Summary
Bestämning av kolonibildande enheter (CFU) är den gyllene standardtekniken för att kvantifiera bakterier, inklusive Mycobacterium tuberculosis som kan ta veckor att bilda synliga kolonier. Här beskriver vi en mikro-CFU för CFU-bestämning med ökad tidseffektivitet, minskat labbutrymme och reagenskostnad samt skalbarhet till medelstora och höga genomströmningsexperiment.
Abstract
Tuberkulos (TBC), den vanligaste dödsorsaken i världen på grund av ett smittämne, dödade 1,6 miljoner människor 2022 och överträffades endast av covid-19 under pandemin 2019–2021. Sjukdomen orsakas av bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Mycobacterium bovis-stammen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), det enda tuberkulosvaccinet, är det äldsta licensierade vaccinet i världen och används fortfarande. För närvarande finns det 12 vacciner i kliniska prövningar och dussintals vacciner under preklinisk utveckling. Den metod som används för att bedöma effekten av tuberkulosvacciner i prekliniska studier är att räkna bakteriekolonier med hjälp av CFU-analysen. Denna tidskrävande analys tar 4 till 6 veckor att slutföra, kräver betydande laboratorie- och inkubatorutrymme, har höga reagenskostnader och är benägen att kontamineras. Här beskriver vi en optimerad metod för uppräkning av kolonier, mikro-CFU (mCFU), som erbjuder en enkel och snabb lösning för att analysera M.tb-vaccinets effektivitetsresultat. mCFU-analysen kräver tio gånger färre reagenser, minskar inkubationstiden trefaldigt, tar 1 till 2 veckor att slutföra, minskar laboratorieutrymmet och reagenskostnaderna och minimerar hälso- och säkerhetsriskerna förknippade med att arbeta med ett stort antal M.tb. För att utvärdera effekten av ett tuberkulosvaccin kan prover dessutom tas från en mängd olika källor, inklusive vävnader från vaccinerade djur som infekterats med mykobakterier. Vi beskriver också en optimerad metod för att producera en encellig, enhetlig och högkvalitativ mykobakteriekultur för infektionsstudier. Slutligen föreslår vi att dessa metoder ska användas universellt för prekliniska studier av bestämning av vaccineffektivitet, vilket i slutändan leder till tidsförkortning i utvecklingen av vacciner mot tuberkulos.
Introduction
Tuberkulos (TBC) är den vanligaste dödsorsaken i världen på grund av ett enda smittämne, bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb), som dödar fler människor än någon annan patogen. År 2021 orsakade tuberkulos 1,6 miljoner dödsfall och överträffades av covid-19 under pandemin 2019–20211. Enligt Världshälsoorganisationens globala tuberkulosrapport från 2022 var covid-19-pandemin dessutom ansvarig för en ökning av antalet nya tuberkulosfall. WHO rapporterar också stora minskningar av antalet personer som diagnostiserats med tuberkulos under denna period, vilket kan öka antalet tuberkulosfallytterligare.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) är en levande försvagad stam av den patogena Mycobacterium bovis, som användes för första gången som vaccin för mer än 100 år sedan. Detta är det enda vaccinet mot tuberkulos och är det äldsta licensierade vaccinet i världen som fortfarande används 2,3. För närvarande finns det 12 vacciner i olika faser av kliniska prövningar4, och dussintals vacciner är under preklinisk utveckling 5,6. Preklinisk bedömning av vacciner mot tuberkulos omfattar utvärdering av säkerhet och immunogenicitet7, som kan erhållas i olika djurmodeller såsom zebrafiskar, möss, marsvin, kaniner, nötkreatur och icke-mänskliga primater 8,9,10. För att bedöma ett vaccins förmåga att inducera skydd mot M.tb-infektion och/eller överföring, dvs. vaccinets effektivitet, krävs dessutom en M.tb-provokation in vivo 5,11. Intressant nog inducerar BCG-vaccination icke-specifika effekter som påverkar överlevnaden av andra bakteriella och virala patogener 12,13 genom mekanismen för tränad immunitet14. För att kvantifiera den livskraftiga bakteriebördan hos ett infekterat djur är den valda metoden att räkna bakteriekolonier genom CFU-analysen (Colony-Forming Units) 5,15. CFU är en enhet som uppskattar antalet mikroorganismer (bakterier eller svampar) som bildar kolonier under specifika tillväxtförhållanden. CFU härstammar från livskraftiga och replikativa mikroorganismer, och det absoluta antalet levande mikroorganismer inom varje koloni är svårt att uppskatta. Det är osäkert om en koloni har sitt ursprung i en eller flera mikroorganismer. CFU-enheten återspeglar denna osäkerhet, vilket innebär att en stor variabilitet kan observeras hos replikat av samma prov. Denna tidskrävande analys kräver specialiserade tekniker som är utbildade för att arbeta i en anläggning med biosäkerhetsnivå 3 (BSL3), ett stort laboratorie- och inkubatorutrymme, tar från 4 till 6 veckor att slutföra och är benägen att kontamineras.
