Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

فحص وحدة تشكيل المستعمرات الدقيقة لتقييم فعالية اللقاحات ضد السل

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

تحديد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) هو الأسلوب القياسي الذهبي لقياس البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرة السلية التي قد تستغرق أسابيع لتشكيل مستعمرات مرئية. هنا نصف وحدة CFU الصغيرة لتحديد CFU مع زيادة كفاءة الوقت ، وتقليل مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، وقابلية التوسع في تجارب الإنتاجية المتوسطة والعالية.

Abstract

قتل السل (TB) ، وهو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم بسبب عامل معدي ، 1.6 مليون شخص في عام 2022 ، ولم يتجاوزه سوى COVID-19 خلال جائحة 2019-2021. هذا المرض ناجم عن بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb). سلالة المتفطرة البوفية Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ، لقاح السل الوحيد ، هي أقدم لقاح مرخص في العالم ، ولا يزال قيد الاستخدام. حاليا ، هناك 12 لقاحا في التجارب السريرية وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري. الطريقة المفضلة المستخدمة لتقييم فعالية لقاحات السل في الدراسات قبل السريرية هي تعداد المستعمرات البكتيرية بواسطة فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU). يستغرق هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا من 4 إلى 6 أسابيع حتى ينتهي ، ويتطلب مساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، وله تكاليف كاشف عالية ، وعرضة للتلوث. نصف هنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، وهي micro-CFU (mCFU) ، والتي تقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل نتائج فعالية لقاح السل . يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. علاوة على ذلك ، لتقييم فعالية لقاح السل ، يمكن الحصول على عينات من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك الأنسجة من الملقحة المصابة بالمتفطرات. كما وصفنا طريقة محسنة لإنتاج ثقافة متفطرات أحادية الخلية وموحدة وعالية الجودة لدراسات العدوى. وأخيرا، نقترح اعتماد هذه الأساليب عالميا في الدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل.

Introduction

السل (TB) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم من قبل عامل معدي واحد ، بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb) ، مما يؤدي إلى مقتل عدد أكبر من الناس أكثر من أي ممرض آخر. في عام 2021 ، كان السل مسؤولا عن 1.6 مليون حالة وفاة وتجاوزه COVID-19 خلال جائحة 2019-20211. علاوة على ذلك ، وفقا لتقرير السل العالمي الصادر عن منظمة الصحة العالمية لعام 2022 ، كانت جائحة COVID-19 مسؤولة عن زيادة حالات السل الجديدة. كما أبلغت منظمة الصحة العالمية عن انخفاض كبير في عدد الأشخاص الذين تم تشخيص إصابتهم بالسل خلال هذه الفترة ، مما قد يزيد من عدد حالات السل1.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG) هي سلالة حية موهنة من المتفطرة البوفية المسببة للأمراض ، والتي استخدمت لأول مرة كلقاح منذ أكثر من 100 عام. هذا هو اللقاح الوحيد ضد السل وهو أقدم لقاح مرخص في العالم لا يزال قيد الاستخدام 2,3. حاليا ، هناك 12 لقاحا في مراحل مختلفة من التجارب السريرية4 ، وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري 5,6. يشمل التقييم قبل السريري للقاحات ضد السل تقييم السلامة والمناعة7 ، والتي يمكن الحصول عليها في نماذج حيوانية متنوعة مثل الزرد والفئران وخنازير غينيا والأرانب والماشية والرئيسيات غير البشرية8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تقييم قدرة اللقاح على تحفيز الحماية من عدوى السل المتعدد الأطراف و / أو انتقاله ، أي فعالية اللقاح ، تحدي السل متعدد السل في الجسم الحي 5,11. ومن المثير للاهتمام ، أن تطعيم BCG يحفز تأثيرات غير محددة تؤثر على بقاء مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية الأخرى12,13 من خلال آلية المناعة المدربة14. لتحديد العبء البكتيري القابل للحياة في مصاب ، فإن الطريقة المفضلة هي تعداد المستعمرات البكتيرية من خلال فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU) 5,15. CFU هي وحدة تقدر عدد الكائنات الحية الدقيقة (البكتيريا أو الفطريات) التي تشكل مستعمرات في ظل ظروف نمو محددة. تنشأ وحدات CFU من الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة والقابلة للتكرار ، ويصعب تقدير العدد المطلق للكائنات الحية الدقيقة داخل كل مستعمرة. من غير المؤكد ما إذا كانت المستعمرة قد نشأت من واحد أو أكثر من الكائنات الحية الدقيقة. تعكس وحدة CFU عدم اليقين هذا ، وبالتالي يمكن ملاحظة تباين كبير في النسخ المتماثلة لنفس العينة. يتطلب هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا فنيين متخصصين مدربين للعمل في مرفق من مستوى السلامة الأحيائية 3 (BSL3) ، ومساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، ويستغرق من 4 إلى 6 أسابيع للانتهاء ، وهو عرضة للتلوث.

