में 17-24 मक्खियां होती हैं) जीनोटाइप के ऊपर कोष्ठक में दिए जाते हैं। CASK त्रिभुज 18 मक्खियाँ सांख्यिकीय रूप से ex33 से काफी भिन्न नहीं हैं (औसत: ex33: 3.420 mL-g-1.h-1, CASKत्रिभुज 18 : 3.029 mL-g-1.h-1; p = 0.08 मान-व्हिटनी यू-टेस्ट)। (बी) फ्लाई-विशिष्ट वीओ 2। CASKत्रिभुज 18मक्खियों ने w (ex33) (2.078 mL-फ्लाई-1.h-1; p = 0.0003, मान-व्हिटनी यू-टेस्ट; तारांकन द्वारा इंगित महत्व) की तुलना में काफीकम O2 (औसत 1.650 mL.fly-1.h-1) का उपभोग किया। (सी) द्रव्यमान सीएएस्कत्रिभुज 18 और वाइल्डटाइप (औसत: 0.526 मिलीग्राम, एक्स 33: 0.623 मिलीग्राम; पी = 0.0005, मैन-व्हिटनी यू-टेस्ट; तारांकन द्वारा इंगित महत्व) के बीच भिन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1. 25 डिग्री सेल्सियस पर वाइल्डटाइप मक्खियों से ड्रोसोफिला श्वसन-चिकित्सा डेटा का सर्वेक्षण। एक अपवाद18 के साथ, अध्ययन ओ2 खपत को मापने वालों तक सीमित हैं। ज्यादातर मामलों में, ग्राफ़ से वीओ 2 का अनुमान लगाना आवश्यक था, और मूल कागजात से आंकड़ा संख्या प्रदान की जाती है। यद्यपि सभी जीनोटाइप को "वाइल्डटाइप" माना जाता था, स्रोत और प्रसार के तरीके भिन्न होते थे। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
उपरोक्त प्रक्रिया एक इलेक्ट्रॉनिक कूलमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर में ओ2 खपत के माप को प्रदर्शित करती है। जंगली प्रकार के डी मेलानोगास्टर में ओ2 खपत के लिए परिणामी डेटा विभिन्न तरीकों (तालिका 1) का उपयोग करके अधिकांश पिछले प्रकाशनों में वर्णित सीमाओं के भीतर थे,हालांकि दूसरों द्वारा रिपोर्ट की गई तुलना में कुछ कम 3,6।
महत्वपूर्ण कदमों ने विधि की दो पूर्ण आवश्यकताओं को संबोधित किया: गैसटाइट सील और पर्यावरणीय स्थिरता। गैसटाइट वातावरण को बनाए रखना सीधा है लेकिन देखभाल की आवश्यकता होती है। श्लेंक फ्लास्क और ट्यूब आदर्श रूप से श्वसनमेत्री कक्षों के रूप में अनुकूल हैं। ग्लास निर्माण कई प्रकार के प्लास्टिक19 में मौजूद गैस पारगम्यता से बचता है, जो लंबे समय तक प्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। मानक जोड़ सेंसर और इलेक्ट्रॉनिक कनेक्शन वाले प्लग के साथ गैसटाइट कनेक्शन की अनुमति देते हैं। स्टॉपकॉक विश्वसनीय सील प्रदान करते हैं और प्रयोगों के दौरान आवश्यकतानुसार खोले या बंद किए जा सकते हैं। प्रत्येक प्रयोग के लिए गैसटाइट सील सुनिश्चित करने के लिए, स्टॉपकॉक का निरीक्षण किया गया, जोड़ों को अच्छी तरह से साफ किया गया, स्वच्छ सिलिकॉन ग्रीस की विवेकपूर्ण मात्रा लागू की गई, और जोड़ों को केक क्लैंप के साथ सुरक्षित किया गया।
