Summary
電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に適応させた場合、測定されたO2消費量は、以前の研究によって野生型D.melanogasterについて報告された範囲内であった。CASK変異体によるハエ当たりのO2消費量は、より小さく、活性が低く、野生型よりも有意に低かった。
Abstract
電量マイクロレスピロメトリーは、安定した環境を維持しながら、小さな生物のO2消費量を測定するための簡単で安価な方法です。電量マイクロレスピロメーターは、O2が消費され、生物によって生成されたCO2が吸収媒体によって除去される気密チャンバーで構成されています。 得られた圧力低下は電解O2生成を誘発し、生成に使用された電荷量を記録することにより、生成したO2の量を測定する。本研究では、この方法を小グループで試験したショウジョウバエのメラノガスターに適合させ、装置の感度と環境条件を高い安定性のために最適化しました。この装置で野生型ハエが消費するO2の量は、以前の研究によって測定された量と一致しています。CASK変異体による質量特異的O2消費は、より小さく、活性が低いことが知られており、コンジェニックコントロールと変わらなかった。しかし、CASK変異体のサイズが小さいため、ハエ当たりのO2消費量が大幅に減少しました。したがって、マイクロレスピロメーターは、D. melanogasterのO2消費量を測定することができ、遺伝子型間のわずかな違いを区別することができ、代謝率を測定するための汎用性の高いツールを追加します。
Introduction
代謝率を測定する能力は、環境的文脈における生物を完全に理解するために重要です。例えば、寿命1における食事の役割、代謝における食事の役割2、低酸素ストレスの閾値3を理解するためには、代謝率を測定する必要があります。
代謝率の測定には、2つの一般的なアプローチがあります4。直接熱量測定は、熱産生を測定することにより、エネルギー消費量を直接測定します。間接熱量測定は、他の手段、多くの場合、O2 消費量(VO2)、CO2 生産、またはその両方の呼吸測定を介してエネルギー生産を測定します。直接熱量測定は、 ショウジョウバエのmelanogaster5を含む小さな外温動物に適用されていますが、スピロメトリーは技術的により単純で、より一般的に使用されています。
野生型および変異体D. melanogasterの代謝率を測定するために、いくつかの形態のスピロメトリーが成功裏に使用され、体温6、社会環境3、食事3,7、および神経発達障害8の代謝効果に関する洞察が得られました。これらは 2 つのクラスに分類され、コストと複雑さが大きく異なります。マノメトリーは最も単純で最も安価な9,10であり、ハエはCO2吸収剤を含み、薄いキャピラリーを介して液体リザーバーに接続されている密閉チャンバーに入れられます。O2が消費され、CO2が吸収されると、チャンバー内の圧力が低下し、流体がキャピラリーに引き込まれます。したがって、キャピラリーの流体で満たされた体積はVOに比例します2。毛細血管内の流体によって加えられる力を補正する、より精巧なバージョンもD. melanogaster1で使用されています。マノメトリーには、シンプルで安価であるという利点がありますが、圧力に敏感であるため、一定の環境条件が必要です。また、消費されたO2は置換されないため、チャンバー内のO2(PO2)の分圧は徐々に低下する。
ガス分析を用いた呼吸法は、D. melanogasterにも定期的に使用されています。この場合、ガスは、ハエを含む密閉チャンバーから一定の間隔でサンプリングされ、赤外線分析装置に送られる2,6,11。このタイプの装置には、市販されており、環境条件の影響を受けにくく、サンプリング中にガスがリフレッシュされるため、PO2が安定しているという利点があります。ただし、機器は高価で操作が複雑になる可能性があります。
最近開発された電量マイクロレスピロメータ12は、既存のシステムに代わる安価で高感度かつ安定した代替手段を提供する。実際には、生物はO2を消費する気密チャンバーに入れられ、呼気されたCO2は吸収性材料によって除去され、チャンバー圧力の正味の低下をもたらします。内圧が予め設定された閾値(ON閾値)まで低下すると、電解O2発生器に電流が流れ、圧力を第2の閾値(OFF閾値)に戻して電気分解を停止する。O2発生器を横切る電荷移動は、チャンバを再加圧するのに必要なO2の量に正比例し、したがって、生物4によって消費されるO2を測定するために使用することができる。この方法は感度が高く、VO2を正確に測定し、O 2の定期的な交換により、数時間または数日間、PO2をほぼ一定のレベルに維持できます。