في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، micro-CFU (mCFU) ، ونقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل النتائج15،16،17،18،19،20. يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. نقترح اعتماد هذه الطريقة عالميا للدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح ، مما يؤدي في النهاية إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل. أخيرا ، تم استخدام هذه الطريقة المثلى لتعداد CFU لتحديد ليس فقط المتفطرات ولكن أيضا البكتيريا الأخرى ، مثل الإشريكية القولونية ورالستونيا سولاناسيروم21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا خاص ب BCG ولكن يمكن تطبيقه على أي متفطرات. يمكن استخدام BCG كبكتيريا بديلة لتجارب السل عندما لا تتوفر مرافق BSL322. يجب تنفيذ الإجراءات التالية باستخدام BCG في مختبر مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL2) واتباع إرشادات السلامة البيولوجية المناسبة والممارسات المختبرية الجيدة لمعالجة الكائنات الحية الدقيقة من المجموعة الخطرة 2.

1. إعداد الإعلام الثقافي

  1. قم بإعداد مرق Middlebrook 7H9 المكمل بتخصيب 10٪ (v / v) من حمض الأوليك والألبومين وسكر العنب والكاتلاز (OADC) ، وفقا لتعليمات المورد. تكملة المرق مع 0.05 ٪ (v / v) من tyloxapol.
    ملاحظة: Tyloxapol هو بوليمر سائل غير أيوني تم استخدامه كخافض للتوتر السطحي لمنع تكوين التكتل البكتيري16.
  2. قم بإعداد وسط Middlebrook 7H10 الصلب المكمل بتخصيب OADC بنسبة 10٪ (v / v) وفقا لتعليمات المورد.
  3. توزيع 40 مل من المتوسط لكل طبق بتري مربع (120 مم × 120 مم). اترك الألواح تجف لتقليل التكثيف على سطح الأجار.
    ملاحظة: هذا الحجم المحدد لطبق بتري أساسي للسماح بالنقل المباشر لما لا يقل عن 96 قطرة من لوحة 96 بئرا. سيسهل التجفيف الفعال للألواح لاحقا طلاء قطرات صغيرة من التعليق البكتيري ويمنع انتشار القطرات.
  4. قم بإعداد إما وسيط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI 1640) أو وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) لإنتاج وسط العدوى. في كلتا الحالتين ، استكمل الوسط بمصل عجل الجنين 10٪ ، و 1٪ L-glutamine ، و 1 mM بيروفات الصوديوم. لا تضيف البنسلين والستربتومايسين إلى الوسط.

2. إعداد عينة

  1. الحصول على عينات من مجموعة متنوعة من المصادر. عادة ، لتحديد CFU لتقييم فعالية لقاح السل ، والحصول على عينات من الأنسجة الحيوانية الملقحة وغير المحصنة. على سبيل المثال ، رئة الفأر والطحال11 أو رئة المكاك والغدد الليمفاوية الصدرية والمحيطية والطحال والكبد والجلد والدم ونخاع العظام وغسل القصباتالهوائية 23. بدلا من ذلك ، احصل على عينات من الثقافات المختبرية للبلاعم / الخلايا المتغصنة / العدلات المصابة ب BCG18،19،20،24،25،26.

