제브라피시 전기장검사(ECG): 심장 기능을 평가하는 최소 침습적 분석

Overview

이 비디오는 제브라피시에서 심장의 전기 적 활동을 측정하는 테스트인 전자장 검사(ECG 또는 EKG) 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 자오 외에서발췌, 성인 얼룩말 물고기에 대한 Vivo 표면 전기 검사, J. Vis. Exp. (2019).

이 연구결과에 있는 모든 실험은 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 미국 국립 학회에 따라 실시되었습니다. 이 연구의 모든 동물 프로토콜은 UCLA 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 마취 유도

1. 심전도 데이터 수집 중 모션 아티팩트를 피하기 위해 통증 제어 및 물고기 고정을 위한 침수 마취를 준비합니다. 대부분의 실험실은 침수 트리카인 (에틸 3-아미노 벤조아테 메탄술포네이트, MS-222)를 사용합니다.
   1. 트리카인 0.4% 스톡 용액을 만들기 위해 스크류 로카인 파우더 400 mg, 이중 증류수 98mL, M Tris 1m Tris(pH 9)의 2mL 등 나사로 덮인 다크 글래스 병에 다음 품목을 결합합니다. 필요에 따라 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 사용하여 pH 7.0에 적응하십시오.
   2. 트리카인 최종 침수 용액을 만들기 위해, 제브라피시 나이, 크기, 대사 상태, 변형, 질병 모델, 과학적 목표 및 절차 기간에 적합한 최소 농도를 결정합니다.
   3. 트리카인 농도 반응 연구를 수행, 권장 농도에서 위 또는 아래로 적시 168 mg/L (또는 0.0168%)⁹필요 하면, 내 이내에 마취의 레벨 4달성 3 분 이내에 가능한 심장 호흡 독성. 예를 들어, 본 연구에서는, 12-18개월의 야생형 AB 제브라피쉬를 0.02-0.04% 트리카인 용액으로 침수하면 3분 이내에 마취 레벨 4를 유도할 것이다.
      참고: 마취의 레벨 4에서 평형과 근육 톤은 완전히 손실되고 안구 이동 속도가 감소됩니다.
   4. 필요한 경우 마취제 선정및 행정 경로의 적절성에 대한 추가 지침을 위해 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 수의사와 상의하십시오.
2. 성인 얼룩말생선을 가장 낮은 소정의 및 IACUC 승인 농도(예: 본 연구에서 0.02-0.04%)의 트리카인 용액을 함유한 접시에 담그고 3분 이내에 마취레벨 4를 유도한다(그림1).
   1. 생존 심전도 프로토콜의 경우 심전도 기록 세션을 가능한 한 짧게 유지하십시오(10분 미만). 15분 미만지속되는 간단한 심전도 녹음 세션의 경우 마취 유지 관리가 필요하지 않습니다.
   2. 긴 심전도 녹음 세션 지속 시간 동안, 충분한 수분과 산소를 제공하기 위해 장작동 근육 내 마비 및 구강 관류 시스템을 사용합니다.

2. 심전도 리드 배치

1. 제브라피쉬가 3s에 대한 마취 레벨 4를 유지하면, 심전도 납 전극(그림2)의배치를 위해 복부 표면 상단이 있는 축축한 스폰지 슬릿에 즉시 물고기를 옮기기 위해 무딘 집게 쌍을 사용한다.
2. 3개의 심전도 납 전극을 물고기 근육에 약 1mm 깊이로 부드럽게 삽입하여 심장 주축의 왼쪽 코골-오른쪽 두개골 방향을 평행하게 하는 전두엽 평면에서 양극성 납을 확립한다.
3. 구근 동맥의 수준에서 복부 중진선에 양성(적색) 전극을 배치, 즉, 1-2mm에서 오퍼쿨럼의 두 개의 하부 가장자리를 연결하는 가상선위에(도 2A).
4. 음수(black) 전극을 소경및 0.5-1.0 mm를 양극에 측면으로 남겨두고, 성인 제브라피시 심실의 최대 양봉 길이보다 더 큰거리에서(도 2A)를배치한다.
5. 항문 영역 근처에 참조(녹색) 전극을 caudally 배치합니다.
   참고: 심장 주요 축은 물고기마다 다소 다르기 때문에 R 및 T 파 진폭을 최대화하기 위해 시행 착오를 통해 작고 체계적인 변화만으로 리드 위치를 조정합니다. 예를 들어, 한 번에 전극 이아닌 하나의 전극(양수 또는 음수)을 변경하고 임의방향으로 불규칙하게 변경하는 대신 다른 방향으로 변경하기 전에 지정된 방향으로 점진적으로 변경합니다.

