זברהפיש אלקטרוקרדיוגרפיה (א.ק.ג): מבחנים זעיר פולשניים להערכת תפקוד הלב

Overview

סרטון זה מראה כיצד לבצע מדידות אלקטרוקרדיוגרפיה (א.ק.ג. או אק"ג), בדיקה המודדת את הפעילות החשמלית של הלב, על דג זברה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך זאו ואח ', ב ויוו פני השטח אלקטרוקרדיוגרפיה עבור זברה-פיש למבוגרים, J. Vis. Exp. (2019).

כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים של בעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים של UCLA.

1. אינדוקציה להרדמה

1. הכן הרדמה טבילה עבור בקרת כאב ושיתוק דגים, כדי למנוע חפצי תנועה במהלך רכישת נתוני א.ק.ג. רוב המעבדות משתמשות בטריקיין טבילה (אתיל 3-אמינובנזואט מתנסולפונט, MS-222).
   1. כדי להפוך את פתרון המניה של הטריקאין 0.4%, שלבו את הפריטים הבאים בבקבוק זכוכית כהה עם כתר בורג: 400 מ"ג אבקת טריקאין, 98 מ"ל מים מזוקקים כפולים ו-2 מ"ל של 1 M Tris (pH 9). יש להתאים ל-pH 7.0 באמצעות N NaOH אחד או 1 N HCl לפי הצורך.
   2. כדי להפוך את פתרון הטבילה הסופי tricaine, לקבוע את הריכוז המינימלי המתאים לגיל זברה, גודל, מצב מטבולי, זן, מודל מחלה, מטרות מדעיות, ומשך פרוצדורלי.
   3. בצע מחקר תגובת ריכוז tricaine, titrating למעלה או למטה מן הריכוז המומלץ של 168 מ"ג / ליטר (או 0.0168%)⁹במידת הצורך, כדי להגיע לרמה 4 של הרדמה בתוך 3 דקות עם הרעילות קרדיו-השראה המעטה ביותר האפשרי. לדוגמה, במחקר זה, טבילה של סוג פראי AB זברה של 12-18 חודשים של גיל לתוך 0.02-0.04% פתרון tricaine יגרום רמה 4 של הרדמה בתוך 3 דקות.
      שים לב: ברמה 4 של הרדמה, שיווי משקל ותונוס שרירים הולכים לאיבוד לחלוטין וקצב התנועה האופרקולרית מצטמצם.
   4. במידת הצורך, יש להתייעץ עם הוטרינר בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) לקבלת הדרכה נוספת לגבי ההתאמה של בחירת ההרדמה ומסלול הניהול.
2. טבלו דג זברה בוגר בצלחת המכילה תמיסת טריקאין של הריכוז הנמוך ביותר שנקבע מראש ומאושר על ידי IACUC (למשל, 0.02-0.04% במחקר זה) כדי לגרום לרמה 4 של הרדמה בתוך 3 דקות (איור 1).
   1. להישרדות פרוטוקול א.ק.ג., שמרו על הקלטת א.ק.ג. קצרה ככל האפשר (פחות מ-10 דקות). עבור הפעלות הקלטה קצרות של א.ק.ג. שנמשכות פחות מ-15 דקות, אין צורך בתחזוקת הרדמה.
   2. במשך מפגשי הקלטה ארוכים של א.ק.ג. שנמשכים שעות, יש להשתמש בשיתוק תוך שרירי ארוך טווח ובמערכת זלוף אוראלית כדי לספק לחות וחמצון בשפע.

2. מיקום הפניות א.ק.ג.

1. ברגע שדגי הזברה שומרים על רמה 4 של הרדמה למשך 3 שניות, השתמשו בזוג מלקחיים קהים כדי להעביר את הדג מידאל חריץ הספוג הלח עם המשטח הגחוני העליון שלו למיקום אלקטרודות עופרת א.ק.ג .
2. הכנס בעדינות את שלוש האלקטרודות המובילות של א.ק.ג. לתוך שרירי הדגים לעומק של כ-1 מ"מ כדי ליצור עופרת דו-קוטבית במישור הקדמי המקבילה לכיוון הגולגולתי השמאלי-קאודל-ימני של הציר הראשי של הלב.
3. מקמו את האלקטרודה החיובית (האדומה) בקו האמצע הגחוני ברמה של עורק הבולבוס, כלומר, ב-1.2 מ"מ מעל קו דמיוני המחבר בין שני הקצוות התחתונים של האופרקולומים (איור 2A).
4. מקמו את האלקטרודה השלילית (השחורה) caudally ו- 0.5-1.0 מ"מ שמאלה לרוחב לאלקטרודה החיובית, במרחק גדול יותר מהאורך המקסימלי של חדר הזברה הבוגר (איור 2A).
5. מקם את ההתייחסות (ירוקה) אלקטרודה caudally, ליד האזור אנאלי.
   שים לב: מאז הציר הראשי הלב משתנה במקצת מדגים לדגים, כדי למקסם את משרעת גל R ו- T, להתאים את עמדות העופרת על ידי ביצוע שינויים קטנים ושיטתיים בלבד באמצעות ניסוי וטעייה. לדוגמה, לשנות אלקטרודה אחת (חיובית או שלילית), במקום שתי האלקטרודות, בכל פעם ולבצע שינויים הדרגתיים בכיוון מסוים אחד לפני שינוי לכיוון אחר במקום לבצע שינויים בלתי יציבים בכיוונים אקראיים.