3. إنتاج ثقافة BCG

ملاحظة: بالنسبة للدراسات في الجسم الحي للقاحات السل ، فإن الهدف هو تحسين فعالية BCG. لذلك ، عادة ما تستخدم المجموعات الملقحة ضد BCG كعنصر تحكم. تعتبر سلالات BCG المستخدمة للتطعيم البشري مثالية للاختبار في النماذج الحيوانية. في هذه الحالة ، يجب إعادة تشكيل ثقافة BCG وفقا لتعليمات المورد27. ومع ذلك ، يمكن أيضا إنتاج ثقافة BCG للدراسات في الجسم الحي داخليا11. تم إنتاج زراعة BCG أحادية الخلية وموحدة وعالية الجودة لبروتوكولات العدوى في المختبر بنجاح كبير في العديد من الدراسات11،16،18،19،20،26،28،29 ، باستخدام البروتوكول التالي ، والذي يمكن استخدامه أيضا لدراسات التحدي الحيواني.

  1. استزرع 50 مل من BCG في مرق 7H9 ، عند 37 درجة مئوية ، مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة. قم بتغيير الحجم وفقا لاحتياجات التجربة.
  2. كل يوم ، لمدة 8-10 أيام ، اجمع 100 ميكرولتر من الثقافة وقم بتخفيفها بإضافة 900 ميكرولتر من PBS في كفيت سعة 1 مل. ثم تابع بقياس الكثافة البصرية للبكتيريا (OD عند λ = 600 نانومتر ؛ OD600) في مقياس الطيف الضوئي. ارسم منحنى نمو من تلك القيم. حدد مرحلة منتصف السجل للثقافة (عندما يتضاعف التطوير التنظيمي باستمرار لكل وحدة زمنية).
  3. قم بإعداد مزرعة لاحقة واحتضانها حتى الوصول إلى مرحلة نمو السجل المتوسط / المتأخر كما في الخطوتين 3.1 و 3.2. استخدم القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة كإرشاد. تأكد من أن المزرعة لا تصل إلى مرحلة النمو الثابت (عندما يبدأ OD في الاستقرار) للحفاظ على ثقافة ذات نوعية جيدة من البكتيريا القابلة للحياة.
  4. اجمع الثقافة في مرحلة نمو السجل المتوسطة / المتأخرة. أجهزة الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 10 دقائق. إزالة الطاف.
  5. أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني لغسل البكتيريا. أجهزة الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 10 دقائق. إزالة الطاف.
  6. أعد تعليق البكتيريا ب 5 مل من وسائط العدوى. ضع الأنبوب في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة ، بكامل طاقته عند 80 هرتز.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية مع تجنب الحبيبات لأنها غنية بالكتل البكتيرية التي يجب تجنبها في ثقافة BCG عالية الجودة وتخلص منها.
  8. قياس OD من طاف. هنا ، الثقافات في مرحلة النمو الأسي ، معOD 600 من 0.1 ، تعادل 1 × 107 CFU / mL.
    ملاحظة: يجب على كل مختبر إنتاج منحنيات نمو BCG الخاصة به قبل بدء التجارب لإنشاء انحدار خطي بين OD600 و CFU باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يرجى ملاحظة أن مقاييس الطيف الضوئي لها مسافات مسار ضوئية مختلفة ، والتي يمكن أن تختلف القراءات التي تم الحصول عليها لنفس العينة.
  9. قم بإجراء حسابات بسيطة لتحديد عدد البكتيريا المراد إضافتها إلى كل مزرعة خلية مضيفة. عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة هو تعدد العدوى (MOI). استخدم MOI من 10 بكتيريا لكل خلية مضيفة ، وهو MOI الأكثر شيوعا المستخدم في تجارب عدوى BCG.

4. فحص وحدة تشكيل المستعمرة الدقيقة

ملاحظة: بعد الانتهاء من تجربة العدوى في الجسم الحي أو في المختبر ، يمكن إجراء تعداد البكتيريا بواسطة mCFU. بالنسبة للدراسات في الجسم الحي ، يجب أولا تجانس العينات في مضرب حبة أو خالط آخر للأنسجة. بالنسبة للمزارع المختبرية للبلاعم / الخلايا المتغصنة / العدلات المصابة ب BCG ، يجب تحليل العينات باستخدام منظف غير أيوني (على سبيل المثال ، محلول 0.05٪ من منظف غير أيوني وغير مسخ).