この研究で使用された電量マイクロレスピロメーターは、マルチモーダル(圧力、温度、湿度)電子センサーを採用しています。センサは、圧力のわずかな変化を検出し、低圧閾値に達するとO2生成を作動させるマイクロコントローラによって動作する12。この装置は既製の部品から組み立てられ、さまざまなチャンバーや実験環境で使用でき、カブトムシテネブリオモリターの体重と温度の影響を調べるのに成功しています。本研究では、マイクロレスピロメーターは、T. molitor の質量の約 1% を有する D. melanogaster のO 2 消費量を測定するように適合されています。O2生成を活性化する閾値を小さくすることで装置の感度を高め、温度管理された水槽で実験を行い、チャンバー内の湿度を100%近くに維持することで環境安定性を高めました。
膜関連グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリーの一部であるCASK(カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ)タンパク質は、さまざまな多タンパク質複合体の分子足場であり、KASKの変異はヒトおよびD. melanogasterの神経発達障害と関連している13,14。生存可能なD.メラノガスター変異体であるCASKΔ18は、ドーパミン作動性ニューロンの活性を阻害し15、コンジェニックコントロールと比較して活性レベルを50%以上低下させる14,16。KASK変異体の活性レベルの低下と代謝調節におけるカテコールアミンの役割17のために、我々はそれらの標準代謝率、したがってO2消費量が対照と比較して劇的に減少すると仮定した。
O2 消費量は、CASKΔ18 およびそれらの野生型同族体 w(ex33) で測定されました。ハエのグループをスピロメトリーチャンバーに入れ、O 2消費量を測定し、O2消費量を計算し、質量比ベースとハエあたりベースの両方で発現させた。この装置は、野生型ハエのV O2を記録し、これは以前の研究と一致しており、野生型ハエとKASK変異ハエのハエあたりのO2消費量を区別することができました。
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Protocol
1.ハエの飼育と収集
- 標準的な ショウジョウバ エの餌が入った狭いバイアルでハエを25°Cに維持します。
注:各遺伝子型のサンプルサイズは、少なくとも9回の反復で構成され、それぞれが15〜25匹のハエを含む単一の呼吸計チャンバーで構成され、以下に説明するように設定する必要があります。 - 2〜3日ごとにハエを移します。
- CO2でハエを麻酔し、各遺伝子型の15〜25人の男性のグループを収集し、各グループを新鮮な酵母のない食品バイアルに入れます。
注:男性は、生殖状態による変動を減らすために使用されました。この方法は男女ともに適用されます。 - ハエを25°Cで少なくとも24時間回復させます。
注:実験時までに、ハエは1〜4日齢になっているはずです。ステップ1.3で説明した収集頻度は、ハエの年齢範囲を狭めるために設定できます。
2.呼吸計チャンバーのセットアップと組み立て
- ウォーターバスをオンにして、実験に必要な温度に設定します。
注:以下の実験は、50 mLのシュレンクチューブをチャンバーとして使用して25°Cで行いました。コンポーネントは、 図1A、1B、および1Cに示すように組み立てます。 - チャンバーとセンサープラグのすりガラスの接合部を徹底的に清掃するには、70%エタノールを実験室用ワイプ(接合部に直接スプレーするのではなく)にスプレーし、センサープラグからほこりや古いグリースを拭き取ります(図1A)。新しい実験室用ワイプでエタノールを拭き取ります。
- 精製水に浸した1cmの綿ロールをチャンバーの底に置き、湿度を安定させます。
- 十分な水(~0.5 mL)を加えて、ロール綿の底に小さなプールを作ります。
- チャンバーの接合部にこぼれた水を拭き取ります。
- 漏斗を使用して、ラベル付きのポリプロピレンチューブにハエを移します。
- チューブを綿ロールで塞ぎます。
注:チューブは、長さ5.5 cmにトリミングされた5 mLのポリプロピレン製試験管で構成されており、実験チャンバーと空気を自由に交換できるようにホットナイフで穴が開いています。CO2麻酔は代謝異常を引き起こすことが知られているため、ハエは麻酔なしで移送され、ハエを失わないように細心の注意を払う必要があります。
- チューブを綿ロールで塞ぎます。
