Summary
La respirometría coulométrica es ideal para medir la tasa metabólica de pequeños organismos. Cuando se adaptó para Drosophila melanogaster en el presente estudio, el consumo de O2 medido estuvo dentro del rango reportado para D. melanogaster de tipo salvaje en estudios previos. El consumo deO2 por mosca por parte de los mutantes CASK, que son más pequeños y menos activos, fue significativamente menor que el de los mutantes salvajes .
Abstract
La microrrespirometría coulométrica es un método sencillo y económico para medir el consumo deO2 de organismos pequeños mientras se mantiene un entorno estable. Un microrrespirómetro culombométrico consiste en una cámara hermética en la que se consumeO2 y el CO2 producido por el organismo se elimina mediante un medio absorbente. La disminución de presión resultante desencadena la producción electrolítica deO2 , y la cantidad deO2 producida se mide registrando la cantidad de carga utilizada para generarla. En el presente estudio, el método se ha adaptado a Drosophila melanogaster probado en pequeños grupos, con la sensibilidad del aparato y las condiciones ambientales optimizadas para una alta estabilidad. La cantidad deO2 consumida por las moscas silvestres en este aparato es consistente con la medida por estudios previos. El consumo de O2 específico de masa por parte de los mutantes CAST , que son más pequeños y se sabe que son menos activos, no fue diferente de los controles congénitos. Sin embargo, el pequeño tamaño de los mutantes CASK resultó en una reducción significativa en el consumo de O2 por mosca. Por lo tanto, el microrrespirómetro es capaz de medir el consumo deO2 en D. melanogaster, puede distinguir diferencias modestas entre genotipos y agrega una herramienta versátil para medir las tasas metabólicas.
Introduction
La capacidad de medir la tasa metabólica es crucial para una comprensión completa de un organismo en su contexto ambiental. Por ejemplo, es necesario medir la tasa metabólica para comprender su papel en la esperanza de vida1, el papel de la dieta en el metabolismo2 o el umbral de estrés hipóxico3.
Existen dos enfoques generales para medir la tasa metabólica4. La calorimetría directa mide directamente el gasto energético midiendo la producción de calor. La calorimetría indirecta mide la producción de energía a través de otros medios, a menudo a través de la medición respirométrica del consumo de O2 (VO2), la producción deCO2 o ambos. Aunque la calorimetría directa se ha aplicado a ectotermos pequeños, incluida Drosophila melanogaster5, la respirometría es técnicamente más simple y se usa con mayor frecuencia.
Varias formas de respirometría se han utilizado con éxito para medir la tasa metabólica en D. melanogaster salvaje y mutante y han proporcionado información sobre los efectos metabólicos de la temperatura6, el entorno social 3, la dieta 3,7 y los trastornos del neurodesarrollo8. Estos se dividen en dos clases, que varían considerablemente en costo y complejidad. La manometría es la más simple y menos costosa 9,10, en la que las moscas se colocan en una cámara sellada que contiene un absorbente deCO2 y que está conectada a través de un capilar delgado a un depósito de fluido. A medida que se consumeO2 y se absorbe CO2, la presión en la cámara disminuye y el líquido se introduce en el capilar. Por lo tanto, el volumen lleno de líquido del capilar es proporcional al VO2. En D. melanogaster1 también se han utilizado versiones más elaboradas, que compensan la fuerza ejercida por el fluido en el capilar. La manometría tiene la ventaja de ser simple y económica, pero, debido a que es sensible a la presión, requiere condiciones ambientales constantes. Además, debido a que el O 2 consumido no se reemplaza, la presión parcial de O2 (PO2) disminuye gradualmente dentro de las cámaras.
La respirometría mediante análisis de gases también se utiliza regularmente para D. melanogaster. En este caso, los gases se muestrean a intervalos regulares de cámaras selladas que contienen moscas y se envían a un analizador infrarrojo 2,6,11. Este tipo de aparato tiene la ventaja de que está disponible comercialmente, es menos sensible a las condiciones ambientales y los gases se renuevan durante el muestreo para que el PO2 permanezca estable. Sin embargo, el equipo puede ser costoso y complejo de operar.
Un microrrespirómetro coulométrico12 desarrollado recientemente proporciona una alternativa económica, sensible y estable a los sistemas existentes. En la práctica, un organismo se coloca en una cámara hermética donde consumeO2 y el CO2 exhalado es eliminado por un material absorbente, lo que resulta en una disminución neta de la presión de la cámara. Cuando la presión interna disminuye a un umbral preestablecido (umbral ON), la corriente pasa a través de un generador electrolítico deO2, devolviendo la presión a un segundo umbral (umbral OFF) deteniendo la electrólisis. La transferencia de carga a través del generador de O2 es directamente proporcional a la cantidad deO2 requerida para volver a presurizar la cámara y, por lo tanto, se puede utilizar para medir el O2 consumido por el organismo4. El método es altamente sensible, mide el O2 con precisión y el reemplazo regular del O2 puede mantener elO2 en un nivel casi constante durante horas o días.