I denna studie beskriver vi en optimerad metod för populationsräkning, micro-CFU (mCFU), och erbjuder en enkel och snabb lösning för att analysera resultaten 15,16,17,18,19,20. mCFU-analysen kräver tio gånger färre reagenser, minskar inkubationstiden trefaldigt, tar 1 till 2 veckor att slutföra, minskar laboratorieutrymmet och reagenskostnaderna och minimerar hälso- och säkerhetsriskerna förknippade med att arbeta med ett stort antal M.tb. Vi föreslår att denna metod ska användas universellt för prekliniska studier av bestämning av vaccineffektivitet, vilket i slutändan leder till tidsförkortning i utvecklingen av vacciner mot tuberkulos. Slutligen har denna optimerade metod för CFU-räkning använts för att kvantifiera inte bara mykobakterier utan även andra bakterier, såsom Escherichia coli och Ralstonia solanacearum21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Protokollet som beskrivs här är för BCG men kan tillämpas på alla mykobakterier. BCG kan användas som surrogatbakterie för tuberkulosexperiment när BSL3-anläggningar inte är tillgängliga22. Följande procedurer med BCG bör utföras under ett laboratorium med biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) och följa lämpliga riktlinjer för biosäkerhet och god laboratoriepraxis för hantering av mikroorganismer i farogrupp 2.
1. Förberedelse av kulturmedier
- Förbered Middlebrook 7H9-buljong kompletterad med 10 % (v/v) oljesyra, albumin, dextros och katalas (OADC) berikning, enligt leverantörens instruktioner. Tillsätt buljongen med 0,05 % (v/v) tyloxapol.
Tyloxapol är en icke-jonisk flytande polymer som har använts som ytaktivt ämne för att förhindra bakterieklumpbildning16. - Bered Middlebrook 7H10 fast medium kompletterat med 10 % (v/v) OADC-anrikning enligt leverantörens instruktioner.
- Fördela 40 ml medium per kvadratisk petriskål (120 mm x 120 mm). Låt plattorna torka för att minimera kondens på agarytan.
OBS: Denna specifika storlek på petriskålen är grundläggande för att möjliggöra direkt transponering av minst 96 droppar från en 96-hålsplatta. Effektiv torkning av plattorna kommer senare att underlätta plätering av små droppar av bakteriesuspension och förhindra att dropparna sprids. - Förbered antingen Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) eller Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) för att producera infektionsmediet. I båda fallen, komplettera mediet med 10 % fetalt kalvserum, 1 % L-glutamin och 1 mM natriumpyruvat. Tillsätt inte penicillin och streptomycin till mediet.
2. Beredning av prover
- Skaffa prover från en mängd olika källor. För att kvantifiera CFU för att utvärdera effekten av ett tuberkulosvaccin ska prover från vaccinerade och ovaccinerade djurvävnader vanligtvis tas från prover. Till exempel muslunga och mjälte11 eller makaklunga, bröst- och perifera lymfkörtlar, mjälte, lever, hud, blod, benmärg och bronkoalveolär sköljning23. Alternativt kan prover tas från in vitro-odlingar av makrofager/dendritiska celler/neutrofiler infekterade med BCG 18,19,20,24,25,26.