- ハエの入った換気チューブを各呼吸計チャンバー(濡れた綿の上)に1本追加します。
- ソーダライムカートリッジ(チューブあたり4〜5ペレット)を充填し、チャンバー内のハエを含むチューブの上部に置きます。
注:ソーダライムカートリッジは、電動ドリルで4〜5回穴あけされた800μLの遠心分離管で構成されています。 - O2 発生器に飽和硫酸銅(CuSO4)溶液を通気孔のレベルより下に充填します
注:O2 発電機は、ねじ山の下に4つの穴が開けられたスクリューキャップ遠心分離管で構成されています。白金(Pt)電極と銅(Cu)電極を2ピンコネクタにはんだ付けし、キャップに開けた穴に挿入し、エポキシで貼り付けます。CuSO4 の電気分解は、実験生物によって消費されるO2 を生成する。CuSO4 は無脊椎動物に有毒であり、こぼれや漏れを避け、すぐにクリーンアップします。 - 充填されたO2 ジェネレーターをセンサープラグの2ピンコネクタに接続します。
注意: 銅カソードはコントローラの負出力に接続し、白金アノードをプラス線に接続する必要があります。接続が逆になっていると、実験が失敗します。 - センサープラグのすりガラスジョイントの反対側に、透明なシリコングリースを2つ小さなたたきます。
- プラグをチャンバーに挿入し、プラグ(またはチャンバー)を適度な圧力で回転させて、ジョイントにグリースを広げます。
- 余分なグリースをラボ用ワイプで拭き取ります。
- プラスチック製のケッククランプをジョイントにスナップして、チャンバーにプラグを固定します。組み立てられたチャンバーは 図1Cのようになります。
- その日の実験に使用したチャンバーの数について、上記の手順を繰り返します。
メモ: 記録できるチャンバーの数は、使用可能なチャンバー、コントローラー、およびコンピューターへのUSB入力の数によって制限されます。本実験では、通常、7つのチャンバーを並列に実行しました。ミュータントなどの実験的なハエは、適切な対照と一致させる必要があります。ハエのいないチャンバーを同じように設定し、環境変動のコントロールとして各実験に含める必要があります。異なる処理(変異型、野生型、飛行禁止)を含むチャンバーは、実験間でローテーションする必要があります。 - 組み立てたチャンバーを、活栓を開いた状態でウォーターバスのラックに入れます(図1E)。
注:概日変動を避けるために、ここで説明するすべての実験では、午前9時30分から9時50分の間にチャンバーを浴槽に入れました。 - 活栓は開いたままにします(ハンドルを活栓と平行に保ちます)。
注意: 活栓に水が入らないように注意してください。 - 栓を開いた状態でチャンバーを約30分間平衡化させます。
注意: チャンバーが平衡化されている間に、電子機器を接続し、以下の説明に従ってデータ取得を設定します。
3.コントローラーとコンピューターのセットアップ
- O2 発電機に電流を供給するスイッチがオフの位置にあることを確認してください(コネクタから離れています。 図1D)。
- 各コントローラボックスを使用可能なユニバーサルシリアルバス(USB)ポートに接続します。
注:他の場所で説明されているコントローラーユニットの構築とプログラミング12. - 6芯ケーブルを使用して、コントローラーを呼吸計チャンバーに接続します。
- コントローラの有機発光ダイオード(OLED)ディスプレイ(図1D)に環境パラメータが表示されていることを確認します。
- コントローラーのスイッチを使用して、O2 発電機を短時間オンにします(図1D)。
- 電流値がゼロから35〜55mAに増加すると、コントローラーとチャンバーは実験の準備が整います。
- コントローラがどのCOMポートを使用しているかを確認します。次の手順に従います。
- Microsoft Windowsの [スタート ]アイコンをクリックします。
- [設定]アイコンをクリックします。
- [Bluetoothとデバイス]をクリックします。
- コントローラとそのCOMポートがデバイスのリストに表示されていることを確認します。
- デスクトップでPuTTYを開き、以下で説明するように、呼吸計の各チャンネルのログファイルを設定します。
注:PuTTYは、COMポートを介してコンピュータにデータを転送するために使用される無料のセキュアシェルおよびTelnetクライアントです。- [Serial line](シリアルライン)ボックスにポート番号を入力して、コントローラのCOMポートを選択します(図2A)。
- 「 ログ」をクリックします。
- 「セッションログ」で「印刷可能な出力」を選択します(図2B)。