  1. التخفيفات التسلسلية باستخدام صفيحة 96 بئرا: قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من الليزات ، في لوحة معقمة ذات 96 بئرا وفقا للمخطط في الشكل 1 أ. وزع المحللات على الصفين A و E. لكل لوحة ، الحد الأقصى لعدد العينات و / أو النسخ المتماثلة هو 24.
  2. أضف 180 ميكرولتر من dH2O إلى الآبار المتبقية لإجراء التخفيف التسلسلي.
  3. باستخدام ماصة ذات 12 قناة ، أعد تعليق المحللين في الصف A وانقل 20 ميكرولتر إلى الصف B (20 ميكرولتر محللة + 180 ميكرولتر dH2O). تجانس جيدا. كرر هذه الخطوة بالتتابع للصفين B و C حتى تصل إلى التخفيف الأخير في الصف D.
    ملاحظة: نقوم عادة بإجراء ثلاثة تخفيفات (100 ، 101 ، 102 ، 103) ، وبالتالي نستخدم 4 صفوف من اللوحة (A-D أو E-H) لكل مجموعة من 12 عينة و / أو مكررة.
  4. طلاء القطيرات الدقيقة: استخدم ماصة متعددة القنوات 0.5-10 ميكرولتر (يفضل أطراف رفيعة) لنقل 5 ميكرولتر من كل صف من لوحة 96 بئرا إلى اللوحة المربعة المتوسطة الصلبة ، وفقا للشكل 1 ب.
  5. أثناء سحب قطرات 5 ميكرولتر ببطء ، اسمح لها بلمس الأجار قليلا. سيساعد ذلك على خلع القطرة من الحافة باتجاه الآجار وتقليل إمكانية الاحتفاظ بالسائل داخل الحافة.
  6. اترك القطرات تجف ، وأغلق صفيحة الآجار ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية أثناء مراقبة نمو البكتيريا. اختياريا ، احتضان ألواح أجار في كيس بلاستيكي مغلق لمنع الألواح من الجفاف.
  7. عد المستعمرات الدقيقة: بعد حوالي 6-10 أيام من الحضانة ، تحقق من وجود مستعمرات فردية مرئية للعين المجردة (الشكل 2).
  8. عد المستعمرات باستخدام أقل هدف تكبير (4x أو أقل) للمجهر البصري المقلوب أو العدسة المكبرة. يجب إجراء العد في التخفيفات حيث يكون عدد المستعمرات أقل من 300 وأعلى من 30. بدلا من ذلك ، استخدم كاميرا لالتقاط صورة للقطرات لحساب المستعمرات يدويا على الكمبيوتر أو استخدم برنامجا مثل ImageJ لأتمتة عد المستعمرات.
  9. للتعبير عن أرقام الخلايا في CFU / mL ، استخدم المعادلة التالية:
    Equation 1
    حيث C = عدد المستعمرات التي تم حسابها ، V = الحجم مطلي بالميكرولتر ، و Dil = التخفيف حيث تم حساب المستعمرات (100 ، 101 ، 102 ، 103). على سبيل المثال ، إذا تم حساب 30 مستعمرة في قطرة 5 ميكرولتر في التخفيف 102 ، فعندئذ:
    Equation 2

Figure 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لبروتوكول mCFU. (أ) التخفيفات المتسلسلة بمقدار 10 أضعاف للمحللات المحتوية على BCG في صفيحة 96 بئرا. (ب) طبق بتري مربع يحتوي على وسط استزراع صلب ومغطى ب 96 قطرة كل منها 5 ميكرولتر. يتم سحب القطرات مباشرة من لوحة 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. وحدات تشكيل مستعمرة صغيرة من BCG بعد 10 أيام من الحضانة. على اليسار ، صورة لطبق بتري مربع مغطى ب 96 قطرة كل منها 5 ميكرولتر ، كما هو موضح سابقا في الشكل 1ب. على اليمين ، تتوافق الصور الفردية المكونة من 3 قطرات مع محللة أصلية (100) وتخفيفين (101 ، 102). تم التقاط الصور باستخدام كاميرا DSRL مزودة بعدسة تكبير 18-55 مم (لوحة) أو عدسة ماكرو 105 مم (قطرات). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. عد وحدات تشكيل المستعمرات الصغيرة في فيجي (ImageJ)