3. Produktion av BCG-kultur
OBS: För in vivo-studier av tuberkulosvacciner är syftet att förbättra effekten av BCG. Därför används vanligtvis BCG-vaccinerade grupper som kontroll. BCG-stammar som används för vaccination av människor är idealiska för testning i djurmodeller. I detta fall måste en BCG-kultur rekonstitueras enligt leverantörens instruktioner27. En BCG-kultur för in vivo-studier kan dock också produceras internt11. Produktionen av encellig, enhetlig och högkvalitativ BCG-kultur för in vitro-infektionsprotokoll har producerats mycket framgångsrikt i flera studier 11,16,18,19,20,26,28,29, med hjälp av följande protokoll, som också kan användas för provokationsstudier på djur.
- Odla 50 ml BCG i 7H9-buljong, vid 37 °C, med omrörning vid 200 rpm. Variera volymen efter experimentets behov.
- Varje dag, i 8-10 dagar, samla 100 μL av kulturen och späd ut den genom att tillsätta 900 μL PBS i en 1 ml kyvett. Fortsätt sedan med att mäta bakteriernas optiska densitet (OD vid λ=600 nm; OD600) i en spektrofotometer. Rita en tillväxtkurva från dessa värden. Identifiera grödans mellanloggfas (när OD fördubblas konsekvent per tidsenhet).
- Förbered en efterföljande odling och inkubera tills den mellanra/sena stocktillväxtfasen når enligt steg 3.1 och 3.2. Använd de värden som hämtades i föregående steg som vägledning. Se till att kulturen inte når den stationära tillväxtfasen (när OD börjar stabiliseras) för att upprätthålla en kultur av god kvalitet av livskraftiga bakterier.
- Samla in grödan i den mellersta/sena stocktillväxtfasen. Centrifugera vid 3000 x g i 10 min. Ta bort supernatanten.
- Tillsätt 10 ml PBS för att tvätta bakterierna. Centrifugera vid 3000 x g i 10 min. Ta bort supernatanten.
- Återsuspendera bakterierna med 5 ml infektionsmedia. Placera slangen i ett ultraljudsbad i 15 min, full effekt vid 80 Hz.
- Centrifugera vid 1000 x g i 10 min. Samla supernatanten, undvik pelleten eftersom den är rik på bakterieklumpar som bör undvikas i en högkvalitativ BCG-kultur och kassera den.
- Mät supernatantens OD. Här motsvarar kulturer i den exponentiella tillväxtfasen, med en OD600 på 0,1, 1 x 107 CFU/ml.
OBS: Varje laboratorium bör producera sina egna BCG-tillväxtkurvor innan experiment påbörjas för att upprätta en linjär regression mellan OD600 och CFU med hjälp av spektrofotometern. Observera att spektrofotometrar har olika ljusvägsavstånd, vilket kan variera avläsningarna som erhålls för samma prov. - Utföra enkla beräkningar för att fastställa antalet bakterier som ska tillsättas i varje värdcellkultur. Antalet bakterier per värdcell är Multiplicity of Infection (MOI). Använd en MOI på 10 bakterier per värdcell, vilket är den vanligaste MOI som används för BCG-infektionsexperiment.
4. Analys av mikrokolonibildande enhet
OBS: Efter att ett in vivo - eller in vitro-infektionsexperiment har slutförts kan räkningen av bakterier utföras av mCFU. För in vivo-studier måste proverna först homogeniseras i en pärlvisp eller annan vävnadshomogenisator. För in vitro-odlingar av makrofager/dendritiska celler/neutrofiler infekterade med BCG måste proverna lyseras med ett nonjoniskt rengöringsmedel (t.ex. 0,05 % lösning av nonjoniskt, icke-denaturerande rengöringsmedel).
- Seriespädningar med användning av en 96-hålsplatta: utför seriespädningar av lysaten 10-faldigt i en steril 96-hålsplatta enligt schemat i figur 1A. Fördela lysaten på raderna A och E. För varje platta får högst 24 prover och/eller replikat tas.
- Tillsätt 180 μL dH2O till de återstående brunnarna för att utföra den seriespädda effekten.
- Använd en 12-kanals pipett, återsuspendera lysaten i rad A och överför 20 μL till rad B (20 μL lysat + 180 μL dH2O). Homogenisera väl. Upprepa detta steg sekventiellt för raderna B och C tills den sista utspädningen på rad D nås.
OBS: Vi utför vanligtvis tre utspädningar (100, 101, 102, 103), alltså med 4 rader av plattan (A-D eller E-H) för varje uppsättning av 12 prover och/eller replikat. - Mikrodroppplätering: använd en 0,5-10 μL (tunna spetsar är att föredra) flerkanalspipett för att överföra 5 μL från varje rad av 96-hålsplattan till den solida medelstora fyrkantiga plattan, enligt figur 1B.
- Medan du långsamt pipetterar de 5 μL-dropparna, låt dem röra lätt vid agar. Detta hjälper till att ta bort droppen från spetsen mot agarn och minska risken för att vätskan stannar kvar i spetsen.
- Låt dropparna torka, stäng agarplattan och inkubera den vid 37 °C samtidigt som du övervakar bakterietillväxten. Alternativt kan du inkubera agarplattorna i en förseglad plastpåse för att förhindra att plattorna torkar.
- Räkning av mikrokolonier: efter cirka 6–10 dagars inkubation ska det undersökas om det finns enskilda kolonier som är synliga för blotta ögat (figur 2).
- Räkna kolonierna med hjälp av det lägsta förstoringsobjektivet (4x eller lägre) i ett omvänt optiskt mikroskop eller förstoringsglas. Räkningar bör utföras i de spädningar där antalet kolonier är lägre än 300 och högre än 30. Alternativt kan du använda en kamera för att ta en bild av droppen för att manuellt räkna kolonier på datorn eller använda programvara som ImageJ för att automatisera inventeringen av kolonier.
- Använd följande ekvation för att uttrycka celltal i CFU/ml:
där C = antal räknade kolonier, V = volym pläterad i μL och Dil = utspädning där kolonierna räknades (100, 101, 102, 103). Till exempel, om 30 kolonier räknades i en 5 μL droppe i utspädning 102, då:
Figur 1. Schematisk representation av mCFU-protokollet. A) 10-faldiga seriespädningar av de BCG-innehållande lysaten i en 96-hålsplatta. B) Fyrkantig petriskål som innehåller ett fast odlingsmedium och överlagras med 96 droppar à 5 μL vardera. Dropparna pipetteras direkt från plattan med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Mikrokolonibildande enheter av BCG efter 10 dagars inkubation. Till vänster ett foto av en fyrkantig petriskål täckt av 96 droppar på 5 μL vardera, som tidigare visats i figur 1B. Till höger motsvarar individuella foton av 3 droppar ett originallysat (100) och två spädningar (101, 102). Bilderna togs med en DSRL-kamera utrustad med ett 18-55 mm zoomobjektiv (platta) eller ett 105 mm makroobjektiv (droppar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Mikrokolonibildande enhetsräkning i Fiji (ImageJ)
OBS: mCFU-metoden tillåter CFU-kvantifiering av stora uppsättningar prover. Bilder av dropparna kan tas för posteriort analys för att underlätta räkning av kolonier. Flera fotografiska apparater kan producera bilder med tillräcklig kvalitet för detta ändamål. Dessa inkluderar digitalkameror, webbkameror, kameraanslutna mikroskop och förstoringsglas och mobiltelefoner. Gratis bildanalysprogram som ImageJ erbjuder möjligheten till manuell eller automatiserad koloniräkning i dessa bilder. För att demonstrera båda metoderna kommer Fiji att användas, vilket är en distribution av ImageJ som paketerar flera verktyg för vetenskaplig bildanalys30. Fiji kan laddas ner från https://fiji.sc/.
- Manuell räknemetod
- Öppna avbildningen som innehåller mCFU i Fiji. Välj Plugin-program > Analysera > cellräknare.
- På menyn Cellräknare väljer du Initiera och väljer sedan en räknare (t.ex. Typ 1).
- Fortsätt genom att klicka på varje koloni. Varje klick kommer att visas på bilden och kommer att uppdatera räknaren (Figur 3). Om du vill ångra oavsiktliga klick väljer du Ta bort.
- Registrera värdet som visas på räknaren. Klicka på knappen Återställ för att återställa antalet och öppna en ny bild för att räkna ytterligare exempel.
OBS: Ytterligare instruktioner om detta plugin finns på https://imagej.net/plugins/cell-counter.
- Automatiserad räknemetod
- Öppna avbildningen som innehåller mCFU i Fiji. Välj Bild > Typ > 8-bitars. Detta kommer att konvertera bilden till en 8-bitars gråskalebild.
- Välj verktyget Oval i verktygsfältet och rita en oval runt området med kolonierna (bild 4A). Ovalen kan justeras efter att den har ritats.
- Välj Redigera > Rensa utsidan för att ta bort eventuella störningar från utsidan (bild 4B). Välj Bild > justera > tröskelvärdet.
- Flytta skjutreglagen i tröskelmenyn tills kolonierna visas i rött och bakgrundsbruset minimeras (Figur 4C).
- Välj Använd och avsluta tröskelfönstret. En svartvit bild genereras (figur 4D).
- Välj Analysera > Analysera partiklar. I fönstret analysera partiklar anger du intervallet för koloniarea (mellan 1 och oändlighet, mätt i kvadratiska pixlar) och cirkularitet (mellan 0 och 1, där 1 är en perfekt cirkel; Figur 4E).
- Välj Konturer i popup-menyn för att visa. Markera Visa resultat för detaljerade mätningar för varje samhälle i resultatfönstret. Markera Rensa resultat för att radera alla tidigare mätningar. Markera rutan Sammanfatta för att visa de sammanfattade resultaten av mätningarna (Figur 4E).
- Starta analysatorn genom att välja OK. Ett nytt fönster visas som visar alla kolonier med konturer som upptäcktes och räknades. Resultatfönstret visar information om varje samhälle, och det sammanfattade resultatfönstret visar det totala antalet kolonier som räknats (figur 4F).
OBS: Inställningarna för storlek och cirkularitet kommer att variera med bildens upplösning och förstoring och koloniernas storlek och form. Upprepa processen flera gånger tills de bästa inställningarna hittas som upptäcker alla kolonier. Ytterligare instruktioner om plugin-programmet för att analysera partiklar finns på https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.
Figur 3. En manuell metod för att räkna mCFU med hjälp av cellräknarplugin på Fijis programvara. De blå prickarna indikerar kolonier som användaren redan har klickat på. Menyn till höger visar antalet samhällen som hittills räknats (antalet är 41). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. En automatiserad metod för att räkna mCFU med hjälp av Fijis programvara. (A, B) Det område som är av intresse med kolonierna markeras med hjälp av det ovala markeringsverktyget, och det yttre området tas bort med kommandot rensa utsida. (C, D) En svartvit bild av kolonierna skapas med hjälp av tröskelverktyget. (E, F) Antalet kolonier kvantifieras med hjälp av verktyget analysera partiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mCFU-analys som beskrivs här ökar mängden information som kan hämtas från en enda petriskål till minst 96 gånger. Figur 5 visar en jämförelse av två metoder för läkemedelstillförsel för användning av saquinavir (SQV)31,32 som ett värdriktat läkemedel för behandling av tuberkulos. I denna analys användes fyra olika stammar av Mycobacterium tuberculosis för att infektera primära humana makrofager. M. tuberkulos H37Rv-laboratoriestam och tre kliniska stammar som isolerats från patienter med aktiv tuberkulos av Dr. Ricardo Jorge vid Portugals nationella hälsoinstitut (INSA): en läkemedelskänslig stam (INSA-kod 33427), en multiresistent stam (MDR) (INSA-kod 34192) och en extensivt läkemedelsresistent stam (XDR) (INSA-kod 163761). Varje infektion av varje stam multiplicerades vidare till åtta olika behandlingsbetingelser och jämförde tre olika koncentrationer av fria läkemedel eller liposomladdade läkemedel med respektive icke-behandlade kontroller. Slutligen analyserades varje tillstånd vid fyra olika tidpunkter efter infektionen. För att kvantifiera intracellulär bakterietillväxt var den totala mängden lysat som extraherades från varje tidpunkt 32. Detta följdes av tre seriespädningar till varje lysat, vilket ökade antalet till 128 prover. Multiplicerat med de fyra analyserade tidpunkterna resulterar det i 512 prover. Eftersom experimentet upprepades med makrofager från minst tre olika blodgivare ökade det totala antalet analyserade prover till 1536. Med hjälp av mCFU-metoden som beskrivs här tog detta experiment endast hänsyn till 16 kvadratiska petriskålar jämfört med 1536 som skulle behövas med standard-CFU-protokollet. Som visas i figur 5 kan de resultat som erhålls med denna metod visa statistiskt signifikanta skillnader mellan behandlingar.
Figur 5. mCFU-metoden kan producera stora mängder data från ett litet antal agarplattor. Denna uppsättning experiment testade effekten av läkemedlet saquinavir (SQV) för att inducera intracellulär avdödning av M.tb, laboratorie- och kliniska stammar i humana makrofager. SQV administrerades till makrofagkulturerna i sin fria form eller laddade i liposomer (LipSQV). Behandlingarna utfördes i tre olika koncentrationer: 50, 20 och 10 μg/ml. Makrofager infekterades med olika M.tb-stammar under 3 timmar och behandlades sedan med utvalda koncentrationer av LipSQV och fritt SQV. Liposomer utan läkemedlet (LipUnloaded) och DMSO användes som kontroller. För att utvärdera bakteriell intracellulär överlevnad, vid diskreta tidpunkter, lyserades makrofager och seriespädningar av bakteriesuspensionen pläterades på 7H10 agarplattor. mCFU-enheter räknades efter 2-3 veckor. Linjerna visar den genomsnittliga mCFU per prov från minst 3 oberoende experiment. Staplarna representerar den genomsnittliga mCFU-procenten beräknad i förhållande till respektive kontroller dag 7 efter infektion. Symboler representerar varje experiment med makrofager från en annan donator. Felstaplar representerar medelvärdets standardfel. Multipla gruppjämförelser utfördes med hjälp av envägs ANOVA följt av ett Holm-Sidak post-hoc test. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Denna siffra har ändrats från33. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tuberkulos är ett stort folkhälsoproblem som blir allt viktigare, särskilt i låg- och medelinkomstländer. Störningarna i hälso- och sjukvården för att diagnostisera och behandla tuberkulos under covid-19-pandemin hade en negativ inverkan på förekomsten av nya fall1. Dessutom måste man snarast ta itu med multiresistenta och i stor utsträckning läkemedelsresistenta tuberkulosstammar och samtidig infektion av tuberkulos och hiv för att få bukt med denna epidemi 1,34. Nya vacciner för att ersätta eller förbättra BCG genomgår för närvarande kliniska prövningar, och nya kandidater kan komma ut på marknaden under de kommande åren35. Utvecklingen av nya vaccinkandidater mot tuberkulos bygger på prekliniska studier med olika djurmodeller. Bestämningen av vaccinets effektivitet i djurmodeller kräver kvantifiering av bakteriell börda i de infekterade organen för att påvisa vaccinets skyddande effekt 5,36. För närvarande finns det direkta och indirekta metoder för att kvantifiera bakteriebördan hos infekterade möss och icke-mänskliga primater. De direkta metoderna inkluderar histologiska preparat och bakteriell färgning med fluorescerande auramin-o och Ziehl-Neelsen37, kvantifiering av mykobakteriell belastning i prover baserade på RT-qPCR38 och andra.
Analysen för mykobakteriell tillväxthämning (MGIA) är en in vitro-analys baserad på BACTEC MGIT-systemet och är en känslig metod som används för att kvantifiera levande mykobakteriell börda hos vaccinerade och ovaccinerade djur. Systemet är ett helautomatiskt instrument som kan testa förekomsten av mykobakterier i specialdesignade provrör. Injektionsflaskan innehåller en fluorescerande rapportör som reagerar på koncentrationen av syre i provet. Fluorescensen är proportionell mot mängden syre som förbrukas, vilket ger en indikation på antalet levande bakterier som finns i provet, varje timme39. I MGIA-metoden samlas PBMC och autologa serumprover in från djur och samodlas med mykobakterier under 96 timmar. Sedan lyseras vidhäftande monocyter för att frigöra intracellulära mykobakterier. Systemet kommer att kvantifiera bakteriebelastningen indirekt genom att mäta syreförbrukningen40. Denna metod används vanligtvis för läkemedelsresistensstudier men har nyligen tillämpats för utvärdering av tuberkulosvaccinets effektivitet40.
Dessa metoder kan kompletteras med standard-CFU för att bestämma det totala antalet livskraftiga mykobakterier. Till exempel uppnås utvärderingen av vaccinkandidater i ett murint aerosol M.tb-provokationsexperiment genom att räkna upp kolonier som erhållits från vävnader av CFU11.
Den mCFU-metod som beskrivs här kan vara en väsentlig förbättring jämfört med den klassiska CFU-metoden, eftersom den är snabbare att utföra och billig när det gäller reagenser som används och när det gäller det laboratorieutrymme som krävs. Denna metod gör det möjligt att samtidigt jämföra en stor uppsättning prover i ett enda experiment, vilket minskar effekterna av variationer från analys till analys. Till exempel, som visas i experimentet som beskrivs i figur 5, bestämdes CFU för 1536 prover med mCFU-metoden i 16 kvadratiska petriskålar, vilket representerar en 96-faldig minskning av antalet använda tallrikar. Detta är mer relevant för experiment med primära biologiska och kliniska prover, där tillgängligheten kan vara ett problem. Den kompakta form i vilken kolonierna visas på en agarplatta gör det möjligt att använda specialiserad eller vanlig bildinspelningsutrustning. Detta, i kombination med automatiserade metoder för att räkna kolonier som den som beskrivs här med hjälp av Fijis programvara, bidrar till att minska beroendet av användarens förmåga att identifiera och kvantifiera CFU. I likhet med standardtekniken för CFU lider denna metod dock av oförmågan att särskilja sammanslagna kolonier, vilket leder till en potentiell underrepresentation av CFU. Detta kan dock minimeras genom att välja en högre utspädning för att utföra kvantifieringen eller genom att räkna kolonierna under mikroskopet innan deras överväxt resulterar i kolonifusion. Detta är mer relevant om provet producerar kolonier med heterogena tillväxthastigheter. Forskare bör validera genomförandet av mCFU för sina specifika experimentella betingelser i dessa fall.
De kritiska stegen i protokollet är följande punkter: de seriespädningar som görs bör utföras med hjälp av en 96-hålsplatta, och utspädningarna måste blandas noggrant; mikrodropppläteringen bör utföras med en 0.5-10 μL flerkanalspipett för att överföra 5 μL från varje rad av 96-hålsplattan till den fasta mediekvadratplattan, utan att vidröra och skada mediet; Räkningen av mikrokolonierna måste utföras mellan 6-10 dagars inkubation. Vid tidpunkten för räkningen måste man dock se till att samhällena inte är för stora eller för små.
Modifieringarna och felsökningen av tekniken inkluderar användning av olika bakteriestammar. Därför bör det optimala odlingsmediet användas för varje stam. Teknikens begränsningar är identiska med begränsningarna för den konventionella CFU-metoden, som inkluderar svårigheten att räkna bakterier i låga utspädningar. Dessutom inkluderar specifika begränsningar för denna metod nödvändigheten av att använda ett mikroskop för att räkna upp kolonierna.
Slutligen kan denna metod användas för att kvantifiera bakteriebördan i tuberkulosvaccinationsstudier och för studier av resistens/känslighet hos testläkemedel och studier av värd-patogeninteraktion. Figur 5 visar till exempel tillämpningen av mCFU för bestämning av intracellulär avdödning av M.tb-stammar , inklusive kliniska stammar, multiresistenta och i stor utsträckning läkemedelsresistenta stammar behandlade med olika läkemedelsformuleringar, i humana makrofager. Det är viktigt att denna metod också kan tillämpas på vilken mikroorganism som helst, förutsatt att odlingsvillkoren för varje organism är uppfyllda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DP och PJGB förklarar att studien genomfördes utan några kommersiella eller finansiella förbindelser som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av intern finansiering från Medicinska fakulteten, Universidade Católica Portuguesa, och extern finansiering från Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), under bidragen UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 och EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 - 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
References
- World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O.
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D.
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J.
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
