Eletrocardiografia de zebrafish (ECG): Um ensaio minimamente invasivo para avaliar a função cardíaca

Overview

Este vídeo mostra como realizar medições de eletrocardiografia (ECG ou ECG), um teste que mede a atividade elétrica do coração, em um peixe-zebra.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp. (2019).

Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde dos Institutos Nacionais dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os protocolos animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCLA.

1. Indução da anestesia

1. Prepare anestesia de imersão para controle da dor e imobilização de peixes para evitar artefatos de movimento durante a aquisição de dados do ECG. A maioria dos laboratórios usa tricaine de imersão (metanosulfonato etílico etílico, MS-222).
   1. Para fazer a solução de estoque tricaine 0,4%, combine os seguintes itens em uma garrafa de vidro escuro com tampa de parafuso: 400 mg de tricaine em pó, 98 mL de água dupla destilada e 2 mL de 1 M Tris (pH 9). Ajuste ao pH 7.0 usando 1 N NaOH ou 1 N HCl conforme necessário.
   2. Para fazer a solução final de imersão tricaine, determine a concentração mínima adequada para a idade, tamanho, estado metabólico, cepa, modelo de doença, objetivos científicos e duração processual.
   3. Realizar um estudo de concentração-resposta tricatina, titulando-se para cima ou para baixo da concentração recomendada de 168 mg/L (ou 0,0168%)^9,se necessário, para atingir o nível 4 de anestesia dentro de 3 minutos com o menor número possível de toxicidades cardiorrespiratórias. Por exemplo, neste estudo, a imersão de zebrafish AB do tipo selvagem de 12-18 meses de idade em uma solução tricaina de 0,02-0,04% induzirá o nível 4 de anestesia dentro de 3 minutos.
      NOTA: No nível 4 da anestesia, o equilíbrio e o tônus muscular são completamente perdidos e a taxa de movimento opercular é reduzida.
   4. Se necessário, consulte o veterinário no Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) para orientação adicional sobre a adequação da seleção de anestésicos e rota de administração.
2. Mergulhe um zebrafish adulto em um prato contendo solução tricaina da menor concentração pré-determinada e aprovada pela IACUC (por exemplo, 0,02-0,04% neste estudo) para induzir o nível 4 de anestesia dentro de 3 min(Figura 1).
   1. Para o protocolo de ECG de sobrevivência, mantenha a sessão de gravação do ECG o mais breve possível (menos de 10 minutos). Para breves sessões de gravação de ECG com duração inferior a 15 minutos, a manutenção da anestesia não é necessária.
   2. Para longas sessões de gravação de ECG que duram horas, use um paralítico intramuscular de longa duração e um sistema de perfusão oral para fornecer ampla hidratação e oxigenação.

2. Colocação de chumbo ECG

1. Uma vez que o zebrafish mantenha o nível 4 de anestesia para 3 s, use um par de fórceps contundentes para transferir o peixe imediatamente para a fenda da esponja úmida com sua superfície ventral superior para colocação de eletrodos de chumbo ECG(Figura 2).
2. Insira suavemente os três eletrodos de chumbo ECG na musculatura do peixe a aproximadamente 1 mm de profundidade para estabelecer um chumbo bipolar no plano frontal que paralelamente à orientação craniana caudal-direita esquerda do eixo principal cardíaco.
3. Posicione o eletrodo positivo (vermelho) na linha média ventral ao nível do bulbo arteriosus, ou seja, a 1-2 mm acima de uma linha imaginária ligando as duas bordas inferiores dos operculums(Figura 2A).
4. Posicione o eletrodo negativo (preto) caudally e 0,5-1,0 mm deixado lateralmente para o eletrodo positivo, a uma distância maior que o comprimento máximo apicobasal do ventrículo adulto de zebrafish(Figura 2A).
5. Posicione o eletrodo de referência (verde) caudally, perto da região anal.
   NOTA: Uma vez que o eixo principal cardíaco varia um pouco de peixe para peixe, para maximizar as amplitudes de ondas R e T, ajuste as posições de chumbo fazendo apenas pequenas alterações sistemáticas através de tentativa e erro. Por exemplo, altere um eletrodo (positivo ou negativo), em vez de ambos os eletrodos, de cada vez e faça mudanças graduais em uma direção especificada antes de mudar para outra direção em vez de fazer mudanças erráticas em direções aleatórias.