- 「ログ・ファイル名」で、「 参照」をクリックします。
- 選択したフォルダに、説明情報(日付、種、COMポート番号など)を含むファイル名を作成します。
- 「 保存」をクリックします。
- 「 開く」をクリックします。ウィンドウが開き、カンマ区切りのデータが記録されます(図2C)。
- 実験に使用している他のすべてのコントローラーについても同じ手順を繰り返します。各COMポートへの入力は、個別のウィンドウとして表示されます(図2D)。
4. 実験の実行
- チャンバーが30分間平衡状態になったら、活栓を閉じて密閉します。
- 浴槽と浴室を発泡スチロールの箱で覆い、安定した環境を維持します。
- さらに1時間平衡化します。
- コントローラーボックスのスイッチを使用して、各チャンバーのO2 発生器に電流を流します。
- O2 発生器が作動したら、圧力が事前に設定されたOFF圧力まで上昇することを確認します。
注:この一連の実験では、大気圧をわずかに上回る1017hPaを「OFF」圧力として使用しました。周囲圧力に戻ると、チャンバーからガスが漏れていることを示します。さらに、周囲気圧に関係なく、実験全体で同じ圧力を使用できます。「オン」の圧力は1016hPaであり、O2 発生器が作動する前に圧力が1hPa下がるだけで済むことを意味した。これにより、ショウジョウバエのO2 消費量を測定するのに十分な感度が得られました。チャンバーが「OFF」設定に加圧されると、電流はゼロに低下します。 - 実験を3時間以上実行します。
注:高温でVO2 を高くすると、実験時間を短縮できます。機器が機能していることを確認するために時々監視しますが、温度安定性に影響を与える可能性のあるチャンバーの近くで過度の活動を避けてください。
5. 仕上げ実験
- すべてのコントローラーのO2 ジェネレーターをオフにします。
注意: チャンバーが開いている間にO2 ジェネレーターを運転しないように、最初に実行してください。 - 活栓を開いてチャンバーのシールを解除します。
- PuTTYウィンドウをさらに5〜15分間開いたままにして、最終的なベースラインを提供します。
- 各コントローラーの PuTTY ウィンドウを閉じ、録画を終了します。
注:すべての実験は午後4時50分から5時10分の間に終了しました。 - センサーをケーブルから外します。
- チャンバーをドライラックに移動します。
- センサープラグをチャンバーから一度に1つずつ取り外します。
- O2 ジェネレーターを外し、チューブラックに置きます。
- センサープラグからグリースを拭き取り、ラックに保管します。
- チャンバージョイントからグリースを取り除き、ハエとソーダライムでチューブを取り外します。
- CO2で各チューブに麻酔をかけ、ウェイトボートを叩き、 マイクロ天びんで重さを量ります。
- 各チューブの重量とハエの数を記録します。
- ハエを捨てるか、追加の手順のために取っておきます。
- カートリッジからソーダライムを廃棄物容器に捨てます。
- O2発生器を開き、CuSO4溶液を廃液容器に廃棄します。
- 電極とチューブを精製水ですすいでください。
- チューブラックを置いて乾燥させます。
6. 電荷移動データの解析
- データをコンマ区切りのテキストとしてスプレッドシートにインポートし、各レコードが個別のワークシートで構成されます。
- O2 発生器の各パルスの現在および時間データを記録します。チャンバーを加圧した後の最初のパルスから開始し、各電流パルスの開始時刻と終了時刻を(行番号として)記録します。これは、電流がゼロ(通常は約45〜50mA)を超え、ゼロを超える最後の行まで行ったときの行番号です。
- ワークシートに表を作成して、次のデータを記録します。
- パルス中の平均電流振幅:= AVERAGE([パルスの最初の行]:[パルスの最後の行])、各パルス(現在の列から)。
- パルス幅: ([パルスの最終行] - [パルスの最初の行[-1行]])/1000 (ミリ秒単位の時間列から)。
- 合計実験時間:[最後のパルスの開始時の時間] - [チャンバー加圧後の最初のパルスの終了時の時間](分列の時間から)。
- 次に、各パルス(平均電流X時間)の電荷移動(Q)を計算します
- すべてのパルスの電荷を合計して、総電荷量(Qtot)を計算します。
7.O2 消費量の分析
- すべてのデータに対して新しいスプレッドシートを設定し、各チャンバーについて以下を入力または計算します。
- Qtot (合計料金)
- ほくろ(= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= モル × 22413 mL/mol)