ملاحظة: تسمح طريقة mCFU بتحديد كمية CFU لمجموعات كبيرة من العينات. يمكن تسجيل صور القطرات للتحليل الخلفي لتسهيل عد المستعمرات. يمكن للعديد من أجهزة التصوير الفوتوغرافي إنتاج صور بجودة كافية لهذا الغرض. وتشمل هذه الكاميرات الرقمية وكاميرات الويب والمجاهر المرفقة بالكاميرا والنظارات المكبرة والهواتف المحمولة. يوفر برنامج تحليل الصور المجاني مثل ImageJ إمكانية عد المستعمرات يدويا أو آليا في تلك الصور. لإثبات كلتا الطريقتين ، سيتم استخدام فيجي ، وهو توزيع ل ImageJ الذي يحزم عدة أدوات لتحليل الصور العلمية30. يمكن تنزيل فيجي من https://fiji.sc/.

  1. طريقة العد اليدوي
    1. افتح الصورة التي تحتوي على mCFU في فيجي. حدد المكونات الإضافية > تحليل عداد الخلايا >.
    2. من القائمة عداد الخلايا، حدد تهيئة ثم حدد عداد (على سبيل المثال، النوع 1).
    3. تابع بالنقر فوق كل مستعمرة. سيتم عرض كل نقرة على الصورة وسيتم تحديث العداد (الشكل 3). للتراجع عن النقرات غير المقصودة، اختر حذف.
    4. سجل القيمة المعروضة على العداد. انقر فوق الزر "إعادة تعيين " لإعادة تعيين العدد وفتح صورة جديدة لحساب عينات إضافية.
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التعليمات حول هذا المكون الإضافي على https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. طريقة العد الآلي
    1. افتح الصورة التي تحتوي على mCFU في فيجي. حدد نوع > الصورة > 8 بت. سيؤدي هذا إلى تحويل الصورة إلى صورة ذات مقياس رمادي 8 بت.
    2. حدد الأداة البيضاوية في شريط الأدوات وارسم بيضاويا حول المنطقة مع المستعمرات (الشكل 4 أ). يمكن تعديل الشكل البيضاوي بعد رسمه.
    3. حدد تحرير > مسح من الخارج ، لإزالة أي تداخل من المنطقة الخارجية (الشكل 4B). حدد > الصورة ضبط > الحد.
    4. حرك أشرطة التمرير في قائمة العتبة حتى تظهر المستعمرات باللون الأحمر ويتم تقليل ضوضاء الخلفية (الشكل 4C).
    5. حدد تطبيق واخرج من نافذة العتبة. يتم إنشاء صورة بالأبيض والأسود (الشكل 4D).
    6. حدد تحليل > تحليل الجسيمات. في نافذة تحليل الجسيمات ، حدد نطاق مساحة المستعمرة (بين 1 واللانهاية ، مقاسة بالبكسل التربيعي) والدائرية (بين 0 و 1 ، حيث 1 هي دائرة مثالية ؛ الشكل 4E).
    7. حدد الخطوط العريضة في القائمة المنبثقة إظهار. تحقق من عرض النتائج للحصول على قياسات مفصلة لكل مستعمرة في نافذة النتائج. تحقق من مسح النتائج لمسح أي قياسات سابقة. حدد مربع التلخيص لعرض النتائج الملخصة للقياسات (الشكل 4E).
    8. ابدأ المحلل عن طريق تحديد موافق. تظهر نافذة جديدة تعرض جميع المستعمرات المحددة التي تم اكتشافها وعدها. تعرض نافذة النتائج تفاصيل كل مستعمرة ، وتعرض نافذة النتائج الملخصة إجمالي المستعمرات التي تم حسابها (الشكل 4F).
      ملاحظة: ستختلف إعدادات الحجم والدوران باختلاف دقة الصورة وتكبيرها وحجم المستعمرات وشكلها. كرر العملية عدة مرات حتى يتم العثور على أفضل الإعدادات التي تكتشف جميع المستعمرات. يمكن العثور على مزيد من التعليمات حول المكون الإضافي لتحليل الجسيمات على https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figure 3
الشكل 3. طريقة يدوية لحساب mCFU باستخدام المكون الإضافي لعداد الخلايا على برنامج فيجي. تشير النقاط الزرقاء إلى المستعمرات التي نقر عليها المستخدم بالفعل. تعرض القائمة الموجودة على اليمين عدد المستعمرات التي تم حسابها حتى الآن (العدد هو 41). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. طريقة آلية لحساب mCFU باستخدام برنامج فيجي. (أ، ب) يتم تحديد المنطقة ذات الأهمية مع المستعمرات باستخدام أداة التحديد البيضاوي ، ويتم إزالة المنطقة الخارجية باستخدام الأمر الخارجي الواضح. (ج، د) يتم إنشاء صورة بالأبيض والأسود للمستعمرات باستخدام أداة العتبة. (ه، واو) يتم تحديد عدد المستعمرات باستخدام أداة تحليل الجسيمات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يزيد اختبار mCFU الموصوف هنا من كمية المعلومات التي يمكن استرجاعها من طبق بتري واحد إلى 96 ضعفا على الأقل. يصور الشكل 5 مقارنة بين طريقتين لتوصيل الدواء للاستخدام المعاد استخدامه لساكوينافير (SQV)31,32 كدواء موجه للمضيف لعلاج السل. في هذا الفحص ، تم استخدام أربع سلالات مختلفة من المتفطرة السلية لإصابة الضامة البشرية الأولية. م. السل سلالة مختبر H37Rv وثلاث سلالات سريرية معزولة من المرضى المصابين بالسل النشط من قبل الدكتور ريكاردو خورخي (INSA) من المعهد الوطني البرتغالي للصحة: سلالة حساسة للأدوية (رمز INSA 33427) ، سلالة متعددة المقاومة للأدوية (MDR) (رمز INSA 34192) ، وسلالة مقاومة للأدوية على نطاق واسع (XDR) (رمز INSA 163761). تم مضاعفة كل إصابة بكل سلالة في ثماني حالات علاجية مختلفة تقارن ثلاثة تركيزات مختلفة من الدواء الحر أو الدواء المحمل بالليبوزوم مع الضوابط غير المعالجة المعنية. أخيرا ، تم تحليل كل حالة في أربع نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة. لتحديد نمو البكتيريا داخل الخلايا ، كان إجمالي كمية المحللين المستخرجة من كل نقطة زمنية 32. تبع ذلك ثلاثة تخفيفات متسلسلة لكل محللة مما زاد العدد إلى 128 عينة. مضروبة في النقاط الزمنية الأربع التي تم تحليلها في 512 عينة. منذ تكرار التجربة باستخدام البلاعم من ثلاثة متبرعين مختلفين بالدم على الأقل ، ارتفع العدد الإجمالي للعينات التي تم تحليلها إلى 1536. باستخدام طريقة mCFU الموصوفة هنا ، شكلت هذه التجربة 16 طبقا بتري مربعا فقط مقابل 1536 طبقا ضروريا باستخدام بروتوكول CFU القياسي. كما هو موضح في الشكل 5 ، يمكن أن تظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة اختلافات ذات دلالة إحصائية بين العلاجات.