3. 심전도 녹음

1. ECG 데이터 수집 프로그램을 엽니다. 범위, 로우 패스 및 하이 패스에 대한 드롭다운 메뉴에서 원하는 설정을 선택합니다. 예를 들어, 본 실험에 사용되는 생체 내 심전도 기록 시스템에서 다음 설정은 일반 성인 제브라피시에 대해 일관되고 만족스러운 신호 대 잡음 비율을 산출합니다: 범위 "2 mV", 로우 패스 "120 Hz", 하이 패스 "0.03 s".
2. 프레스 시작하여 1kHz의 샘플링 속도로 연속 갭 없는 심전도 기록을 시작합니다.
3. 최대 신호 대 노이즈 비율에 대한 리드 포지셔닝을 최적화하려면 중지를 눌러 심전도 기록을 중지하고 각 심장에 대한 첫 번째 녹음 시도 직후 ECG 추적을 검토하십시오. 성인 제브라피시 심전도가 정상임을 진단하기 위해 다음 4가지 유효성 검사 기준이 모두 만족되는지 확인합니다(그림3):
   1. 기준 1: 모든 심전도 파형(P, QRS 및 T)이 뚜렷하고 쉽게 볼 수 있는지 확인합니다.
   2. 기준 2: P 웨이브가 양수인지 확인합니다.
   3. 기준 3: 그물 QRS 복합체가 양수인지 확인합니다(즉, R 파진폭은 Q 및 S 파 진폭의 합보다 큽니다).
   4. 기준 4: T 웨이브가 양수인지 확인합니다.
4. 일반 심전도가 예상되는 경우, 4개의 유효성 검사 기준이 모두 충족될 때까지 필요한 경우 전극(음극을 먼저 시도)을 재배치합니다.
5. 통상의 T파가 예상되지만 T파가 너무 작으면 전극을 재배치하여 T 파 진폭을 극대화합니다.
6. 리드 포지셔닝을 최적화한 후 심전도 기록을 다시 시작합니다. 후속 분석을 위해 심전도 스윕을 저장합니다.

4. 마취회복

1. 심전도 기록 세션이 끝나면 물고기를 손상시키지 않고 전극을 조심스럽게 제거하십시오. 트리카인이 없는 신선한 산소가 공급되는 생선물로 생선을 옮기.
2. 마취에서 회복을 용이하게하기 위해 물고기가 정기적으로 아가미 운동이나 수영을 재개 할 때까지 파스퇴르 파이펫으로 아가미 위에 물을 적극적으로 분출하십시오.
3. 적어도 5 s에 대 한 똑바로 수영 하는 물고기 능력에 의해 표시 된 마취에서 전체 복구에 대 한 물고기를 모니터링 (일반적으로 1-2 분), 적어도 5 s에 대 한 똑바로 수영 하는 물고기 능력에 의해 표시.

Representative Results

그림 1: 생체 내 심전도 기록 프로토콜에서 최소 침습. 회로도 흐름 차트는 생체 내 심전도 심문을 수행하는 네 가지 중요한 행동 단계를 보여 줍니다: 마취 유도, 심전도 납 전극 배치, ECG 기록 및 심전도 기록을 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 심전도 리드 배치. 29게이지 컬러 로코딩된 스테인리스 스틸 전극 3대가 어류 근육에 약 1mm 깊이로 단단히 삽입됩니다. 음수(검정) 전극과 양극(적)의 배치는 오른쪽 두개골 방향으로 왼쪽 코달을 따라 정면 평면에서 양극성 리드를 확립한다. 약어 : 참조, 참조 전극. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 인간과 제브라피시 하트의 해부학과 심전도를 대조합니다. 두 개의 아트리아와 두 개의 심실이있는 인간의 심장과는 달리, 제브라피쉬 심장은 하나의 아트리움과 하나의 심실 (상단 행)을 가지고 있습니다. 약어: RA, 오른쪽 아트리움; LA, 왼쪽 아트리움; RV, 오른쪽 심실; LV: 좌심실. 제브라피쉬 심장은 인간의 심장(맨 아래 줄)과 몇 가지 일반적인 심전도 특징을 공유합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222