El microrrespirómetro coulométrico utilizado en este estudio emplea un sensor electrónico multimodal (presión, temperatura y humedad). El sensor es operado por un microcontrolador que detecta pequeños cambios en la presión y activa la generación de O2 cuando se alcanza un umbral de baja presión12. Este aparato se ensambla a partir de piezas listas para usar, se puede utilizar con una amplia variedad de cámaras y entornos experimentales, y se ha empleado con éxito para examinar los efectos de la masa corporal y la temperatura en el escarabajo Tenebrio molitor. En el presente estudio, el microrrespirómetro se ha adaptado para medir el consumo deO2 en D. melanogaster, que tiene aproximadamente el 1% de la masa de T. molitor. La sensibilidad del aparato se ha incrementado mediante la reducción del umbral para activar la generación deO2 , y la estabilidad ambiental se ha mejorado mediante la realización de experimentos en un baño de agua a temperatura controlada y manteniendo la humedad dentro de las cámaras en o cerca del 100%.
La proteína CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), que forma parte de la familia de guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUK), es un andamiaje molecular en diferentes complejos multiproteicos, y las mutaciones en CASK se asocian con trastornos del neurodesarrollo en humanos y en D. melanogaster13,14. Un mutante viable de D. melanogaster, CASKΔ18, interrumpe la actividad de las neuronas dopaminérgicas 15 y reduce los niveles de actividad en más del 50% en comparación con los controles congénitos14,16. Debido a los niveles reducidos de actividad de los mutantes CASK y al papel de las catecolaminas en la regulación del metabolismo17, planteamos la hipótesis de que su tasa metabólica estándar, y por lo tanto el consumo deO2, se reduciría drásticamente en comparación con los controles.
El consumo de O2 se midió en CASKΔ18 y sus congéneres de tipo salvaje, w(ex33). Se colocaron grupos de moscas en cámaras de respirometría, se midió el consumo de O2, se calculó el consumo deO2 y se expresó tanto en masa específica como por mosca. El aparato registró VO2 en moscas de tipo salvaje que era consistente con estudios previos, y pudo diferenciar entre el consumo de O2 por mosca de las moscas mutantes de tipo salvaje y CAST.
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Protocol
1. Cría y recolección de moscas
- Mantener las moscas a 25 °C en viales estrechos que contengan alimento estándar para Drosophila .
NOTA: El tamaño de la muestra para cada genotipo debe comprender al menos nueve réplicas, cada una de las cuales consta de una sola cámara de respirómetro que contiene de 15 a 25 moscas, configurada como se describe a continuación. - Transfiere las moscas cada 2-3 días.
- Anestesiar moscas con CO2, recolectar grupos de 15 a 25 machos de cada genotipo y colocar cada grupo en viales de alimentos frescos y sin levadura.
NOTA: Se utilizaron machos para reducir la variabilidad debida al estado reproductivo. El método se aplica a ambos sexos. - Deje que las moscas se recuperen a 25 °C durante al menos 24 h.
NOTA: En el momento del experimento, las moscas deben tener de 1 a 4 días de edad. La frecuencia de las colectas descritas en el paso 1.3 se puede establecer para reducir el rango de edad de las moscas.
2. Configuración y montaje de la cámara del respirómetro
- Encienda el baño de agua y ajústelo a la temperatura deseada para el experimento.
NOTA: Los siguientes experimentos se realizaron a 25 °C utilizando tubos Schlenk de 50 ml como cámaras. Los componentes deben ensamblarse como se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C. - Limpie a fondo las juntas de vidrio esmerilado de las cámaras y los tapones de los sensores rociando etanol al 70% en una toallita de laboratorio (no directamente sobre la junta) y limpiando el polvo y la grasa vieja del tapón del sensor (Figura 1A). Limpie el etanol con una toallita de laboratorio nueva.
- Coloque un trozo de rollo de algodón empapado en agua purificada de 1 cm en el fondo de la cámara para estabilizar la humedad.
- Agregue suficiente agua (~ 0.5 ml) para formar un pequeño charco en la parte inferior del rollo de algodón.
- Limpie el agua que se haya derramado sobre la junta de la cámara.
- Transfiera las moscas a tubos de polipropileno etiquetados con un embudo.
- Tape el tubo con un rollo de algodón.
NOTA: Los tubos consisten en un tubo de ensayo de polipropileno de 5 mL, recortado a 5,5 cm de longitud y perforado con un cuchillo caliente para permitir el libre intercambio de aire con la cámara experimental. Se sabe que la anestesia con CO2 causa anomalías metabólicas, por lo que las moscas se transfieren sin anestesia, lo que requiere más cuidado para evitar perder las moscas.