Figure 5
الشكل 5. يمكن أن تنتج طريقة mCFU كميات كبيرة من البيانات من عدد صغير من ألواح أجار. اختبرت هذه المجموعة من التجارب فعالية عقار ساكوينافير (SQV) للحث على القتل داخل الخلايا لمختبر M.tb والسلالات السريرية في الضامة البشرية. تم إعطاء SQV لمزارع البلاعم في شكلها الحر أو تحميلها في الجسيمات الشحمية (LipSQV). تم إجراء العلاجات بثلاثة تركيزات مختلفة: 50 و 20 و 10 ميكروغرام / مل. أصيبت البلاعم بسلالات مختلفة من السل M.tb لمدة 3 ساعات ثم عولجت بتركيزات مختارة من LipSQV و SQV الحر. تم استخدام الجسيمات الشحمية بدون الدواء (LipUnloaded) و DMSO كعناصر تحكم. لتقييم بقاء البكتيريا داخل الخلايا ، في نقاط زمنية منفصلة ، تم تحليل البلاعم ، وتم طلاء التخفيفات التسلسلية للتعليق البكتيري على ألواح أجار 7H10. تم حساب وحدات mCFU بعد 2-3 أسابيع. تصور الخطوط متوسط mCFU لكل عينة من 3 تجارب مستقلة على الأقل. تمثل القضبان متوسط النسبة المئوية ل mCFU المحسوبة بالنسبة إلى عناصر التحكم المعنية في اليوم 7 بعد الإصابة. تمثل الرموز كل تجربة مع البلاعم من متبرع مختلف. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. تم إجراء مقارنات جماعية متعددة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار هولم سيداك اللاحق. * ص ≤0.05 ، ** ع ≤0.01 ، *** ص ≤0.001. وقد عدل هذا الرقم من33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

