Summary
Определение колониеобразующих единиц (КОЕ) является золотым стандартом для количественного определения бактерий, включая Mycobacterium tuberculosis , для формирования видимых колоний которых могут потребоваться недели. В этой статье мы опишем микро-КОЕ для определения КОЕ с повышенной эффективностью по времени, уменьшенным пространством лаборатории и стоимостью реагентов, а также масштабируемостью для экспериментов со средней и высокой пропускной способностью.
Abstract
В 2022 г. от туберкулеза (ТБ), основной причины смерти от инфекционного агента во всем мире, умерло 1,6 миллиона человек, уступив только COVID-19 во время пандемии 2019-2021 гг. Заболевание вызывается бактерией Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), единственная противотуберкулезная вакцина, является старейшей лицензированной вакциной в мире, которая используется до сих пор. В настоящее время 12 вакцин проходят клинические испытания и десятки вакцин находятся на стадии доклинической разработки. Методом выбора для оценки эффективности противотуберкулезных вакцин в доклинических исследованиях является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот трудоемкий анализ занимает от 4 до 6 недель, требует значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, имеет высокую стоимость реагентов и подвержен загрязнению. В этой статье мы опишем оптимизированный метод переписи колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), который предлагает простое и быстрое решение для анализа результатов анализа эффективности вакцины против туберкулеза . Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Кроме того, для оценки эффективности противотуберкулезной вакцины могут быть получены образцы из различных источников, включая ткани вакцинированных животных, инфицированных микобактериями. Описан оптимизированный метод получения одноклеточной, однородной и высококачественной культуры микобактерий для изучения инфекций. Наконец, мы предлагаем повсеместно использовать эти методы для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза.
Introduction
Туберкулез (ТБ) является основной причиной смерти во всем мире от одного инфекционного агента, бактерии Mycobacterium tuberculosis (M.tb), убивающей больше людей, чем любой другой патоген. В 2021 г. туберкулез стал причиной 1,6 миллиона случаев смерти, а вовремя пандемии 2019–2021 гг. его превзошел COVID-191. Более того, согласно глобальному докладу Всемирной организации здравоохранения о туберкулезе за 2022 год, пандемия COVID-19 привела к росту числа новых случаев заболевания туберкулезом. ВОЗ также сообщает о значительном снижении числа людей, у которых диагностирован туберкулез в течение этого периода, что может привести к дальнейшему увеличению числа случаев заболеваниятуберкулезом1.
Бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ) — живой аттенуированный штамм патогенной Mycobacterium bovis, впервые использованный в качестве вакцины более 100 лет назад. Это единственная вакцина против туберкулеза и самая старая лицензированная вакцина в мире, используемаядо сих пор. В настоящее время на разных фазах клинических испытаний находятся 12 вакцин4, а на стадии доклинической разработки находятся десятки вакцин 5,6. Доклиническая оценка вакцин против туберкулеза включает оценку безопасности и иммуногенности7, которые могут быть получены на различных моделях животных, таких как рыбки данио, мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот и приматы 8,9,10. Кроме того, для оценки способности вакцины индуцировать защиту от инфекции и/или передачи МТБ, т.е. эффективности вакцины, необходимо провести тест на МТБ in vivo 5,11. Интересно, что вакцинация БЦЖ индуцирует неспецифические эффекты, которые влияют на выживаемость других бактериальных и вирусных патогенов12,13 через механизм обученного иммунитета14. Для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки у инфицированного животного методом выбора является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ) 5,15. КОЕ — это единица, которая оценивает количество микроорганизмов (бактерий или грибов), которые образуют колонии при определенных условиях роста. КОЕ происходят от жизнеспособных и репликативных микроорганизмов, и абсолютное количество живых микроорганизмов в каждой колонии трудно оценить. Неясно, произошла ли колония от одного или нескольких микроорганизмов. Единица КОЕ отражает эту неопределенность, поэтому в репликах одного и того же образца можно наблюдать большую вариабельность. Этот трудоемкий анализ требует специализированных технических специалистов, обученных работе на объекте уровня биобезопасности 3 (BSL3), значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, занимает от 4 до 6 недель и подвержен загрязнению.
В этом исследовании мы описываем оптимизированный метод пересчета колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), и предлагаем простое и быстрое решение для анализа результатов 15,16,17,18,19,20. Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Мы полагаем, что этот метод должен быть повсеместно принят для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза. Наконец, этот оптимизированный метод подсчета КОЕ был использован для количественного определения не только микобактерий, но и других бактерий, таких как Escherichia coli и Ralstonia solanacearum21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, предназначен для БЦЖ, но может быть применен к любым микобактериям. БЦЖ может быть использована в качестве суррогатной бактерии для экспериментов по борьбе с туберкулезом, когда средства BSL3 недоступны22. Следующие процедуры с использованием БЦЖ должны выполняться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL2) и в соответствии с соответствующими рекомендациями по биобезопасности и надлежащей лабораторной практикой для манипуляций с микроорганизмами 2-й группы опасности.
1. Приготовление питательных сред
- Приготовьте бульон Middlebrook 7H9 с добавлением 10% (v/v) олеиновой кислоты, альбумина, декстрозы и каталазы (OADC) в соответствии с инструкциями поставщика. Добавьте в бульон 0,05% (v/v) тилоксапола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тилоксапол представляет собой неионогенный жидкий полимер, который используется в качестве поверхностно-активного вещества для предотвращения образования бактериальных комков16. - Приготовьте твердую среду Middlebrook 7H10 с добавлением 10% (v/v) обогащения OADC в соответствии с инструкциями поставщика.
- Распределите 40 мл среды на квадратную чашку Петри (120 мм x 120 мм). Дайте пластинам высохнуть, чтобы свести к минимуму конденсацию на поверхности агара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот специфический размер чашки Петри является основополагающим для обеспечения прямой транспонации по крайней мере 96 капель из 96-луночной чашки. Эффективная сушка пластин в дальнейшем облегчит покрытие мелкими каплями бактериальной суспензии и предотвратит их распространение. - Для получения инфекционной среды подготовьте либо среду Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640), либо модифицированную среду Eagle Medium (DMEM) Dulbecco. В любом случае добавьте в среду 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% L-глютамина и 1 мМ пирувата натрия. Не добавляйте в среду пенициллин и стрептомицин.
2. Пробоподготовка
- Получение образцов из различных источников. Как правило, для количественного определения КОЕ для оценки эффективности противотуберкулезной вакцины берут образцы из тканей вакцинированных и невакцинированных животных. Например, промывание легких и селезенки мышей11 или легких, грудных и периферических лимфатических узлов, селезенки, печени, кожи, крови, костного мозга и бронхоальвеолярного лаважа23. В качестве альтернативы можно получить образцы из культур in vitro макрофагов/дендритных клеток/нейтрофилов, инфицированных БЦЖ 18,19,20,24,25,26.
3. Производство культуры БЦЖ
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью исследований противотуберкулезных вакцин in vivo является повышение эффективности БЦЖ. Поэтому в качестве контроля, как правило, используются группы, привитые БЦЖ. Штаммы БЦЖ, используемые для вакцинации людей, идеально подходят для тестирования на животных моделях. В этом случае культура БЦЖ должна быть восстановлена в соответствии с инструкциями поставщика27. Тем не менее, культура БЦЖ для исследований in vivo также может быть произведена собственными силами11. Получение одноклеточной, однородной и высококачественной культуры БЦЖ для протоколов инфекции in vitro было очень успешно получено в нескольких исследованиях 11,16,18,19,20,26,28,29 с использованием следующего протокола, который также может быть использован для исследований на животных.
- Культивирование 50 мл БЦЖ в бульоне 7H9, при 37 °C, с перемешиванием при 200 об/мин. Изменяйте громкость в соответствии с потребностями эксперимента.
- Ежедневно в течение 8-10 дней собирают 100 мкл культуры и разбавляют ее, добавляя 900 мкл PBS в кювету объемом 1 мл. Затем приступают к измерению оптической плотности бактерий (OD при λ=600 нм; OD600) в спектрофотометре. Постройте кривую роста из этих значений. Определите среднюю логарифмическую фазу культуры (когда наружный диаметр постоянно удваивается в единицу времени).
- Подготовьте следующую культуру и инкубируйте до достижения средней/поздней фазы роста бревен, как описано в шагах 3.1 и 3.2. Используйте значения, полученные на предыдущем шаге, в качестве ориентира. Следите за тем, чтобы культура не достигла фазы стационарного роста (когда наружный диаметр начинает стабилизироваться), чтобы сохранить культуру жизнеспособных бактерий хорошего качества.
- Собирают культуру в средней/поздней фазе роста бревна. Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 10 мл PBS, чтобы смыть бактерии. Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте бактерии с помощью 5 мл инфекционной среды. Поместите трубку в ультразвуковую ванну на 15 мин, на полную мощность при 80 Гц.
- Центрифуга при 1000 x g в течение 10 мин. Соберите надосадочную жидкость, избегая гранул, так как она богата бактериальными скоплениями, которых следует избегать в высококачественной культуре БЦЖ, и выбросьте ее.
- Измерьте наружный диаметр надосадочной жидкости. Здесь культуры в фазе экспоненциального роста с OD600 , равным 0,1, эквивалентны 1 x 107 КОЕ/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория должна построить свои собственные кривые роста БЦЖ перед началом экспериментов по установлению линейной регрессии между OD600 и КОЕ с помощью спектрофотометра. Обратите внимание, что спектрофотометры имеют разные расстояния светового пути, что может варьировать показания, полученные для одного и того же образца. - Проведите несложные расчеты, чтобы установить количество бактерий, которые необходимо добавить в каждую культуру клеток хозяина. Количество бактерий в клетке-хозяине называется множественностью инфекции (MOI). Используйте MOI из 10 бактерий на клетку-хозяина, что является наиболее распространенным MOI, используемым для экспериментов с инфекцией БЦЖ.
4. Анализ микроколониеобразующей единицы
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента с инфекцией in vivo или in vitro подсчет бактерий может быть выполнен с помощью мКОЕ. Для исследований in vivo образцы должны быть сначала гомогенизированы в бисерном венчике или другом тканевом гомогенизаторе. Для in vitro культур макрофагов/дендритных клеток/нейтрофилов, инфицированных БЦЖ, образцы должны быть лизированы с использованием неионогенного детергента (например, 0,05% раствора неионного, неденатурирующего детергента).
- Серийные разведения с использованием 96-луночного планшета: выполняют серийные 10-кратные разведения лизатов, в стерильной 96-луночной планшете по схеме на рисунке 1А. Распределите лизаты по рядам А и Е. Для каждой пластины максимальное количество образцов и/или реплик составляет 24.
- Добавьте 180 мклdH2Oв оставшиеся лунки для выполнения серийного разбавления.
- С помощью 12-канальной пипетки ресуспендируйте лизаты в ряду А и перенесите 20 мкл в ряд В (20 мкл лизата + 180 мкл dH2O). Хорошо гомогенизировать. Последовательно повторите этот шаг для рядов B и C, пока не дойдете до последнего разведения в ряду D.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы выполняем три разведения (100, 101, 102, 103), таким образом, используя 4 ряда планшета (A-D или E-H) для каждого набора из 12 образцов и/или репликаций. - Нанесение микрокапельного покрытия: используйте многоканальную пипетку объемом 0,5–10 мкл (предпочтительнее использовать тонкие наконечники) для переноса 5 мкл из каждого ряда 96-луночного планшета на квадратную пластину со твердой средой, как показано на рисунке 1B.
- Медленно пипетируя капли объемом 5 мкл, дайте им слегка коснуться агара. Это поможет отвести каплю от кончика по направлению к агару и уменьшит возможность задержки жидкости внутри наконечника.
- Дайте каплям высохнуть, закройте агаровую пластину и инкубируйте ее при температуре 37 °C, наблюдая за ростом бактерий. По желанию инкубируйте пластины с агаром в герметичном полиэтиленовом пакете, чтобы предотвратить высыхание пластин.
- Подсчет микроколоний: примерно через 6-10 дней инкубации проверьте наличие отдельных колоний, видимых невооруженным глазом (рисунок 2).
- Подсчитайте колонии, используя объектив с наименьшим увеличением (4x или ниже) инвертированного оптического микроскопа или увеличительного стекла. Подсчеты следует проводить в разведениях, где число пчелосемей меньше 300 и выше 30. В качестве альтернативы можно использовать камеру, чтобы сфотографировать каплю, чтобы вручную подсчитать колонии на компьютере, или использовать программное обеспечение, такое как ImageJ, для автоматизации подсчета колоний.
- Чтобы выразить количество клеток в КОЕ/мл, используйте следующее уравнение:
Где C = количество подсчитанных колоний, V = объем в мкл, а Dil = разведение при подсчете колоний (100, 101, 102, 103). Например, если в капле 5 мкл в разведении 102 насчитали 30 колоний, то:
Рисунок 1. Схематическое изображение протокола mCFU. (А) Последовательные 10-кратные разведения БЦЖ-содержащих лизатов в 96-луночном планшете. (B) Квадратная чашка Петри, содержащая твердую питательную среду и покрытая 96 каплями по 5 мкл каждая. Капли пипетируются непосредственно из 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Микроколониеобразующие единицы БЦЖ после 10 дней инкубации. Слева фотография квадратной чашки Петри, наложенной на 96 капель по 5 мкл каждая, как ранее было представлено на рисунке 1B. Справа отдельные фотографии 3 капель соответствуют исходному лизату (100) и двум разведениям (101, 102). Фотографии были сделаны с помощью DSRL-камеры, оснащенной зум-объективом 18-55 мм (пластина) или макрообъективом 105 мм (капли). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
5. Подсчет микроколониеобразующих единиц на Фиджи (ImageJ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод мКОЕ позволяет количественно определять КОЕ для больших наборов образцов. Изображения капель могут быть записаны для апостериорного анализа, чтобы облегчить подсчет колоний. Несколько фотоустройств могут производить изображения с достаточным для этой цели качеством. К ним относятся цифровые фотоаппараты, веб-камеры, микроскопы и увеличительные стекла, прикрепленные к камере, а также сотовые телефоны. Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений, такое как ImageJ, предлагает возможность ручного или автоматизированного подсчета колоний на этих изображениях. Для демонстрации обоих методов будет использован метод Фиджи, представляющий собой дистрибутив ImageJ, включающий в себя несколько инструментов для научного анализа изображений30. Фиджи можно загрузить с https://fiji.sc/.
- Ручной метод подсчета
- Откройте изображение, содержащее mCFU на Фиджи. Выберите «Плагины» > «Анализ счетчика ячеек» > «Анализ».
- В меню Счетчик ячеек выберите команду Инициализация , а затем выберите счетчик (например, Введите 1).
- Продолжайте, нажимая на каждую колонию. Каждый клик будет отображаться на картинке и обновлять счетчик (рисунок 3). Чтобы отменить случайные щелчки, выберите Удалить.
- Зарегистрируйте значение, отображаемое на счетчике. Нажмите кнопку Сбросить , чтобы сбросить счетчик и открыть новое изображение для подсчета дополнительных образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшие инструкции по этому плагину можно найти на https://imagej.net/plugins/cell-counter.
- Автоматизированный метод подсчета
- Откройте изображение, содержащее mCFU на Фиджи. Выберите «Изображение» > введите > 8 бит. Это преобразует изображение в 8-битное изображение в оттенках серого.
- Выберите инструмент «Овал » на панели инструментов и нарисуйте овал вокруг области с колониями (рис. 4A). Овал может быть скорректирован после того, как он будет нарисован.
- Выберите Edit > Clear Outside, чтобы удалить все помехи из внешней области (рисунок 4B). Выберите «Изображение» > «Настроить порог >».
- Перемещайте ползунки в меню порога до тех пор, пока колонии не станут красными и фоновый шум не будет сведен к минимуму (рис. 4C).
- Выберите Применить и выйдите из окна порогового значения. Создается черно-белое изображение (рис. 4D).
- Выберите «Анализ» > «Анализ частиц». В окне анализа частиц укажите диапазон площади колонии (от 1 до бесконечности, измеряется в квадратах пикселей) и круговости (от 0 до 1, где 1 — идеальная окружность; Рисунок 4E).
- Выберите «Контуры» во всплывающем меню «Показать». Отметьте Показать результаты для получения подробных измерений для каждой колонии в окне результатов. Установите флажок «Очистить результаты», чтобы стереть все предыдущие измерения. Установите флажок Суммировать, чтобы отобразить сводные результаты измерений (рис. 4E).
- Запустите анализатор, нажав кнопку ОК. Появится новое окно, в котором будут отображены все выделенные колонии, которые были обнаружены и подсчитаны. В окне результатов отображаются подробные сведения о каждой колонии, а в окне сводных результатов отображается общее количество подсчитанных колоний (рис. 4F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки размера и округлости будут варьироваться в зависимости от разрешения и увеличения изображения, а также размера и формы колоний. Повторяйте процесс несколько раз, пока не будут найдены наилучшие настройки, которые обнаруживают все колонии. Дальнейшие инструкции по плагину analyze particles можно найти на странице https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.
Рисунок 3. Ручной метод подсчета mCFU с помощью плагина счетчика клеток в программном обеспечении Fiji. Синие точки обозначают колонии, на которые уже нажал пользователь. В меню справа отображается количество подсчитанных на данный момент колоний (всего 41). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Автоматизированный метод подсчета мКОЕ с использованием программного обеспечения Fiji. (А, Б) Область интереса с колониями выбирается с помощью инструмента «Овальное выделение», а внешняя область удаляется с помощью команды «Очистить снаружи». (С, Г) Черно-белое изображение колоний генерируется с помощью инструмента порог. (Е, Ф) Количество колоний количественно оценивается с помощью инструмента анализа частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный здесь анализ мКОЕ увеличивает объем информации, которую можно получить из одной чашки Петри, по крайней мере, в 96 раз. На рисунке 5 показано сравнение двух методов доставки лекарственного средства для перепрофилированного использования саквинавира (SQV)31,32 в качестве препарата, направленного на хозяина для лечения туберкулеза. В этом анализе были использованы четыре различных штамма Mycobacterium tuberculosis для инфицирования первичных макрофагов человека. М. туберкулёз Лабораторный штамм H37Rv и три клинических штамма, выделенных от пациентов с активной формой туберкулеза доктором Рикардо Жоржи из Португальского национального института здравоохранения (INSA): лекарственно-чувствительный штамм (код INSA 33427), штамм с множественной лекарственной устойчивостью (код INSA 34192) и штамм с широкой лекарственной устойчивостью (XDR) (код INSA 163761). Каждая инфекция, вызванная каждым штаммом, была дополнительно размножена в восьми различных условиях лечения, сравнивая три различные концентрации свободных лекарств или липосомных препаратов с соответствующими контрольными группами, не получавшими лечения. Наконец, каждое состояние было проанализировано в четыре разных момента времени после заражения. Для количественной оценки внутриклеточного роста бактерий общее количество лизатов, извлеченных из каждого момента времени, составило 32. За этим последовало три последовательных разведения каждого лизата, увеличив количество до 128 образцов. Умноженные на четырехкратные проанализированные результаты в 512 выборках. Поскольку эксперимент был повторен с использованием макрофагов как минимум от трех разных доноров крови, общее количество анализируемых образцов увеличилось до 1536. Используя описанный здесь метод мКОЕ, в этом эксперименте было получено только 16 квадратных чашек Петри против 1536, которые потребовались бы при использовании стандартного протокола КОЕ. Как показано на рисунке 5, результаты, полученные с помощью этого метода, могут продемонстрировать статистически значимые различия между методами лечения.
Рисунок 5. Метод мКОЕ позволяет получать большие объемы данных с небольшого количества агаровых пластин. В этой серии экспериментов проверялась эффективность препарата саквинавир (SQV) для индуцирования внутриклеточного уничтожения лабораторных и клинических штаммов M.tb в макрофагах человека. SQV вводили культурам макрофагов в свободной форме или загружали в липосомы (LipSQV). Обработка проводилась в трех различных концентрациях: 50, 20 и 10 мкг/мл. Макрофаги инфицировали различными штаммами M.tb в течение 3 ч, а затем обрабатывали выбранными концентрациями LipSQV и свободного SQV. В качестве контроля использовали липосомы без препарата (LipUnloaded) и ДМСО. Для оценки внутриклеточной выживаемости бактерий в дискретные моменты времени лизировали макрофаги, а серийные разведения бактериальной суспензии наносили на агаровые пластины 7H10. Единицы мКОЕ подсчитывали через 2-3 недели. Линии показывают среднее количество мКОЕ на образец, по крайней мере, в 3 независимых экспериментах. Столбцы представляют собой среднее процентное соотношение мКОЕ, рассчитанное по отношению к соответствующим контрольным группам на 7-й день после заражения. Символы обозначают каждый эксперимент с макрофагами от разных доноров. Столбцы погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Множественные групповые сравнения проводились с использованием одностороннего ANOVA с последующим post-hoc тестом Holm-Sidak. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Эта цифра была изменена с33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Туберкулез является серьезной проблемой общественного здравоохранения, приобретающей все большее значение, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. Перебои в работе медицинских учреждений по диагностике и лечению туберкулеза во время пандемии COVID-19 оказали негативное влияние на заболеваемость новыми случаями1. Кроме того, для борьбы с этой эпидемией необходимо срочно бороться с мультилекарственными штаммами и штаммами М.тб с широкой лекарственной устойчивостью, а также с сочетанной инфекцией М.тб и ВИЧ 1,34. Новые вакцины, заменяющие или улучшающие БЦЖ, в настоящее время проходят клинические испытания, и новые кандидаты могут появиться на рынке вближайшие годы. Разработка новых вакцин-кандидатов против туберкулеза основывается на доклинических исследованиях с использованием различных моделей на животных. Определение эффективности вакцины на животных моделях требует количественного определения бактериальной нагрузки в инфицированных органах, чтобы продемонстрировать защитный эффект вакцины 5,36. В настоящее время существуют прямые и косвенные методы количественной оценки бактериальной нагрузки у инфицированных мышей и нечеловекообразных приматов. К прямым методам относятся гистологические препараты и бактериальное окрашивание с использованием флуоресцентного аурамина-о и Ziehl-Neelsen37, количественное определение микобактериальной нагрузки в образцах на основе RT-qPCR38 и другие.
Анализ ингибирования роста микобактерий (MGIA) представляет собой анализ in vitro , основанный на системе BACTEC MGIT, и является чувствительным методом, используемым для количественной оценки живой микобактериальной нагрузки у вакцинированных и невакцинированных животных. Система представляет собой полностью автоматизированный прибор, который может проверять наличие микобактерий в специально разработанных пробирках. Флакон содержит флуоресцентный репортер, который реагирует на концентрацию кислорода в образце. Флуоресценция пропорциональна количеству потребляемого кислорода, давая представление о количестве живых бактерий, присутствующих в образце, каждый час39. При методе MGIA МПМК и образцы аутологичной сыворотки крови собирают у животных и культивируют совместно с микобактериями в течение 96 ч. Затем адгезивные моноциты лизируются для высвобождения внутриклеточных микобактерий. Система будет количественно определять бактериальную нагрузку косвенно, измеряя потребление кислорода40. Этот метод, как правило, используется для исследований лекарственной устойчивости, но в последнее время применяется для оценки эффективности противотуберкулезнойвакцины40.
Эти методы могут быть дополнены стандартным КОЕ для определения общего количества жизнеспособных микобактерий. Например, оценка вакцин-кандидатов в эксперименте с мышиным аэрозолем M.tb достигается путем пересчета колоний, полученных из тканей с помощью КОЕ11.
Описанный здесь метод мКОЕ может быть существенным улучшением по сравнению с классическим методом КОЕ, поскольку он более быстр в исполнении и недорог с точки зрения используемых реагентов и требуемого лабораторного пространства. Этот метод позволяет одновременно сравнивать большой набор образцов в одном эксперименте, тем самым уменьшая влияние вариаций от анализа к анализу. Например, как показано в эксперименте, описанном на рисунке 5, КОЕ был определен для 1536 образцов методом мКОЕ в 16 квадратных чашках Петри, что представляет собой 96-кратное сокращение количества используемых планшетов. Это более актуально для экспериментов с использованием первичных биологических и клинических образцов, где доступность может быть проблемой. Компактная форма, в которой колонии отображаются на агаровой пластине, позволяет использовать специализированное или обычное оборудование для записи изображений. Это, в сочетании с автоматизированными методами подсчета колоний, подобными описанному здесь с использованием программного обеспечения Fiji, помогает снизить зависимость от способности пользователя идентифицировать и количественно оценить КОЕ. Тем не менее, как и стандартный метод КОЕ, этот метод страдает от неспособности различать объединенные колонии, что приводит к потенциальной недостаточной представленности КОЕ. Однако это можно свести к минимуму, выбрав более высокое разбавление для количественного определения или подсчитав колонии под микроскопом до того, как их чрезмерный рост приведет к слиянию колоний. Это более актуально, если в образце образуются колонии с неоднородными темпами роста. В этих случаях исследователи должны проверить реализацию mCFU для своих конкретных экспериментальных условий.
Важнейшими этапами в рамках протокола являются следующие пункты: серийные разведения должны выполняться с использованием 96-луночного планшета, и разведения должны быть тщательно перемешаны; микрокапельное покрытие следует проводить многоканальной пипеткой 0,5-10 мкл для переноса 5 мкл из каждого ряда 96-луночного планшета на твердую квадратную пластину среды, не касаясь и не повреждая среду; Подсчет микроколоний необходимо проводить между 6-10 днями инкубации. Тем не менее, во время подсчета необходимо следить за тем, чтобы колонии не были чрезмерно большими или слишком маленькими.
Модификации и устранение неполадок метода включают в себя использование различных бактериальных штаммов. Поэтому для каждого штамма следует использовать оптимальную питательную среду. Ограничения метода идентичны ограничениям традиционного метода КОЕ, которые включают в себя сложность подсчета бактерий в низких разведениях. Кроме того, специфическими ограничениями этого метода является необходимость использования микроскопа для подсчета колоний.
Наконец, этот метод может быть использован для количественной оценки бактериальной нагрузки в исследованиях вакцинации против туберкулеза, а также для тестовых исследований лекарственной устойчивости/восприимчивости и исследований взаимодействия патогена и хозяина. Например, на рисунке 5 показано применение мКОЕ для определения внутриклеточного уничтожения штаммов M.tb , включая клинические штаммы, штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и штаммы с широкой лекарственной устойчивостью, обработанные различными лекарственными препаратами, в макрофагах человека. Важно отметить, что этот метод может быть применен и к любому микроорганизму при условии соблюдения условий культивирования для каждого организма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DP и PJGB заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана внутренним финансированием медицинского факультета Португальского католического университета и внешним финансированием Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) в рамках грантов UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 и EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 - 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
References
- World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O.
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D.
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J.
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