- Tape el tubo con un rollo de algodón.
- Agregue un tubo ventilado con moscas en cada cámara del respirómetro (encima del algodón húmedo).
- Llene los cartuchos de cal sodada (4-5 gránulos por tubo) y colóquelos en la parte superior del tubo que contiene moscas dentro de la cámara.
NOTA: Los cartuchos de cal sodada consisten en tubos de centrífuga de 800 μL perforados 4-5 veces con un taladro eléctrico. - Llene los generadores de O2 con una solución de sulfato de cobre saturado (CuSO4) por debajo del nivel de los orificios de ventilación
NOTA: Los generadores de O2 consisten en tubos de centrífuga con tapón de rosca con 4 orificios perforados debajo de las roscas. Los electrodos de platino (Pt) y cobre (Cu) se sueldan a un conector de dos pines, se insertan en orificios perforados en la tapa y se fijan con epoxi. La electrólisis delCuSO4 genera elO2 consumido por el organismo experimental. El CuSO4 es tóxico para los invertebrados, evite derrames o fugas y limpie inmediatamente. - Conecte el generador de O2 lleno al conector de dos clavijas en el enchufe del sensor.
NOTA: El cátodo de cobre debe conectarse con la salida negativa del controlador y el ánodo de platino al cable positivo. Las conexiones invertidas provocarán el error del experimento. - Coloque dos pequeñas gotas de grasa de silicona transparente en lados opuestos de la junta de vidrio esmerilado del enchufe del sensor.
- Inserte el tapón en la cámara y gírelo (o cámara) con una presión moderada para esparcir la grasa en la junta.
- Limpie el exceso de grasa con una toallita de laboratorio.
- Coloque las abrazaderas Keck de plástico en las juntas para asegurar los tapones en las cámaras. La cámara ensamblada debe verse como la Figura 1C.
- Repita los pasos anteriores para el número de cámaras utilizadas para el experimento del día.
NOTA: El número de cámaras que se pueden grabar está limitado por el número de cámaras, controladores y entradas USB disponibles en el ordenador. Para los experimentos actuales, normalmente se utilizaron siete cámaras en paralelo. Las moscas experimentales, como las mutantes, deben ser emparejadas con controles apropiados. En cada experimento debe incluirse una cámara configurada de forma idéntica pero sin moscas como control de la variación ambiental. Las cámaras que contienen diferentes tratamientos (mutante, salvaje, no-fly) deben rotarse entre experimentos. - Coloque las cámaras ensambladas en una rejilla en el baño de agua con las llaves de paso abiertas (Figura 1E).
NOTA: Para evitar la variación circadiana, se colocaron cámaras en el baño entre las 9:30 y las 9:50 am para todos los experimentos descritos aquí. - Deje las llaves de paso abiertas (mantenga la manija paralela a la llave de paso).
NOTA: Tenga cuidado de no permitir que entre agua en las llaves de paso. - Deje que las cámaras se equilibren con las llaves de paso abiertas durante unos 30 minutos.
NOTA: Mientras la cámara está equilibrada, conecte los componentes electrónicos y configure la adquisición de datos como se describe a continuación.
3. Configuración de los controladores y la computadora
- Asegúrese de que los interruptores que suministran corriente a los generadores de O2 estén en la posición OFF (lejos del conector; Figura 1D).
- Conecte cada caja de controladora a un puerto de bus serie universal (USB) disponible.
NOTA: Construcción y programación de las unidades controladoras descritas en otra parte12. - Conecte los controladores a las cámaras del respirómetro mediante cables de 6 conductores.
- Compruebe que las pantallas de diodos emisores de luz orgánicos (OLED) de los controladores (Figura 1D) muestren parámetros ambientales.
- Encienda brevemente los generadores de O2 usando el interruptor del controlador (Figura 1D).
- Si el valor de corriente aumenta de cero a entre 35 y 55 mA, el controlador y la cámara están listos para los experimentos.
- Determine qué puertos COM están siendo utilizados por los controladores, como se describe a continuación.
- Haga clic en el icono Inicio en Microsoft Windows.
- Haga clic en el icono Configuración .
- Haz clic en Bluetooth y dispositivos.
- Asegúrese de que los controladores y sus puertos COM aparezcan en la lista de dispositivos.
- Abra PuTTY en el escritorio y configure un archivo de registro para cada canal del respirómetro como se describe a continuación.
NOTA: PuTTY es un shell seguro gratuito y un cliente telnet que se utiliza para transferir datos a la computadora a través de puertos COM.- Seleccione el puerto COM para un controlador escribiendo el número del puerto en el cuadro "Línea serie" (Figura 2A).
- Haga clic en Registro.
- Seleccione Salida imprimible en "Registro de sesión" (Figura 2B).
- En Nombre del archivo de registro, haga clic en Examinar.
- En la carpeta de la elección, cree un nombre de archivo que contenga información descriptiva (por ejemplo, fecha, especie, número de puerto COM).
- Haga clic en Guardar.
- Haga clic en Abrir. Se abrirá una ventana que muestra los datos delimitados por comas que se están registrando (Figura 2C).
- Repita el procedimiento para todos los demás controladores que se utilicen para el experimento. La entrada a cada puerto COM aparecerá como una ventana separada (Figura 2D).
4. Realización de experimentos
- Una vez que las cámaras se hayan equilibrado durante 30 minutos, séllelas cerrando las llaves de paso.
- Cubra el baño y las cámaras con una caja de espuma de poliestireno para mantener un ambiente estable.
- Deje que se equilibre durante una hora más.
- Encienda la corriente del generador de O2 de cada cámara usando el interruptor en la caja del controlador.
- Una vez activados los generadores deO2 , asegúrese de que la presión aumente a la presión de apagado preestablecida.
NOTA: 1017 hPa, que está ligeramente por encima de la presión atmosférica, se utilizó como presión "OFF" en esta serie de experimentos. El retorno a la presión ambiente indicará una fuga de gas de las cámaras. Además, permite utilizar la misma presión en todos los experimentos, independientemente de la presión barométrica ambiental. La presión de "encendido" era de 1016 hPa, lo que significa que la presión solo necesitaba caer 1 hPa antes de que se activara el generador deO2 . Esto proporcionó una sensibilidad adecuada para medir el consumo deO2 en Drosophila. Una vez que una cámara está presurizada a la configuración "OFF", la corriente debe caer a cero. - Deje que el experimento se ejecute durante 3 o más h.
NOTA: UnV-O2 más alto a temperaturas elevadas puede permitir tiempos de experimento más cortos. Monitoree ocasionalmente para asegurarse de que el equipo esté funcionando, pero evite la actividad excesiva cerca de las cámaras que pueda afectar la estabilidad de la temperatura.
5. Experimento de acabado
- Apague los generadores de O2 en todos los controladores.
NOTA: Haga primero para evitar hacer funcionar los generadores de O2 mientras las cámaras están abiertas. - Abra las llaves de paso para abrir las cámaras.
- Deje las ventanas de PuTTY abiertas durante otros 5-15 minutos para proporcionar una línea de base final.
- Cierre la ventana PuTTY de cada controlador, finalizando las grabaciones.
NOTA: Todos los experimentos terminaron entre las 4:50 y las 5:10 pm. - Desconecte los sensores de los cables.
- Mueva las cámaras a la rejilla seca.
- Retire los tapones de los sensores de uno en uno de las cámaras.
- Desconecte los generadores de O2 y colóquelos en la rejilla de tubos.
- Limpie la grasa del tapón del sensor y guárdelo en la rejilla.
- Limpie la grasa de las juntas de la cámara y retire los tubos con moscas y cal sódica.
- Anesthetize vuela en cada tubo con CO2, golpea un bote de pesas y pesa en una microbalanza.
- Registre el peso y el número de moscas de cada tubo.
- Deseche las moscas o déjelas a un lado para procedimientos adicionales.
- Vierta la cal sodada de los cartuchos en el contenedor de desechos.
- Abra el generador de O2 y deseche la solución de CuSO4 en el contenedor de residuos.
- Enjuague los electrodos y el tubo con agua purificada.
- Coloque las rejillas de tubos para que se sequen.
6. Análisis de los datos de transferencia de carga
- Importe datos como texto delimitado por comas en una hoja de cálculo, y cada registro comprende una hoja de cálculo independiente.
- Registre los datos de corriente y tiempo para cada pulso del generador de O2 . Comenzando con el primer pulso después de que la cámara fue presurizada, registre la hora de inicio y la hora de finalización (como números de fila) de cada pulso actual. Ese es el número de fila cuando la corriente va por encima de cero (generalmente a unos 45-50 mA) a la última fila que está por encima de cero.
- Haga una tabla en la hoja de trabajo para registrar los siguientes datos:
- La amplitud de corriente promedio durante el impulso: = PROMEDIO([primera fila de impulso]:[última fila de impulso]) para cada pulso (de la columna de corriente).
- Duración del pulso: ([Última fila de pulsos] - [primera fila de pulsos[-una fila]])/1000 para cada pulso (desde la columna de tiempo en milisegundos).
- Tiempo total del experimento: [tiempo al inicio del último pulso] - [tiempo al final del primer pulso después de la cámara presurizada] (a partir de la columna de tiempo en minutos).
- A continuación, calcule la transferencia de carga (Q) para cada pulso (corriente media X duración)
- Suma la carga de todos los pulsos para calcular la carga total (Qtot).
7. Análisis del consumo deO2
- Configure una nueva hoja de cálculo para todos los datos e ingrese o calcule lo siguiente para cada cámara:
- Qtot (carga total)
- Moles (= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= moles × 22413 mL/mol)
- Tiempo total (a partir del análisis de datos anterior)
- mL min-1 (= ml O2 ÷ tiempo total)
- Peso en gramos (moscas anestesiadas y pesadas medidas después del experimento)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ peso en gramos)
- mL/h/g (la anterior × 60)
- mg/mosca (= peso de las moscas ÷ número de moscas)
- μL mosca-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ número de moscas).
- Tabular los datos de cada tratamiento (genotipo, p. ej.)
- Compare los tratamientos con ANOVA, prueba t o prueba U de Mann-Whitney 13.
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Representative Results
Las salidas de presión y corriente del controlador del respirómetro se muestran para una cámara en un experimento en la Figura 3A. El primer pulso de corriente larga presurizó la cámara desde la presión ambiente (aproximadamente 992 hPa) hasta el umbral de apagado preestablecido de 1017 hPa. A medida que las moscas consumían O2 y se absorbíaCO2, la presión disminuía lentamente hasta alcanzar el umbral de ON de 1016 hPa, que activaba la corriente a través del generador deO2. En el ejemplo mostrado, la amplitud media de cada pulso es de 50,1 mA, la duración es de 16,1 s, lo que produce una transferencia de carga de aproximadamente 0,81 culombios (C) por pulso. La transferencia de carga total para esta cámara fue de 3,28 C en un tiempo total de 240,0 min. Utilizando los cálculos descritos en Procedimientos con la masa y el número de moscas (23 moscas con un peso total de 14,9 mg), el consumo deO2 para el grupo en esta cámara fue de 3,19 mL h-1 g-1 o 2,07 μL h-1 mosca-1.
El equipo se puede configurar fácilmente, con un mínimo de capacitación, y funciona de manera confiable durante muchos ciclos de montaje y apagado. No obstante, el equipo debe ser mantenido e inspeccionado regularmente, y las condiciones experimentales deben ser controladas cuidadosamente. Por ejemplo, la pérdida de un sello hermético al gas, debido a la falla de una junta o llave de paso, puede conducir a ciclos de presurización rápidos y a un VO2 espuriamente alto (Figura 3B). Además, la temperatura y la humedad deben permanecer estables dentro de la cámara. Si la temperatura o la humedad disminuyen, la caída de presión resultante se interpretará erróneamente como un consumo deO2. Por el contrario, la deriva ascendente de la temperatura o la humedad contrarrestará la disminución de la presión causada por el consumo de O2 y reducirá o eliminará artificialmente la señal de VO2 (Figura 3C).
El método se utilizó para probar VO2 de mutantes CASKΔ18, que se generaron por escisión imprecisa de un elemento transponible del locus 14 de CASK y en el que la locomoción se reduce drásticamente14,16. En los controles w(ex33) de tipo salvaje, generados por escisión precisa del elemento transponible, el consumo medio de O2 específico de masa fue de 3,65 ± 0,24 mL·g-1·h-1 (n = 16 cámaras; Figura 4A).
A pesar de su locomoción visiblemente reducida, el VO2 de los mutantes CASKΔ18 fue ligeramente inferior pero no significativamente al de los controles (media ± s.e.m.= 3,23 ± 0,13 mL·g-1·h-1; n = 11 grupos; P = 0,08 Prueba U de Mann-Whitney).
Debido a que la validez de la expresión de la tasa metabólica en términos de masa corporal ha sido cuestionada18, el consumo deO2 también fue analizado por mosca (Figura 4B). Utilizando este análisis, el VO2 se redujo significativamente en CASKΔ18 en comparación con los controles de tipo salvaje (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·h-1; BARRICAΔ18: 1,58 ± 0,10 μL·fly-1·h-1; P = 0,0003, prueba u de Mann-Whitney). Sin embargo, la masa media de las moscas CASKΔ18 fue un >20% inferior a la de los controles ex33 (Figura 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; BARRILΔ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, prueba u de Mann-Whitney), por lo que la diferencia en la tasa metabólica entre genotipos se debe probablemente a la diferencia en sus tamaños.
Figura 1: Configuración del respirómetro . (A) Diagrama del enchufe del sensor (arriba) y la cámara de 50 ml (que consta de un tubo Schlenk de 50 ml, abajo) antes del montaje. Tenga en cuenta las ubicaciones de las juntas de vidrio esmerilado 19/22 que conectarán la cámara y el enchufe del sensor, y que deben limpiarse antes de cada experimento. También se indica la llave de paso, que es necesaria para abrir o sellar la cámara. (B) Diagrama de la cámara y los componentes, ensamblados y listos para el experimento, que muestran: rollo de algodón húmedo, tubo de polipropileno que contiene moscas, taponado con un tapón de algodón, cartucho de cal sosa y generador deO2 lleno de CuSO4. (C) Fotografía de la cámara ensamblada. La abrazadera Keck que sujeta el tapón a la cámara está parcialmente oscurecida por la abrazadera del soporte de anillo que sostiene la cámara. (D) Fotografía del controlador que muestra el interruptor que controla la corriente a través del generador de O2 y la ventana para ver la pantalla OLED. (E) Cámaras ensambladas en baño de agua. Se muestran siete cámaras, tres de las cuales contienen mutantes, tres con controles de tipo salvaje y una cámara que contiene todos los componentes excepto moscas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de adquisición de datos. (A) Interfaz PuTTY para seleccionar el puerto serie para la adquisición de datos. Se ha seleccionado COM3, con una velocidad de transmisión de 9600 para que coincida con la salida del controlador. (B) Interfaz PuTTY para configurar el archivo de registro. Se selecciona "Salida imprimible" para permitir el registro de datos en un archivo de texto, se selecciona la carpeta de datos con el botón "Examinar" y se crea un nombre de archivo. (C) Archivo de registro PuTTY durante un experimento. Los datos se adquieren aproximadamente dos veces por segundo y cada línea contiene la siguiente información delimitada por comas: número de sensor, tiempo (ms) desde el inicio de la adquisición, temperatura de la cámara (°C), presión de la cámara (hPa), humedad (porcentaje relativo) y corriente (mA). (D) Registro de datos durante un experimento típico, con siete ventanas para cámaras experimentales, más un canal que registra la temperatura del baño, la temperatura del aire ambiente, la presión y la humedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos del microrrespirómetro. (A) Presión (línea gris, eje izquierdo) y corriente a través del generador de O2 (línea negra, eje derecho) en una sola cámara del respirómetro que contiene 23 moscas w(ex33). Al principio, se requiere un pulso de corriente largo para presurizar la cámara desde ~992 hPa hasta el umbral OFF de 1017 hPa. A medida que las moscas consumían O2, la presión disminuyó hasta alcanzar el umbral de ON de 1016 hPa, lo que activó la corriente a través del generador deO2, que volvió a presurizar la cámara a 1017 hPa. El proceso se repitió seis veces en este experimento. (B) Un ejemplo de una cámara con fugas causada por una llave de paso dañada, tomada de una serie diferente de experimentos. La cámara no pudo mantener la presión (línea gris), lo que resultó en un ciclo constante de corriente electrolítica (línea negra). Obsérvese una escala de tiempo diferente a la del panel A. (C) Efecto de la deriva en la humedad. El consumo de O2 por parte de la mariquita (Hippodamia convergens) de 20 mg en la cámara debería haber producido un patrón cíclico de presión similar al de la Figura 3A, pero el aumento constante de la humedad (línea negra) provocó un aumento artificial de la presión de la cámara (línea gris) que enmascaró el VO2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Datos cuantitativos de D. melanogaster, mutante salvaje y de la hembra de la hembra. (A) VO2 específico de la masa para moscas de tipo salvaje (w(ex33)) y mutantes (CASKΔ18). En todas las parcelas, la parte inferior y superior de las cajas indican el primer y tercer cuartil, respectivamente, los bigotes indican valores extremos, y los tamaños de las muestras (número de cámaras, cada una de las cuales contiene entre 17 y 24 moscas) se indican entre paréntesis sobre los genotipos. Las moscas CASK Δ18 no son estadísticamente significativas de ex33 (mediana: ex33: 3.420 mL·g-1·h-1, CASKΔ18 : 3.029 mL·g-1·h-1; p = 0.08 prueba U de Mann-Whitney). (B) VO2 específico de la mosca. Las moscas CASK Δ18consumieron significativamente menosO2 (mediana 1.650 mL·fly-1·h-1) que w(ex33) (2.078 mL·fly-1·h-1; p = 0.0003, prueba u de Mann-Whitney; significación indicada por asteriscos). (C) La masa difirió entre el CASKΔ18 y el tipo salvaje (mediana: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, prueba u de Mann-Whitney; significación indicada por asteriscos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Estudio de los datos de la respirometría de Drosophila de moscas salvajes a 25 °C. Con una excepción18, los estudios se limitan a los que miden el consumo deO2 . En la mayoría de los casos, fue necesario estimar el VO2 a partir de gráficos, y se proporcionan números de figuras de los artículos originales. Aunque todos los genotipos se consideraban "salvajes", las fuentes y los métodos de propagación variaban. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El procedimiento anterior demuestra la medición del consumo deO2 en D. melanogaster utilizando un microrespirómetro coulométrico electrónico. Los datos resultantes para el consumo deO2 en D. melanogaster de tipo silvestre estuvieron dentro de los rangos descritos en la mayoría de las publicaciones previas utilizando diversos métodos (Tabla 1), aunque algo más bajos que los reportados por otros 3,6.
Los pasos críticos abordaron los dos requisitos absolutos del método: el sellado hermético al gas y la estabilidad ambiental. Mantener un ambiente hermético al gas es sencillo, pero requiere cuidado. Los matraces y tubos Schlenk son ideales como cámaras de respirometría. La construcción de vidrio evita la permeabilidad a los gases presente en muchos tipos de plástico19, lo que es especialmente crítico en experimentos prolongados. Las uniones estándar permiten conexiones herméticas al gas con los enchufes que contienen los sensores y las conexiones electrónicas. Las llaves de paso proporcionan sellos fiables y pueden abrirse o cerrarse según sea necesario durante los experimentos. Para garantizar sellos herméticos al gas para cada experimento, se inspeccionaron las llaves de paso, se limpiaron a fondo las juntas, se aplicaron cantidades juiciosas de grasa de silicona limpia y se aseguraron las juntas con abrazaderas Keck.
La sensibilidad del método está limitada por la estabilidad de la temperatura y la humedad dentro de la cámara. Los cambios en cualquiera de los parámetros darán lugar a fluctuaciones de presión que interfieren con la señal de VO2 . El uso de una cámara ambiental12 o un baño de agua circulante proporciona un control de temperatura más estable. Trabajos anteriores de otros han demostrado que el método puede medir el consumo deO2 al nivel de nmol·h-1 cuando la temperatura se mantiene dentro de ±0,01 °C20. Para estabilizar la humedad, los trozos de rollo de algodón sumergidos en agua mantuvieron la humedad en casi el 100%. Se permitió que la temperatura y la humedad se estabilizaran durante al menos 90 minutos antes de que las cámaras se presurizaran con O2 generado electrolíticamente y comenzaran las grabaciones. Todos los experimentos incluyeron una cámara que se ensambló con todos los componentes pero que no contenía moscas, con el fin de monitorear las condiciones ambientales.
Controlar constantemente la temperatura, la presión y la humedad con regularidad simplifica enormemente la resolución de problemas. Por ejemplo, se pudo detectar y corregir el VO2 aparente artificialmente alto causado por una llave de paso dañada (Figura 3B) o la pérdida aparente deVO2 debido a la humedad inestable de la cámara (Figura 3C).
El microrrespirómetro coulométrico descrito aquí tiene varias ventajas. En primer lugar, es relativamente económico, con un coste total aproximado de 100 dólares por canal (que comprende la cámara, el sensor y el controlador). En segundo lugar, debido a que cada canal adquiere y transmite datos de forma independiente, el sistema es escalable, con el número de cámaras solo limitado por el tamaño del controlador ambiental (baño de agua o cámara ambiental) y el número de puertos USB disponibles en la computadora (generalmente ampliable a >100). Además, debido a que las cámaras y los controladores son independientes, la falla de cualquiera de ellos no afectará a los demás. En tercer lugar, los controladores se pueden reprogramar fácilmente para adaptarse a la presión ambiental o para ajustar la sensibilidad según sea necesario. En relación con esto, la presión dentro de las cámaras se establece en un valor fijo, por lo que la presión experimental será constante en todos los experimentos, independientemente de la presión barométrica ambiental. En cuarto lugar, el flujo constante de datos sobre el tiempo, la temperatura, la presión, la humedad y la corriente permite un análisis detallado de estos parámetros para cada cámara, lo que facilita la resolución de problemas o el análisis de los cambios temporales en el VO2 en experimentos más largos. Finalmente, las condiciones ambientales dentro de la cámara se pueden mantener a un nivel constante durante muchas horas o días, porque el O2 consumido se reemplaza continuamente. En el presente estudio, la presión de la cámara fluctuó de 1016 a 1017 hPa, que es inferior al 0,1%, siendo la variación resultante en el PO2 inferior al 0,5%. Sobre la base de la cantidad deCuSO4 en cada generador de O2, que puede generar 28 mL de O2, y el VO2 promedio de los grupos de moscas en este estudio, 1,15 mL/día (media =21,8 moscas por cámara), se puede estudiar la tasa metabólica hasta por 24 días a la vez. Suponiendo que las moscas reciban una nutrición adecuada, esto significa que el metabolismo se puede estudiar continuamente durante la mayor parte de la vida útil de una mosca.
En la actualidad, la mayoría de los estudios del metabolismo en D. melanogaster se basan en análisis de gases o manometría. Los métodos que se basan en el análisis de gases, como los respirómetros de flujo continuo y de flujocontinuo 2,3,6, tienen la ventaja de que el método está bien establecido y el equipo está disponible comercialmente. Sin embargo, requieren equipos costosos y complejos, incluidos colectores y sensores de flujo molecular para regular el flujo, y analizadores de gas para medir las concentraciones de gas. Alternativamente, los manómetros simples9 son mucho menos costosos. En la forma más simple, comúnmente utilizada para D. melanogaster, las moscas se anestesian y se colocan en una pequeña cámara que contiene material absorbente de CO2 y que está conectada a un depósito de líquido por un tubo capilar. A medida que se consume O2 y se absorbe elCO2 resultante, la presión cae en la cámara, lo que atrae el líquido hacia el tubo capilar. La altura del fluido es entonces proporcional a la cantidad deO2 consumida. Debido a que el O2 consumido no se reemplaza durante el experimento, el PO2 disminuye continuamente en el transcurso del experimento. Aunque es posible que los experimentos de rutina no reduzcan el P O2 lo suficiente como para afectar negativamente al V O2, los experimentos prolongados o los experimentos a temperaturas elevadas podrían agotar el O2 y alcanzar el P O2 crítico en el que el V O2 disminuye bruscamente3. Otro problema es que el peso del fluido en el capilar ejerce una fuerza hacia abajo, reduciendo la altura del fluido en proporción a la fuerza hacia abajo ejercida, lo que resulta en posibles errores. Se han descrito métodos para compensar este efecto 4,21, pero son engorrosos y de uso generalizado. La comparación directa del análisis de gases y la manometría indicó que los dos métodos produjeron resultados significativamente diferentes, pero los autores no pudieron producir una explicación satisfactoria para la discrepancia22.
A pesar de sus ventajas, el microrrespirómetro coulométrico también tiene limitaciones. En primer lugar, a diferencia de algunos sistemas de análisis de gases de flujo de parada, no está disponible comercialmente. Los componentes son fáciles de adquirir y ni el diseño ni la programación son complicados, pero es potencialmente más complejo de construir que los sistemas manométricos simples9. En segundo lugar, la adquisición de datos precisos debe incluir múltiples ciclos de generación deO2 , por lo que cada experimento debe durar varias horas. Lo mismo ocurre con los experimentos que utilizan manometría. Por último, al igual que la manometría, la temperatura y la humedad en el interior de las cámaras deben ser estables. No obstante, el microrrespirómetro coulométrico ofrece un término medio en cuanto a coste y complejidad, es robusto y fiable una vez montado, y mide con precisión el consumo deO2 .
Los experimentos con mutantes CASKΔ18 demuestran resultados negativos (V O2 específico de masa) y positivos (VO2 específico de mosca). Si la reducción del >50% en la marcha de los mutantes CASKΔ18fuera el resultado de un metabolismo comprometido, se podría predecir que el VO2 se reduciría en una cantidad similar. Sin embargo, el cambio en el consumo de O2 específico de la masa fue modesto (reducción del 9,6 % en la mediana de VO2) y no fue estadísticamente significativo. Este resultado negativo es consistente con que los mutantes CASKΔ18 tienen un metabolismo relativamente normal, con el fenotipo conductual resultante de la disminución del impulso locomotor. Aunque es posible que el método carezca de suficiente sensibilidad, la reducción de VO2 causada por una diferencia relativamente pequeña en el tamaño (reducción del 15,5% en la masa mediana) fue altamente significativa.
Caminar se asocia con un aumento significativo del gasto energético 5,23, entonces, ¿por qué el VO2 es relativamente normal en los mutantes de CAST? Es posible que el acicalamiento excesivo en los mutantes CASK16 pueda contrarrestar la reducción de la marcha, o que el fenotipo de la marcha sea menos evidente cuando las moscas se prueban en grupos en pequeños tubos, pero estas hipótesis están a la espera de la verificación experimental. Sin embargo, concluimos que las mutaciones en el locus CASK no tienen efectos fuertes y directos sobre el metabolismo, y que el microrrespirómetro coulométrico es una herramienta eficaz para estudiar el metabolismo en D. melanogaster.
Debido a que este aparato se construye fácilmente a partir de componentes comunes, mide el consumo deO2 con precisión, es altamente portátil, se puede usar en cualquier ambiente con temperatura estable y se ha utilizado con organismos tan pequeños como moscas de 0,5 mg (el presente estudio) y tan grandes como escorpiones de 500 mg (DJS no publicado), agrega una herramienta versátil para estudiar el metabolismo de diversos organismos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a la Dra. Linda Restifo de la Universidad de Arizona por sugerir probar el consumo de O2 de los mutantes CASK y por enviar los mutantes CASK y sus controles congénitos. Las tarifas de publicación fueron proporcionadas por el Fondo Departamental de Reinversión del Departamento de Biología de la Universidad de College Park. El espacio y algunos equipos fueron proporcionados por las Universidades de Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
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