السل مشكلة صحية عمومية هامة تزداد أهميتها، ولا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. تسبب تعطل أماكن الرعاية الصحية لتشخيص السل وعلاجه أثناء جائحة كوفيد-19 في تأثير سلبي على حدوث الحالات الجديدة1. وبالإضافة إلى ذلك، يجب التصدي على وجه الاستعجال لسلالات السل المتعددة الأدوية والمقاومة للأدوية على نطاق واسع، والعدوى المشتركة للسل المتعدد السل وفيروس العوز المناعي البشري للسيطرة على هذا الوباء 1,34. لقاحات جديدة لتحل محل أو تحسين BCG هي حاليا في التجارب السريرية ، ويمكن أن يصل المرشحون الجدد إلى السوق في السنوات القادمة35. يعتمد تطوير لقاحات جديدة مرشحة ضد السل على الدراسات قبل السريرية باستخدام نماذج حيوانية متنوعة. يتطلب تحديد فعالية اللقاح في النماذج الحيوانية تحديد كمية العبء البكتيري في الأعضاء المصابة لإثبات التأثير الوقائي للقاح 5,36. حاليا ، هناك طرق مباشرة وغير مباشرة لتحديد العبء البكتيري في الفئران المصابة والرئيسيات غير البشرية. تشمل الطرق المباشرة المستحضرات النسيجية والتلوين البكتيري باستخدام الفلورسنت auramine-o و Ziehl-Neelsen37 ، والقياس الكمي للحمل المتفطر في العينات بناء على RT-qPCR38 ، وغيرها.

مقايسة تثبيط نمو المتفطرات (MGIA) هي مقايسة في المختبر تعتمد على نظام BACTEC MGIT وهي طريقة حساسة تستخدم لتحديد عبء المتفطرات الحية في الملقحة وغير المحصنة. النظام عبارة عن أداة مؤتمتة بالكامل يمكنها اختبار وجود المتفطرات في أنابيب الاختبار المصممة خصيصا. تحتوي القارورة على مراسل فلورسنت يتفاعل مع تركيز الأكسجين في العينة. يتناسب التألق مع كمية الأكسجين المستهلكة ، مما يعطي مؤشرا على عدد البكتيريا الحية الموجودة في العينة ، كل ساعة39. في طريقة MGIA ، يتم جمع PBMCs وعينات المصل الذاتي من والاستزراع المشترك مع المتفطرات لمدة 96 ساعة. ثم ، يتم تحليل الخلايا الوحيدة الملتصقة لإطلاق المتفطرات داخل الخلايا. سيقوم النظام بتحديد العبء البكتيري بشكل غير مباشر عن طريق قياس استهلاك الأكسجين40. تستخدم هذه الطريقة عادة في دراسات مقاومة الأدوية ولكنها طبقت مؤخرا على تقييم فعالية لقاحالسل 40.

يمكن استكمال هذه الطرق مع CFU القياسي لتحديد العدد الإجمالي للبكتيريا المتفطرات القابلة للحياة. على سبيل المثال ، يتم تقييم اللقاحات المرشحة في تجربة تحدي M.tb للهباء الجوي للفئران من خلال تعداد المستعمرات التي تم الحصول عليها من الأنسجة بواسطة CFU11.