3. Gravação de ECG

1. Abra o programa de aquisição de dados do ECG. Selecione uma configuração desejada nos menus suspensos para intervalo, passe baixo e passe alto. Por exemplo, a seguinte configuração no sistema de gravação in vivo ECG utilizado neste experimento produz uma relação sinal-ruído consistente e satisfatória para um zebrafish adulto normal: faixa "2 mV", low pass "120 Hz" e high pass "0.03 s".
2. Pressione Comece a iniciar a gravação contínua de ECG sem lacunas a uma taxa de amostragem de 1 kHz.
3. Para otimizar o posicionamento do lead para a relação sinal-ruído máximo, pressione Stop para parar a gravação do ECG e revise o traço do ECG logo após a primeira tentativa de gravação de cada coração. Para diagnosticar que um ECG de zebrafish adulto é normal, confirme que todos os quatro critérios de validação a seguir estão satisfeitos(Figura 3):
   1. Critério 1: Certifique-se de que todas as formas de onda ECG (P, QRS e T) sejam distintas e facilmente visíveis.
   2. Critério 2: Certifique-se de que a onda P é positiva.
   3. Critério 3: Certifique-se de que o complexo de QRS líquido seja positivo (ou seja, a amplitude da onda R é maior do que a soma das amplitudes de ondas Q e S).
   4. Critério 4: Certifique-se de que a onda T é positiva.
4. Se for esperado um ECG normal, reposicione os eletrodos (tente o eletrodo negativo primeiro) se necessário, até que todos os quatro critérios de validação sejam satisfeitos.
5. Se uma onda T normal for esperada, mas a onda T é muito pequena, reposicione os eletrodos para maximizar a amplitude da onda T.
6. Retomar a gravação do ECG após otimizar o posicionamento do lead. Salve as varreduras do ECG para análises subsequentes.

4. Recuperação da anestesia

1. No final da sessão de gravação do ECG, remova cuidadosamente os eletrodos sem ferir o peixe. Transfira o peixe para água de peixe fresca e oxigenada livre de tricaine.
2. Para facilitar a recuperação da anestesia, esguiche água sobre as brânquias vigorosamente com uma pipeta Pasteur até que o peixe retome o movimento regular da brânquia ou natação.
3. Monitore o peixe para recuperação total da anestesia (tipicamente 1-2 min), como indicado pela capacidade dos peixes de nadar em pé por pelo menos 5 s.

Representative Results

Figura 1: Protocolo de gravação in vivo minimamente invasivo. Um fluxograma esquemático ilustra quatro etapas de ação crítica na realização de um interrogatório in vivo ECG: induzir anestesia, colocar eletrodos de chumbo ECG, gravar ECG e analisar as gravações do ECG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Colocação de chumbo ECG. Três eletrodos de aço inoxidável codificados por cores de 29 bitolas são inseridos firmemente na musculatura do peixe a aproximadamente 1 mm de profundidade. A colocação do eletrodo negativo (preto) e do eletrodo positivo (vermelho) estabelece um chumbo bipolar no plano frontal, ao longo de uma orientação craniana caudal esquerda para a direita. Abreviação: árbitro, eletrodo de referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Anatomia contrastante e ECG de corações humanos e zebrafish. Em contraste com o coração humano com dois atria e dois ventrículos, o coração de zebrafish tem apenas um átrio e um ventrículo (linha superior). Abreviaturas: RA, átrio direito; LA, átrio esquerdo; RV, ventrículo direito; LV: ventrículo esquerdo. O coração de zebrafish compartilha várias características comuns do ECG com o coração humano (linha inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture dishes	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
Dumont Forceps	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 Animal Bio Amp	AD Instruments	FE231
Iris Forceps	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		Software with ECG Module
Needle electrodes for Animal Bio Amp	AD Instruments	MLA1213	29 gauge
Plastic Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12	6 in., 1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G	MS-222