विधि की संवेदनशीलता कक्ष के भीतर तापमान और आर्द्रता की स्थिरता से सीमित है। किसी भी पैरामीटर में परिवर्तन के परिणामस्वरूप दबाव में उतार-चढ़ाव होगा जो वीओ 2 सिग्नल में हस्तक्षेप करता है। एक पर्यावरण कक्ष12 या परिसंचारी जल स्नान का उपयोग अधिक स्थिर तापमान नियंत्रण प्रदान करता है। दूसरों द्वारा पिछले काम से पता चला है कि विधि nmol-h-1 स्तर परO2 खपत को माप सकती है जब तापमान ±0.01 डिग्री सेल्सियस20 के भीतर बनाए रखा गया था। आर्द्रता को स्थिर करने के लिए, पानी में डूबे कपास रोल के टुकड़े लगभग 100% पर आर्द्रता बनाए रखते हैं। तापमान और आर्द्रता को कम से कम 90 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दी गई थी, इससे पहले कि कक्षों को इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से उत्पन्न ओ2 के साथ दबाव डाला गया और रिकॉर्डिंग शुरू हुई। सभी प्रयोगों में एक कक्ष शामिल था जिसे सभी घटकों के साथ इकट्ठा किया गया था लेकिन पर्यावरणीय परिस्थितियों की निगरानी के लिए मक्खियों को शामिल नहीं किया गया था।
तापमान, दबाव और आर्द्रता की नियमित रूप से निगरानी करना समस्या निवारण को बहुत सरल बनाता है। उदाहरण के लिए, क्षतिग्रस्त स्टॉपकॉक (चित्रा 3 बी) के कारण कृत्रिम रूप से उच्च स्पष्ट वी ओ 2 या अस्थिर कक्ष आर्द्रता (चित्रा 3 सी) के कारण वीओ 2 की स्पष्ट हानि का पता लगाने और ठीक करने में सक्षम थे।
यहां वर्णित कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह अपेक्षाकृत सस्ती है, जिसमें प्रति चैनल $ 100 की अनुमानित कुल लागत (कक्ष, सेंसर और नियंत्रक शामिल हैं) है। दूसरा, क्योंकि प्रत्येक चैनल स्वतंत्र रूप से डेटा प्राप्त करता है और प्रसारित करता है, सिस्टम स्केलेबल है, जिसमें कक्षों की संख्या केवल पर्यावरण नियंत्रक (जल स्नान या पर्यावरण कक्ष) के आकार और कंप्यूटर में उपलब्ध यूएसबी पोर्ट की संख्या (आमतौर पर >100 तक विस्तार योग्य) से सीमित है। इसके अलावा, क्योंकि कक्ष और नियंत्रक स्वतंत्र हैं, उनमें से किसी की विफलता दूसरों को प्रभावित नहीं करेगी। तीसरा, नियंत्रकों को परिवेश के दबाव के अनुकूल होने या आवश्यकतानुसार संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए आसानी से पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है। इससे संबंधित, कक्षों के अंदर दबाव एक निश्चित मूल्य पर सेट किया जाता है, इसलिए प्रयोगात्मक दबाव परिवेश बैरोमेट्रिक दबाव की परवाह किए बिना प्रयोगों में स्थिर होगा। चौथा, समय, तापमान, दबाव, आर्द्रता और वर्तमान के बारे में डेटा की स्थिर धारा प्रत्येक कक्ष के लिए इन मापदंडों के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देती है, जिससे लंबे प्रयोगों में वीओ 2 में अस्थायी परिवर्तनों के समस्या निवारण या विश्लेषण की सुविधा मिलती है। अंत में, कक्ष के अंदर पर्यावरणीय परिस्थितियों को कई घंटों या दिनों तक एक स्थिर स्तर पर बनाए रखा जा सकता है, क्योंकि खपत ओ2 को लगातार प्रतिस्थापित किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, चैंबर दबाव में 1016 से 1017 एचपीए तक उतार-चढ़ाव हुआ, जो 0.1% से कम है, जिसके परिणामस्वरूप पीओ 2 में भिन्नता 0.5% से कम है। प्रत्येक ओ 2 जनरेटर में क्यूएसओ4 की मात्रा के आधार पर, जो ओ 2 के 28 एमएल उत्पन्न कर सकता है, और इस अध्ययन में मक्खियों के समूहों के औसत वीओ 2, 1.15 एमएल / दिन (औसत = 21.8 मक्खियां प्रति चैंबर), चयापचय दर का अध्ययन एक समय में 24 दिनों तक किया जा सकता है। यह मानते हुए कि मक्खियों को पर्याप्त पोषण प्रदान किया जाता है, इसका मतलब है कि मक्खी के जीवनकाल के अधिकांश समय के लिए चयापचय का लगातार अध्ययन किया जा सकता है।
वर्तमान में, डी मेलानोगास्टर में चयापचय के अधिकांश अध्ययन गैस विश्लेषण या मैनोमेट्री पर आधारित हैं। गैस विश्लेषण पर भरोसा करने वाले तरीके, जैसे स्टॉप-फ्लो और निरंतर प्रवाह श्वासयंत्र 2,3,6 का लाभ यह है कि विधि अच्छी तरह से स्थापित है और उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि, उन्हें महंगे और जटिल उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रवाह को विनियमित करने के लिए मैनिफोल्ड्स और आणविक प्रवाह सेंसर और गैस सांद्रता को मापने के लिए गैस विश्लेषक शामिल हैं। वैकल्पिक रूप से सरल मैनोमीटर9 बहुत कम महंगे हैं। सबसे सरल रूप में, आमतौर पर डी मेलानोगास्टर के लिए उपयोग में, मक्खियों को एनेस्थेटाइज किया जाता है और एक छोटे कक्ष में रखा जाता है जिसमें सीओ2 अवशोषक सामग्री होती है और जो एक केशिका ट्यूब द्वारा एक द्रव जलाशय से जुड़ा होता है। जैसा कि ओ 2 का सेवन किया जाता है, और परिणामस्वरूप सीओ2 अवशोषित होता है, कक्ष में दबाव गिरता है, जो केशिका ट्यूब में तरल पदार्थ खींचता है। तरल पदार्थ की ऊंचाई तब खपत ओ2 की मात्रा के समानुपाती होती है। क्योंकि प्रयोग के दौरान खपत ओ 2 को प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है, प्रयोग के दौरान पीओ 2 लगातार घट जाता है। यद्यपि नियमित प्रयोग V O2 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए P O2 को पर्याप्त रूप से कम नहीं कर सकते हैं, लंबे समय तक प्रयोग, या ऊंचे तापमान पर प्रयोग O2 को कम कर सकते हैं और महत्वपूर्ण P O2 तक पहुंच सकते हैं जिस पर V O2 तेजी से गिरता है। एक और मुद्दा यह है कि केशिका में तरल पदार्थ का वजन नीचे की ओर बल लगाता है, जिससे नीचे की ओर बल के अनुपात में तरल पदार्थ की ऊंचाई कम हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित त्रुटियां होती हैं। इस प्रभाव की भरपाई के तरीकों को 4,21 वर्णित किया गया है, लेकिन बोझिल हैं और व्यापक उपयोग में नहीं हैं। गैस विश्लेषण और मैनोमेट्री की प्रत्यक्ष तुलना ने संकेत दिया कि दो तरीकों ने काफी अलग-अलग परिणाम दिए, लेकिन लेखक विसंगति22 के लिए एक संतोषजनक स्पष्टीकरण देने में असमर्थ थे।
इसके फायदों के बावजूद, कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर की भी सीमाएं हैं। सबसे पहले, कुछ स्टॉप-फ्लो गैस विश्लेषण प्रणालियों के विपरीत, यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। घटकों को प्राप्त करना आसान है और न तो डिजाइन और न ही प्रोग्रामिंग जटिल हैं, लेकिन यह सरल मैनोमेट्रिक सिस्टम9 की तुलना में निर्माण करने के लिए संभावित रूप से अधिक जटिल है। दूसरा, सटीक डेटा के अधिग्रहण में ओ2 पीढ़ी के कई चक्र शामिल होने चाहिए, इसलिए प्रत्येक प्रयोग कई घंटों तक चलना चाहिए। यह मैनोमेट्री का उपयोग करने वाले प्रयोगों के बारे में भी सच है। अंत में, फिर से मैनोमेट्री की तरह, कक्षों के अंदर तापमान और आर्द्रता स्थिर होनी चाहिए। बहरहाल, कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर लागत और जटिलता के संबंध में एक मध्य आधार प्रदान करता है, एक बार इकट्ठा होने के बाद मजबूत और विश्वसनीय होता है, और ओ2 खपत को ठीक से मापता है।
CASK18 उत्परिवर्ती के साथ प्रयोग नकारात्मक (द्रव्यमान-विशिष्ट V O2) और सकारात्मक परिणाम (फ्लाई-विशिष्ट VO2) दोनों प्रदर्शित करते हैं। यदि सीएएके18उत्परिवर्ती के चलने में >50% की कमी चयापचय से समझौता के परिणामस्वरूप होती है, तो यह भविष्यवाणी की जा सकती है कि वीओ 2 एक समान मात्रा से कम हो जाएगा। फिर भी द्रव्यमान-विशिष्ट ओ 2 खपत में परिवर्तन मामूली था (औसत वीओ 2 में 9.6% की कमी), और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था। यह नकारात्मक परिणाम अपेक्षाकृत सामान्य चयापचय वाले सीएएस्क18 उत्परिवर्ती के अनुरूप है, जिसमें व्यवहार फेनोटाइप कम लोकोमोटर ड्राइव के परिणामस्वरूप होता है। यद्यपि यह संभव है कि विधि में पर्याप्त संवेदनशीलता का अभाव हो, आकार में अपेक्षाकृत छोटे अंतर (औसत द्रव्यमान में 15.5% की कमी) के कारण वीओ 2 की कमी अत्यधिक महत्वपूर्ण थी।
चलना ऊर्जा व्यय 5,23 में काफी वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, तो कास्क उत्परिवर्ती में वीओ 2 अपेक्षाकृत सामान्य क्यों है? यह संभव है कि कास्क उत्परिवर्ती16 में अत्यधिक ग्रूमिंग चलने में कमी को संतुलित कर सकती है, या चलने वाले फेनोटाइप कम स्पष्ट होते हैं जब मक्खियों को छोटे ट्यूबों में समूहों में परीक्षण किया जाता है, लेकिन ये परिकल्पनाएं प्रयोगात्मक सत्यापन का इंतजार करती हैं। बहरहाल, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि सीएएस्क लोकस में उत्परिवर्तन का चयापचय पर मजबूत, प्रत्यक्ष प्रभाव नहीं पड़ता है, और यह कि डी मेलानोगास्टर में चयापचय का अध्ययन करने के लिए कोलोमेट्रिक माइक्रोरेस्पिरोमीटर एक प्रभावी उपकरण है।
क्योंकि यह उपकरण आसानी से सामान्य घटकों से निर्मित होता है, ओ2 खपत को सटीक रूप से मापता है, अत्यधिक पोर्टेबल है, स्थिर तापमान वाले किसी भी वातावरण में उपयोग किया जा सकता है, और इसका उपयोग 0.5 मिलीग्राम मक्खियों (वर्तमान अध्ययन) और 500 मिलीग्राम बिच्छू (डीजेएस अप्रकाशित) के रूप में छोटे जीवों के साथ किया गया है, यह विभिन्न जीवों के चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण जोड़ता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम कैस्क उत्परिवर्ती की ओ2 खपत का परीक्षण करने और सीएएस्क उत्परिवर्ती और उनके कॉन्जेनिक नियंत्रण भेजने के लिए एरिज़ोना विश्वविद्यालय में डॉ लिंडा रेस्टिफो को धन्यवाद देते हैं। प्रकाशन शुल्क कॉलेज पार्क विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग से विभागीय पुनर्निवेश निधि द्वारा प्रदान किया गया था। शैडी ग्रोव में विश्वविद्यालयों द्वारा स्थान और कुछ उपकरण प्रदान किए गए थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
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