يمكن أن تكون طريقة mCFU الموصوفة هنا تحسنا كبيرا على طريقة CFU الكلاسيكية ، حيث إنها أسرع في الأداء وغير مكلفة من حيث الكواشف المستخدمة ومن حيث مساحة المختبر المطلوبة. تسمح هذه الطريقة بإجراء مقارنة متزامنة لمجموعة كبيرة من العينات في تجربة واحدة ، وبالتالي تقليل آثار الاختلافات من الفحص إلى الفحص. على سبيل المثال ، كما هو موضح في التجربة الموضحة في الشكل 5 ، تم تحديد CFU ل 1536 عينة باستخدام طريقة mCFU في 16 طبقا بتري مربعا ، وهو ما يمثل انخفاضا بمقدار 96 ضعفا في عدد الأطباق المستخدمة. هذا أكثر صلة بالتجارب التي تستخدم العينات البيولوجية والسريرية الأولية ، حيث قد يكون التوافر مشكلة. يسمح الشكل المضغوط الذي يتم فيه عرض المستعمرات على لوحة أجار بشكل ملائم باستخدام معدات تسجيل الصور المتخصصة أو الشائعة. هذا ، بالاقتران مع طرق عد المستعمرات الآلية مثل تلك الموصوفة هنا باستخدام برنامج فيجي ، يساعد على تقليل الاعتماد على قدرة المستخدم على تحديد وقياس CFU. ومع ذلك ، مثل تقنية CFU القياسية ، تعاني هذه الطريقة من عدم القدرة على التمييز بين المستعمرات المدمجة مما يؤدي إلى نقص محتمل في تمثيل CFU. ومع ذلك ، يمكن تقليل ذلك عن طريق اختيار تخفيف أعلى لإجراء القياس الكمي أو عن طريق حساب المستعمرات تحت المجهر قبل أن يؤدي نموها الزائد إلى اندماج المستعمرة. يكون هذا أكثر أهمية إذا كانت العينة تنتج مستعمرات ذات معدلات نمو غير متجانسة. يجب على الباحثين التحقق من صحة تنفيذ mCFU لظروفهم التجريبية المحددة في تلك الحالات.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي النقاط التالية: يجب إجراء التخفيفات التسلسلية التي تم إجراؤها باستخدام لوحة 96 بئرا ، ويجب خلط التخفيفات تماما ؛ يجب إجراء طلاء القطرة الدقيقة باستخدام ماصة متعددة القنوات 0.5-10 ميكرولتر لنقل 5 ميكرولتر من كل صف من لوحة 96 بئرا إلى اللوحة المربعة المتوسطة الصلبة ، دون لمس الوسط وإتلافه ؛ يجب إجراء عد المستعمرة الصغيرة بين 6-10 أيام من الحضانة. ومع ذلك ، في وقت العد ، يجب توخي الحذر لضمان أن المستعمرات ليست كبيرة بشكل مفرط أو صغيرة جدا.

تشمل التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه التقنية استخدام سلالات بكتيرية مختلفة. لذلك ، لكل سلالة ، يجب استخدام وسيط النمو الأمثل. تتطابق قيود هذه التقنية مع قيود طريقة CFU التقليدية ، والتي تشمل صعوبة تعداد البكتيريا في التخفيفات المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، تشمل القيود المحددة لهذه الطريقة ضرورة استخدام المجهر لتعداد المستعمرات.

وأخيرا، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد العبء البكتيري في دراسات التطعيم ضد السل ودراسات اختبار مقاومة/حساسية الأدوية ودراسات التفاعل بين المضيف والممرض. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 5 تطبيق mCFU لتحديد القتل داخل الخلايا لسلالات M.tb ، بما في ذلك السلالات السريرية ، والسلالات المقاومة للأدوية المتعددة والمقاومة للأدوية على نطاق واسع المعالجة بتركيبات دوائية مختلفة ، في الضامة البشرية. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على أي كائن حي دقيق ، بشرط استيفاء شروط الاستزراع لكل كائن حي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن DP و PJGB أن الدراسة أجريت في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل بتمويل داخلي من كلية الطب ، الجامعة الكاثوليكية البرتغالية ، وتمويل خارجي من Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) ، في إطار المنح UIDP / 04279/2020 و UIDB / 04279/2020 و EXPL / SAU-INF / 0742/2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).

Tags

الطب ، العدد 197 ، اللقاحات ، السل ، المتفطرة السلية ، Bacillus Calmette-Guérin ، لقاح السل ، التجارب السريرية ، التطوير قبل السريري ، تعداد المستعمرات البكتيرية ، فحص وحدات تشكيل المستعمرات ، فحص MCFU ، تكاليف الكاشف ، فترة الحضانة ، مساحة المختبر ، مخاطر الصحة والسلامة
فحص وحدة تشكيل المستعمرات الدقيقة لتقييم فعالية اللقاحات ضد السل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pires, D., Bettencourt, P. J. G.… More

Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter