Elettrocardiografia Zebrafish (ECG): un saggio minimamente invasivo per valutare la funzione cardiaca

Overview

Questo video mostra come eseguire misurazioni dell'elettrocardiografia (ECG o EKG), un test che misura l'attività elettrica del cuore, su un pesce zebra.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp.

Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti in conformità con la Guida nazionale della salute degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti i protocolli sugli animali in questo studio sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'UCLA.

1. Induzione dell'anestesia

1. Preparare l'anestesia ad immersione per il controllo del dolore e l'immobilizzazione dei pesci per evitare artefatti di movimento durante l'acquisizione dei dati ECG. La maggior parte dei laboratori utilizza tricaina ad immersione (etile 3-amminobenzoato metanosolfonato, MS-222).
   1. Per rendere la soluzione di stock di tricaina allo 0,4%, unire i seguenti articoli in una bottiglia di vetro scuro con tappo a vite: 400 mg di polvere di tricaina, 98 ml di acqua distillata doppia e 2 ml di 1 M Tris (pH 9). Regolare a pH 7.0 utilizzando 1 N NaOH o 1 N HCl in base alle esigenze.
   2. Per rendere la soluzione di immersione finale della tricaina, determinare la concentrazione minima appropriata per l'età, le dimensioni, lo stato metabolico, lo stato metabolico, il ceppo, il modello di malattia, gli obiettivi scientifici e la durata procedurale.
   3. Eseguire uno studio di concentrazione-risposta alla tricaina, titrando verso l'alto o verso il basso dalla concentrazione raccomandata di 168 mg/L (o 0,0168%)⁹se necessario, per raggiungere il livello 4 di anestesia entro 3 minuti con il minor numero possibile di tossicità cardiorespiratoria. Ad esempio, in questo studio, l'immersione del pesce zebra AB di tipo selvatico di 12-18 mesi di età in una soluzione di tricaina allo 0,02-0,04% indurrà il livello 4 di anestesia entro 3 minuti.
      NOTA: Al livello 4 dell'anestesia, l'equilibrio e il tono muscolare sono completamente persi e la velocità di movimento opercolare è ridotta.
   4. Se necessario, consultare il veterinario del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) per ulteriori indicazioni sull'adeguatezza della selezione degli anestetici e della via di somministrazione.
2. Immergere un zebrafish adulto in un piatto contenente soluzione di tricaina della concentrazione predeterminata più bassa e approvata dalla IACUC (ad esempio, 0,02-0,04% in questo studio) per indurre il livello 4 di anestesia entro 3 minuti(Figura 1).
   1. Per il protocollo ECG di sopravvivenza, mantenere la sessione di registrazione ECG il più breve possibile (meno di 10 minuti). Per brevi sessioni di registrazione ECG della durata inferiore a 15 minuti, la manutenzione dell'anestesia non è necessaria.
   2. Per lunghe sessioni di registrazione ECG della durata di ore, utilizzare un paralitico intramuscolare ad azione lunga e un sistema di perfusione orale per fornire un'ampia idratazione e ossigenazione.

2. Posizionamento del piombo ECG

1. Una volta che il pesce zebra mantiene il livello 4 di anestesia per 3 s, utilizzare un paio di forcella smussate per trasferire immediatamente il pesce sulla fessura della spugna umida con la sua superficie ventrale più in alto per il posizionamento degli elettrodi di piombo ECG(Figura 2).
2. Inserire delicatamente i tre elettrodi di piombo ECG nella muscolatura del pesce a circa 1 mm di profondità per stabilire un piombo bipolare nel piano frontale che parallela all'orientamento cranicio sinistro caudale-destro dell'asse principale cardiaco.
3. Posizionare l'elettrodo positivo (rosso) nella linea mediana ventrale a livello del bulbus arteriosus, cioè a 1-2 mm sopra una linea immaginaria che collega i due bordi inferiori degli opercoli(Figura 2A).
4. Posizionare l'elettrodo negativo (nero) caudally e 0,5-1,0 mm lasciato lateralmente all'elettrodo positivo, a una distanza maggiore della lunghezza massima apicobasale del ventricolo di zebrafish adulto (Figura 2A).
5. Posizionare l'elettrodo di riferimento (verde) caudally, vicino alla regione anale.
   NOTA: Poiché l'asse principale cardiaco varia in qualche modo da pesce a pesce, per massimizzare le ampiezze delle onde R e T, regolare le posizioni di piombo apportando solo piccoli cambiamenti sistematici attraverso tentativi ed errori. Ad esempio, cambiare un elettrodo (positivo o negativo), invece di entrambi gli elettrodi, alla volta e apportare cambiamenti graduali in una direzione specificata prima di passare a un'altra direzione invece di apportare cambiamenti erratici in direzioni casuali.

3. Registrazione ECG

1. Aprire il programma di acquisizione dati ECG. Selezionare un'impostazione desiderata dai menu a discesa per intervallo, passaggio basso e passaggio alto. Ad esempio, la seguente impostazione nel sistema di registrazione ECG in vivo utilizzato in questo esperimento produce un rapporto segnale-rumore coerente e soddisfacente per un normale zebrafish adulto: range "2 mV", passaggio basso "120 Hz" e passaggio alto "0,03 s".
2. Premere Start per avviare una registrazione ECG continua senza gap a una frequenza di campionamento di 1 kHz.
3. Per ottimizzare il posizionamento del piombo per il massimo rapporto segnale-rumore, premere Interrompi per interrompere la registrazione ECG e rivedere la traccia ECG subito dopo il primo tentativo di registrazione per ogni cuore. Per diagnosticare che un ECG zebrafish adulto è normale, verificare che siano soddisfatti tutti i seguenti quattro criteri di convalida (Figura 3):
   1. Criterio 1: Assicurarsi che tutte le forme d'onda ECG (P, QRS e T) siano distinte e facilmente visibili.
   2. Criterio 2: Assicurarsi che l'onda P sia positiva.
   3. Criterio 3: Assicurarsi che il complesso QRS netto sia positivo (cioè l'ampiezza dell'onda R è maggiore della somma delle ampiezze d'onda Q e S).
   4. Criterio 4: Assicurarsi che l'onda T sia positiva.
4. Se è previsto un normale ECG, riposizionare gli elettrodi (provare prima l'elettrodo negativo) se necessario, fino a quando non saranno soddisfatti tutti e quattro i criteri di convalida.
5. Se ci si aspetta un'onda T normale, ma l'onda T è troppo piccola, riposizionare gli elettrodi per massimizzare l'ampiezza dell'onda T.
6. Riprendere la registrazione ECG dopo aver ottimizzato il posizionamento dei lead. Salvare le sweep ECG per l'analisi successiva.

4. Recupero dall'anestesia

1. Al termine della sessione di registrazione ECG, rimuovere con cura gli elettrodi senza ferire il pesce. Trasferire il pesce in acqua di pesce fresca e ossigenata priva di tricaina.
2. Per facilitare il recupero dall'anestesia, spruzzare acqua sulle branchie vigorosamente con una pipetta Pasteur fino a quando il pesce riprende il normale movimento branchiale o il nuoto.
3. Monitorare il pesce per il pieno recupero dall'anestesia (in genere 1-2 min), come indicato dalla capacità del pesce di nuotare in posizione verticale per almeno 5 s.

Representative Results

Figura 1: Protocollo di registrazione ECG in vivo minimamente invasivo. Un diagramma di flusso schematico illustra quattro fasi di azione critica nello svolgimento di un interrogatorio ECG in vivo: indurre l'anestesia, posizionare elettrodi di piombo ECG, registrare ECG e analizzare le registrazioni ECG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Posizionamento del lead ECG. Tre elettrodi in acciaio inossidabile codificati a colori calibro 29 vengono inseriti saldamente nella muscolatura del pesce a circa 1 mm di profondità. Il posizionamento dell'elettrodo negativo (nero) e dell'elettrodo positivo (rosso) stabilisce un piombo bipolare nel piano frontale, lungo un orientamento cranicio da caudale a destra sinistro. Abbreviazione: rif, elettrodo di riferimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Anatomia contrastante ed ECG dei cuori umani e zebrafish. In contrasto con il cuore umano con due atri e due ventricoli, il cuore di zebrafish ha un solo atrio e un ventricolo (riga superiore). Abbreviazioni: RA, atrio destro; Los Angeles, atrio sinistro; Camper, ventricolo destro; LV: ventricolo sinistro. Il cuore di zebrafish condivide diverse caratteristiche comuni dell'ECG con il cuore umano (fila inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222