- 合計時間(上記のデータ分析から)
- mLのmin-1 (=mlO2 ÷合計時間)
- グラム単位の重量(麻酔をかけ、実験後に測定したハエの重量を量る)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ 重量 (グラム単位)
- mL/h/g(上記×60)
- mg/fly (= ハエの重量÷ハエの数)
- μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ ハエの数)。
- 各治療のデータを表にする(遺伝子型など)
- 分散分析、t検定、またはMann-Whitneyのu検定 13を使用して処理を比較します。
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Representative Results
呼吸計コントローラの圧力と電流の出力は、1つの実験における1つのチャンバーについて図3Aに示されています。最初の長電流パルスは、チャンバーを周囲圧力(約992hPa)から事前に設定されたOFFしきい値の1017hPaまで加圧しました。ハエがO2を消費し、CO2が吸収されると、圧力はゆっくりと低下し、ON閾値の1016hPaに達すると、O2発生器を通る電流が活性化されました。示されている例では、各パルスの平均振幅は50.1mA、持続時間は16.1秒で、パルスあたり約0.81クーロン(C)の電荷移動が得られます。このチャンバーの総電荷移動は、合計時間240.0分で3.28°Cでした。ハエの質量と数(合計14.9 mgの重さのハエ23匹)の手順に記載されている計算を使用すると、このチャンバー内のグループのO2消費量は3.19 mL h-1 g-1または2.07 μL h-1 fly-1でした。
この機器は、最小限のトレーニングで簡単にセットアップでき、組み立てとシャットダウンの多くのサイクルで確実に機能します。しかし、設備の定期的な保守点検や実験条件の管理は慎重に行わなければなりません。たとえば、ジョイントや活栓の故障による気密シールの損失は、急速な加圧サイクルと不意に高いVO2 につながる可能性があります(図3B)。さらに、チャンバー内の温度と湿度は安定している必要があります。温度または湿度が低下すると、結果として生じる圧力降下は、O2 が消費されていると誤って解釈されます。逆に、温度または湿度の上昇ドリフトは、O2 の消費によって引き起こされる圧力低下を打ち消し、VO2 信号を人為的に減少または除去します(図3C)。
この方法は、CASK遺伝子座からの転移因子の不正確な切除によって生成され、移動運動が劇的に減少するCASKΔ18変異体のVO2を試験するために使用された14,16。転移因子の精密切除によって生成された野生型w(ex33)コントロールでは、平均質量比O2消費量は3.65±0.24mL・g-1・h-1(n = 16チャンバー;図4A)。
CASKδ18変異体のVO2は、歩行運動が目に見えて減少したにもかかわらず、対照群よりもわずかに低かったが有意ではなかった(平均± s.e.m.= 3.23 ± 0.13 mL·g-1·h-1;n = 11群;P = 0.08 Mann-Whitney の u 検定)。
体重換算で代謝率を表現することの妥当性は疑問視されているので18、O2消費量もハエ当たりベースで分析した(図4B)。この分析により、VO2は野生型コントロールと比較してCASKΔ18で有意に減少しました(ex33:2.22 ± 0.13 μL·fly-1·h-1;カスクΔ18: 1.58 ± 0.10 μL・フライ-1・h-1;P = 0.0003、Mann-Whitney u検定)。しかし、CASKΔ18ハエの平均質量は、ex33対照の平均質量よりも>20%低かった(図4C;ex33 0.61 ± 0.01 mg;カスクΔ18 0.51±0.02mg;P = 0.0005, Mann-Whitney u-test)であるため、遺伝子型間の代謝率の違いは、おそらくそれらのサイズの違いによるものです。
図1:呼吸計のセットアップ。 (A)組み立て前のセンサープラグ(上)と50 mLチャンバー(下図、50 mLシュレンクチューブで構成)の図。チャンバーとセンサープラグを接続する19/22のすりガラスジョイントの位置に注意し、各実験の前に清掃する必要があります。チャンバーを開閉するために必要な活栓も示されています。(B)組み立てられ、実験の準備が整ったチャンバーとコンポーネントの図で、湿った綿ロール、ハエを含むポリプロピレンチューブ、綿栓で塞がれた、ソーダライムカートリッジ、およびCuSO4で満たされたO2発生器。(C)組み立てられたチャンバーの写真。プラグをチャンバーに固定するケッククランプは、チャンバーを保持しているリングスタンドクランプによって部分的に隠されています。(D)O2発生器を通るスイッチ制御電流を示すコントローラとOLEDディスプレイを見るためのウィンドウの写真。(E)水浴で組み立てられたチャンバー。7つのチャンバーが示されており、3つのチャンバーにはミュータント、3つのチャンバーには野生型コントロール、1つのチャンバーにはハエを除くすべてのコンポーネントが含まれています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:データ集録のセットアップ 。 (A)データ集録用のシリアルポートを選択するためのPuTTYインターフェース。COM3 が選択されており、コントローラの出力に合わせて 9600 のボー レートが設定されています。(B)ログファイルを設定するためのPuTTYインターフェイス。テキストファイルへのデータロギングを有効にする場合は「印刷用出力」を選択し、「参照」ボタンでデータフォルダを選択し、ファイル名を作成します。(C) 実験中の PuTTY ログ ファイル。データは毎秒約2回集録され、各行には、センサ番号、取込み開始からの時間(ms)、チャンバー温度(°C)、チャンバー圧力(hPa)、湿度(相対パーセント)、電流(mA)のカンマ区切り情報が含まれています。(D)一般的な実験中のデータロギングで、実験室用の7つの窓と、浴槽温度、周囲温度、圧力、湿度を記録する1つのチャンネルがあります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロレスピロメーターからのデータ。 (A)23 w(ex33)のハエを含む単一の呼吸計チャンバー内のO2発生器(黒線、右軸)の圧力(灰色の線、左軸)と電流。最初に、チャンバーを~992hPaからOFFスレッショルドの1017hPaまで加圧するために、長い電流パルスが必要です。ハエがO2を消費すると、圧力はON閾値の1016hPaに達するまで低下し、O2発生器を通る電流が活性化され、チャンバーが1017hPaに再加圧されました。この実験では、このプロセスを6回繰り返しました。(B)活栓の損傷によって引き起こされる漏れチャンバーの例で、別の一連の実験から取られました。チャンバーは圧力を維持できず(灰色の線)、電解電流が絶えず循環していました(黒線)。パネルAとは時間スケールが異なることに注意。 (C)湿度のドリフトの影響。チャンバー内の20mgのテントウムシ(Hippodamia convergens)によるO2の消費は、図3Aのような圧力の循環パターンを生成するはずでしたが、湿度の着実な上昇(黒線)は、VO2をマスクするチャンバー圧力の人工的な上昇(灰色の線)を引き起こしました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:野生型およびKASK変異体D.melanogasterの定量的データ。 (A)野生型(w(ex33))および変異体(CASKΔ18)ハエの質量特異的VO2。すべてのプロットにおいて、ボックスの底部と上部はそれぞれ第1四分位数と第3四分位数を示し、ひげは極値を示し、サンプルサイズ(チャンバーの数、それぞれ17〜24匹のハエを含む)は遺伝子型の上の括弧内に示されています。CASK Δ18ハエはex33と統計的に有意差がない(中央値:ex33:3.420 mL・g-1・h-1、CASKΔ18 :3.029 mL・g-1・h-1;p = 0.08 Mann-Whitney u検定)。(B)ハエ特異的VO2。CASKΔ18ハエの消費量は、w(ex33)(2.078 mL・fly-1・h-1;p = 0.0003、Mann-Whitney u検定、有意性はアスタリスクで示す)よりも有意に少ないO2(中央値1.650 mL・fly-1・h-1)であった。(C)質量はCASKΔ18と野生型で異なっていた(中央値:0.526 mg、ex33:0.623 mg、p = 0.0005、Mann-Whitney u検定、有意性はアスタリスクで示す)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表 1. 野生型ハエのショウ ジョウバエ の25°Cでのスピロメトリーデータの調査。 1つの例外18を除いて、研究はO2 消費量を測定するものに限定されています。ほとんどの場合、グラフからVO2 を推定する必要があり、原著論文の図番号が提供されています。すべての遺伝子型は「野生型」であると考えられていたが、その発生源と増殖方法はさまざまでした。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上記の手順は、電子電量マイクロレスピロメーターを使用したD.メラノガスターにおけるO2消費量の測定を示しています。野生型D.melanogasterにおけるO2消費の結果のデータは、他の研究者によって報告されたものよりやや低いものの、多様な方法(表1)を用いた以前のほとんどの出版物に記載されている範囲内であった3,6。
重要なステップは、気密シールと環境安定性というこの方法の2つの絶対的な要件に対処しました。気密環境を維持するのは簡単ですが、注意が必要です。シュレンクフラスコとチューブは、蒸着薬室として理想的です。ガラス構造は、多くの種類のプラスチック19に存在するガス透過性を回避し、これは長時間の実験で特に重要である。標準ジョイントにより、センサーと電子接続を含むプラグとの気密接続が可能です。活栓は信頼性の高いシールを提供し、実験中に必要に応じて開閉することができます。各実験の気密シールを確保するために、活栓を検査し、接合部を徹底的に洗浄し、適切な量のクリーンなシリコーングリースを塗布し、接合部をケッククランプで固定しました。
この方法の感度は、チャンバー内の温度と湿度の安定性によって制限されます。いずれかのパラメータを変更すると、VO2信号に干渉する圧力変動が発生します。恒温室12や循環水槽を用いることで、より安定した温度制御が可能となる。他の人による以前の研究は、温度が±0.01°C以内に維持されたときに、この方法がnmol·h-1レベルでO20消費量を測定できることを実証しました。湿度を安定させるため、水に浸したロール綿は湿度をほぼ100%に保ちました。温度および湿度を少なくとも90分間安定させてから、チャンバーを電解生成O2で加圧し、記録を開始した。すべての実験には、環境条件を監視するために、すべてのコンポーネントで組み立てられたが、ハエは含まれていない1つのチャンバーが含まれていました。
温度、圧力、湿度を定期的に監視することで、トラブルシューティングが大幅に簡素化されます。例えば、活栓の損傷によって引き起こされる人為的に高い見かけのV O2(図3B)や、不安定なチャンバーの湿度によるVO2の見かけの損失(図3C)を検出して修正することができました。
ここで説明する電量マイクロレスピロメーターには、いくつかの利点があります。まず、比較的安価で、チャネルあたり約100ドルの総コスト(チャンバー、センサー、コントローラーを含む)です。第2に、各チャンネルが独立してデータを集録および送信するため、システムはスケーラブルであり、チャンバーの数は、環境コントローラ(ウォーターバスまたはエンプロベレントチャンバー)のサイズとコンピュータで使用可能なUSBポートの数(通常は>100まで拡張可能)によってのみ制限されます。また、チャンバーとコントローラーは独立しているため、どちらかが故障しても他のチャンバーには影響しません。第3に、コントローラは、周囲の圧力に適応したり、必要に応じて感度を調整したりするように簡単に再プログラムできます。これに関連して、チャンバー内の圧力は固定値に設定されているため、周囲気圧に関係なく、実験圧力は実験全体で一定になります。第4に、時間、温度、圧力、湿度、電流に関するデータが安定しているため、チャンバーごとにこれらのパラメータを詳細に分析できるため、長時間の実験でのVO2の時間的変化のトラブルシューティングや分析が容易になります。最後に、チャンバー内の環境条件は、消費されたO2が継続的に交換されるため、何時間もまたは数日間一定レベルに維持できます。本研究では、チャンバー圧力は1016hPaから1017hPaまで変動し、0.1%未満であり、その結果生じるPO2の変動は0.5%未満でした。28mLのO2を生成することができる各O2発生器内のCuSO4の量、およびこの研究におけるハエのグループの平均VO2、1.15mL /日(チャンバーあたり平均= 21.8匹のハエ)に基づいて、代謝率は一度に最大24日間研究できます。 ハエに十分な栄養が与えられていると仮定すると、これはハエの寿命のほとんどで代謝を継続的に研究できることを意味します。
現在、D. melanogasterの代謝に関するほとんどの研究は、ガス分析または圧力測定に基づいています。ストップフローおよび連続フロー呼吸計2,3,6などのガス分析に依存する方法は、その方法が十分に確立されており、機器が市販されているという利点を有する。しかし、流量を調整するためのマニホールドや分子流量センサー、ガス濃度を測定するためのガス分析計など、高価で複雑な機器が必要です。あるいは、単純な圧力計9ははるかに安価である。 D. melanogasterに一般的に使用されている最も単純な形態では、ハエは麻酔され、CO2吸収材を含み、キャピラリーチューブによって液体リザーバーに接続されている小さなチャンバーに入れられます。O2が消費され、得られたCO2が吸収されると、チャンバー内の圧力が低下し、流体がキャピラリーチューブに引き込まれます。流体の高さは、消費されるO2の量に比例します。消費されたO2は実験中に置換されないため、PO2は実験の過程で継続的に減少します。日常的な実験では、VO2に悪影響を与えるほどP O2を減少させないかもしれないが、長時間の実験や高温での実験では、O2が枯渇し、V O2が急激に減少する臨界P O2に達する可能性がある3。また、キャピラリー内の流体の重量が下向きの力を発揮し、下向きの力に比例して流体の高さが小さくなり、誤差が生じる可能性があるという問題もあります。この効果を補う方法が説明されているが4,21、煩雑であり、広くは使用されていない。ガス分析と圧力測定の直接比較は、2つの方法が有意に異なる結果をもたらすことを示しましたが、著者らは、この矛盾について満足のいく説明をすることができませんでした22。
その利点にもかかわらず、電量マイクロレスピロメーターにも限界があります。まず、一部のストップフローガス分析システムとは異なり、市販されていません。コンポーネントは入手が容易で、設計もプログラミングも複雑ではないが、単純なマノメトリックシステムよりも構築が複雑になる可能性がある9。第二に、正確なデータの取得には、O2 生成の複数のサイクルが含まれている必要があるため、各実験は数時間続く必要があります。これは、マノメトリーを用いた実験にも当てはまります。最後に、再び圧力測定と同様に、チャンバー内の温度と湿度が安定している必要があります。それにもかかわらず、電量マイクロレスピロメーターは、コストと複雑さの点で中間点を提供し、一度組み立てると堅牢で信頼性が高く、O2 消費量を正確に測定します。
CASKΔ18変異体を用いた実験では、陰性(質量特異的V O2)と陽性(ハエ特異的VO2)の両方が示されました。CASKΔ18変異体の歩行の>50%の減少が代謝の低下に起因するとすると、VO2も同様の量で減少すると予測される可能性があります。しかし、質量比O2消費量の変化は控えめであり(VO2中央値で9.6%減少)、統計的に有意ではなかった。この陰性の結果は、CASKΔ18変異体が比較的正常な代謝を示し、行動表現型が運動駆動力の低下に起因することと一致しています。感度が十分でない可能性はあるが、サイズ差が比較的小さい(中央質量の15.5%減少)ことによるVO2の減少は非常に有意であった。
歩行はエネルギー消費量の有意な増加と関連している 5,23 では、なぜVO 2 は CASK 変異体で比較的正常なのですか?KASK変異体16における過度の毛づくろいが歩行の減少を相殺する可能性や、ハエを小さなチューブで集団で試験した場合、歩行表現型があまり明白にならない可能性はあるが、これらの仮説は実験的検証を待っている。それにもかかわらず、CASK遺伝子座の変異は代謝に強く直接的な影響を与えず、電量マイクロレスピロメーターはD.melanogasterの代謝を研究するための効果的なツールであると結論付けています。
この装置は、共通のコンポーネントから簡単に構築でき、O2 消費量を正確に測定し、携帯性が高く、安定した温度のあらゆる環境で使用でき、0.5 mgのハエ(本研究)から500 mgのサソリ(DJS未発表)までの生物で使用されてきたため、多様な生物の代謝を研究するための汎用性の高いツールを追加します。
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Disclosures
著者は利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
アリゾナ大学のリンダ・レスティフォ博士には、KASK変異体のO2 消費の試験を提案し、KASK変異体とそのコンジェニックコントロールを送っていただいたことに感謝します。出版料は、カレッジパーク大学の生物学部から部門再投資基金によって提供されました。スペースといくつかの機器は、シェイディグローブの大学から提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
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