3. הקלטת א.ק.ג.

1. פתח את תוכנית רכישת הנתונים של א.ק.ג. בחרו הגדרה רצויה מהתפריטים הנפתחים לטווח, למעבר נמוך ולפס גבוה. לדוגמה, ההגדרה הבאה במערכת ההקלטה in vivo ECG המשמשת בניסוי זה מניבה יחס איתות לרעש עקבי ומשביע רצון עבור זברה-דג בוגר רגיל: טווח "2 mV", מעבר נמוך "120 הרץ" ומעבר גבוה "0.03 s".
2. לחץ על התחל כדי להתחיל בהקלטת א.ק.ג. נטולת רווחים רציפה בקצב דגימה של 1 kHz.
3. כדי למטב את מיקום ההפניות ליחס מרבי בין אות לרעש, לחץ על עצור כדי להפסיק את הקלטת ה- ECG ולסקור את מעקב ה- ECG זמן קצר לאחר ניסיון ההקלטה הראשון עבור כל לב. כדי לאבחן ש- ECG של דג זברה בוגר הוא נורמלי, ודא שכל ארבעת הקריטריונים הבאים לאימות מתקיימים (איור 3):
   1. קריטריון 1: ודא שכל צורות הגל של ה- ECG (P, QRS ו- T) שונות וגלויות בקלות.
   2. קריטריון 2: ודא שגל ה-P חיובי.
   3. קריטריון 3: ודא כי קומפלקס QRS נטו הוא חיובי (כלומר משרעת גל R הוא גדול יותר מסכום משרעת גל Q ו- S).
   4. קריטריון 4: ודא שגל ה-T חיובי.
4. אם צפוי אק"ג רגיל, מקם מחדש את האלקטרודות (נסה תחילה את האלקטרודה השלילית) במידת הצורך, עד שכל ארבעת הקריטריונים לאימות יתקיימו.
5. אם צפוי גל T רגיל, אך גל ה- T קטן מדי, מקם מחדש את האלקטרודות כדי למקסם את משרעת גלי T.
6. חדש הקלטת א.ק.ג. לאחר מיטוב מיקום ההפניה. שמור את מטאטא א.ק.ג. לניתוח הבא.

4. התאוששות מהרדמה

1. בסוף הקלטת א.ק.ג. יש להסיר בזהירות את האלקטרודות מבלי לפגוע בדגים. מעבירים את הדגים למים טריים ומחמצן ללא טריקאין.
2. כדי להקל על ההתאוששות מהרדמה, להשפריץ מים על הזימים במרץ עם פיפטה פסטר עד הדגים מחדשת תנועת גיל רגילה או שחייה.
3. לפקח על הדגים להתאוששות מלאה מהרדמה (בדרך כלל 1-2 דקות), כפי שצוין על ידי יכולת הדג לשחות זקוף לפחות 5 s.

Representative Results

איור 1: פרוטוקול הקלטה פולשני מינימלי בפרוטוקול ההקלטה vivo ECG. תרשים זרימה סכמטי ממחיש ארבעה שלבי פעולה קריטיים בניהול חקירת א.ק.ג. in vivo: לגרום להרדמה, למקם אלקטרודות עופרת א.ק.ג., להקליט א.ק.ג ולנתח את הקלטות ה-ECG. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקום הפניות א.ק.ג. שלוש אלקטרודות נירוסטה מקודדות בצבע של 29 מד מוחדרות בבטחה לתוך שריר הדגים לעומק של כ-1 מ"מ. מיקום האלקטרודה השלילית (השחורה) והאלקטרודה החיובית (האדומה) יוצר עופרת דו-קוטבית במישור הקדמי, לאורך כיוון גולגולתי שמאלי עד ימני. קיצור: שופט, אלקטרודה התייחסות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אנטומיה מנוגדת וא.ק.ג. של לבבות אנושיים ודגי זברה. בניגוד ללב האנושי עם שתי אטריה ושני החדרים, ללב הזברה יש רק אטריום אחד וחיתול אחד (שורה עליונה). קיצורים: RA, אטריום ימני; לוס אנג'לס, אטריום שמאלי; קרוואן, החדר הימני; LV: החדר השמאלי. לב הזברה חולק מספר תכונות א.ק.ג. נפוצות עם הלב האנושי (שורה תחתונה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222