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Medicine

क्षय रोग के खिलाफ टीकों की प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए माइक्रो-कॉलोनी बनाने वाली इकाई परख

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) का निर्धारण बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्वर्ण-मानक तकनीक है, जिसमें माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस भी शामिल है, जिसे दृश्यमान कॉलोनियों को बनाने में सप्ताह लग सकते हैं। यहां हम सीएफयू निर्धारण के लिए एक माइक्रो-सीएफयू का वर्णन करते हैं जिसमें बढ़ी हुई समय दक्षता, कम प्रयोगशाला स्थान और अभिकर्मक लागत, और मध्यम और उच्च थ्रूपुट प्रयोगों के लिए स्केलेबिलिटी है।

Abstract

तपेदिक (टीबी), एक संक्रामक एजेंट द्वारा दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण, 2022 में 1.6 मिलियन लोगों की जान ले गया, केवल 2019-2021 महामारी के दौरान COVID-19 से आगे निकल गया। यह रोग जीवाणु माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (M.tb) के कारण होता है। माइकोबैक्टीरियम बोविस स्ट्रेन बेसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी), एकमात्र टीबी वैक्सीन, दुनिया का सबसे पुराना लाइसेंस प्राप्त टीका है, जो अभी भी उपयोग में है। वर्तमान में, नैदानिक परीक्षणों में 12 टीके हैं और पूर्व-नैदानिक विकास के तहत दर्जनों टीके हैं। पूर्व-नैदानिक अध्ययनों में टीबी के टीकों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पसंद की विधि कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) परख द्वारा बैक्टीरिया कालोनियों की गणना है। इस समय लेने वाली परख को समाप्त होने में 4 से 6 सप्ताह लगते हैं, इसके लिए पर्याप्त प्रयोगशाला और इनक्यूबेटर स्थान की आवश्यकता होती है, इसमें उच्च अभिकर्मक लागत होती है, और संदूषण का खतरा होता है। यहां हम कॉलोनी गणना के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं, माइक्रो-सीएफयू (एमसीएफयू), जो एमटीबी वैक्सीन प्रभावकारिता परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और तेज़ समाधान प्रदान करता है। एमसीएफयू परख के लिए दस गुना कम अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, इनक्यूबेशन अवधि को तीन गुना कम कर देता है, समाप्त होने में 1 से 2 सप्ताह लगते हैं, प्रयोगशाला स्थान और अभिकर्मक लागत को कम करता है, और बड़ी संख्या में एमटीबी के साथ काम करने से जुड़े स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिमों को कम करता है। इसके अलावा, टीबी वैक्सीन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न स्रोतों से नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं, जिसमें माइकोबैक्टीरिया से संक्रमित टीकाकरण वाले जानवरों के ऊतक शामिल हैं। हम संक्रमण अध्ययन के लिए एक एककोशिकीय, समान और उच्च गुणवत्ता वाले माइकोबैक्टीरियल संस्कृति का उत्पादन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का भी वर्णन करते हैं। अंत में, हम प्रस्ताव करते हैं कि इन तरीकों को टीके की प्रभावकारिता निर्धारण के पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए सार्वभौमिक रूप से अपनाया जाना चाहिए, जिससे अंततः टीबी के खिलाफ टीकों के विकास में समय कम हो सके।

Introduction

क्षय रोग (टीबी) दुनिया भर में एक संक्रामक एजेंट, जीवाणु माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) द्वारा मौत का प्रमुख कारण है, जो किसी भी अन्य रोगज़नक़ की तुलना में अधिक लोगों को मारता है। 2021 में, टीबी 1.6 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार था और 2019-2021 महामारी1 के दौरान COVID-19 से आगे निकल गया था। इसके अलावा, विश्व स्वास्थ्य संगठन की 2022 की वैश्विक TB रिपोर्ट के अनुसार, COVID-19 महामारी टीबी के नए मामलों में वृद्धि के लिए जिम्मेदार थी। डब्ल्यूएचओ इस अवधि के दौरान टीबी से पीड़ित लोगों की संख्या में बड़ी गिरावट की भी रिपोर्ट करता है, जिससे टीबीके मामलों की संख्या और बढ़ सकती है।

बैसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी) रोगजनक माइकोबैक्टीरियम बोविस का एक लाइव-एटेन्यूएटेड स्ट्रेन है, जिसका उपयोग पहली बार 100 साल पहले वैक्सीन के रूप में किया गया था। यह टीबी के खिलाफ एकमात्र टीका है और दुनिया का सबसे पुराना लाइसेंस प्राप्त टीका है जो अभी भी उपयोग में है। वर्तमान में, नैदानिक परीक्षणों के विभिन्न चरणों में 12 टीकेहैं 4, और दर्जनों टीके पूर्व-नैदानिक विकास 5,6 के अधीन हैं। टीबी के खिलाफ टीकों के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन में सुरक्षा और इम्युनोजेनेसिटी7 का मूल्यांकन शामिल है, जिसे जेब्राफिश, चूहों, गिनी सूअरों, खरगोशों, मवेशियों और गैर-मानव प्राइमेट 8,9,10 जैसे विभिन्न पशु मॉडल में प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एमटीबी संक्रमण और/या संचरण, यानी वैक्सीन प्रभावकारिता के खिलाफ सुरक्षा को प्रेरित करने के लिए वैक्सीन की क्षमता का आकलन करने के लिए विवो 5,11 में एमटीबी चुनौती की आवश्यकता होती है। दिलचस्प है, बीसीजी टीकाकरण गैर-विशिष्ट प्रभाव पैदा करता है जो प्रशिक्षित प्रतिरक्षा14 के तंत्र के माध्यम से अन्य जीवाणु और वायरल रोगजनकों12,13 के अस्तित्व को प्रभावित करता है। एक संक्रमित जानवर में व्यवहार्य जीवाणु बोझ यों करने के लिए, पसंद की विधि कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) परख 5,15 के माध्यम से जीवाणु कालोनियों की गणना है. सीएफयू एक इकाई है जो सूक्ष्मजीवों (बैक्टीरिया या कवक) की संख्या का अनुमान लगाती है जो विशिष्ट विकास स्थितियों के तहत उपनिवेश बनाते हैं। सीएफयू व्यवहार्य और प्रतिकृति सूक्ष्मजीवों से उत्पन्न होते हैं, और प्रत्येक कॉलोनी के भीतर जीवित सूक्ष्मजीवों की पूर्ण संख्या का अनुमान लगाना मुश्किल है। यह अनिश्चित है कि एक कॉलोनी की उत्पत्ति एक या अधिक सूक्ष्मजीवों से हुई है या नहीं। सीएफयू इकाई इस अनिश्चितता को दर्शाती है, इसलिए एक ही नमूने की प्रतिकृतियों में एक महान परिवर्तनशीलता देखी जा सकती है। इस समय लेने वाली परख के लिए जैव सुरक्षा स्तर 3 (बीएसएल 3) सुविधा, पर्याप्त प्रयोगशाला और इनक्यूबेटर स्थान में काम करने के लिए प्रशिक्षित विशेष तकनीशियनों की आवश्यकता होती है, निष्कर्ष निकालने में 4 से 6 सप्ताह लगते हैं, और संदूषण का खतरा होता है।

इस अध्ययन में, हम कॉलोनी गणना, माइक्रो-सीएफयू (एमसीएफयू) के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं, औरपरिणामों 15,16,17,18,19,20 का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। एमसीएफयू परख के लिए दस गुना कम अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, इनक्यूबेशन अवधि को तीन गुना कम कर देता है, समाप्त होने में 1 से 2 सप्ताह लगते हैं, प्रयोगशाला स्थान और अभिकर्मक लागत को कम करता है, और बड़ी संख्या में एमटीबी के साथ काम करने से जुड़े स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिमों को कम करता है। हम प्रस्ताव करते हैं कि इस पद्धति को टीके की प्रभावकारिता निर्धारण के पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए सार्वभौमिक रूप से अपनाया जाना चाहिए, जिससे अंततः टीबी के खिलाफ टीकों के विकास में समय कम हो सके। अंत में, सीएफयू गणना की इस अनुकूलित विधि का उपयोग न केवल माइकोबैक्टीरिया बल्कि अन्य बैक्टीरिया, जैसे एस्चेरिचिया कोलाई और राल्स्टोनिया सोलनासेरम21 को निर्धारित करने के लिए किया गया है।

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Protocol

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल बीसीजी के लिए है लेकिन किसी भी माइकोबैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है। बीसीजी का उपयोग टीबी प्रयोगों के लिए सरोगेट जीवाणु के रूप में किया जा सकता है जब बीएसएल3 सुविधाएं उपलब्ध नहीं हैं। बीसीजी का उपयोग करने वाली निम्नलिखित प्रक्रियाओं को जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल2) प्रयोगशाला के तहत किया जाना चाहिए और खतरनाक समूह 2 सूक्ष्मजीवों के हेरफेर के लिए उपयुक्त जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों और अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं का पालन करना चाहिए।

1. संस्कृति मीडिया तैयारी

  1. आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार, 10% (v/v) ओलिक एसिड, एल्ब्यूमिन, डेक्सट्रोज और कैटालेस (OADC) संवर्धन के साथ पूरक मिडलब्रुक 7H9 शोरबा तैयार करें। शोरबा को 0.05% (v/v) tyloxapol के साथ पूरक करें।
    नोट: Tyloxapol एक गैर आयनिक तरल बहुलक है कि बैक्टीरियल क्लंप गठन16 को रोकने के लिए एक सर्फेक्टेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया है .
  2. आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार 10% (v/v) OADC संवर्धन के साथ पूरक मिडलब्रुक 7H10 ठोस माध्यम तैयार करें।
  3. मध्यम प्रति वर्ग पेट्री डिश (120 मिमी x 120 मिमी) के 40 एमएल वितरित करें। अगर की सतह पर संक्षेपण को कम करने के लिए प्लेटों को सूखने दें।
    नोट: पेट्री डिश का यह विशिष्ट आकार 96-अच्छी प्लेट से कम से कम 96 बूंदों के प्रत्यक्ष पारगमन की अनुमति देने के लिए मौलिक है। प्लेटों के प्रभावी सुखाने से बाद में बैक्टीरियल सस्पेंशन की छोटी बूंदों की चढ़ाना की सुविधा होगी और बूंदों को फैलने से रोका जा सकेगा।
  4. या तो रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम (RPMI 1640) या Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) संक्रमण माध्यम का उत्पादन करने के लिए तैयार करें. किसी भी मामले में, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% एल-ग्लूटामाइन, और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट के साथ माध्यम को पूरक करें। माध्यम में पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन न जोड़ें।

2. नमूना तैयार करना

  1. विभिन्न स्रोतों से नमूने प्राप्त करें। आमतौर पर, टीबी वैक्सीन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए सीएफयू की मात्रा निर्धारित करने के लिए, टीकाकरण और गैर-टीकाकृत पशु ऊतकों से नमूने प्राप्त करें। उदाहरण के लिए, माउस फेफड़े और प्लीहा11 या मकाक फेफड़े, वक्ष और परिधीय लिम्फ नोड्स, प्लीहा, यकृत, त्वचा, रक्त, अस्थि मज्जा, और bronchoalveolar lavage धोने23. वैकल्पिक रूप से, बीसीजी 18,19,20,24,25,26 से संक्रमित मैक्रोफेज/डेंड्राइटिक कोशिकाओं/न्यूट्रोफिल के इन विट्रो संस्कृतियों से नमूने प्राप्त करें।

3. बीसीजी संस्कृति का उत्पादन

नोट: टीबी टीकों के विवो अध्ययनों के लिए, इसका उद्देश्य बीसीजी की प्रभावकारिता में सुधार करना है। इसलिए, बीसीजी-टीकाकरण समूहों को आमतौर पर नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। मानव टीकाकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले बीसीजी उपभेद पशु मॉडल में परीक्षण के लिए आदर्श हैं। इस मामले में, बीसीजी की संस्कृति को आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठित किया जाना चाहिए27. हालांकि, विवो अध्ययन में के लिए एक बीसीजी संस्कृति भी घर में उत्पादित किया जा सकता है11. इन विट्रो संक्रमण प्रोटोकॉल में के लिए एककोशिकीय, वर्दी, और उच्च गुणवत्ता वाले बीसीजी संस्कृति का उत्पादन निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई अध्ययनों 11,16,18,19,20,26,28,29 में बहुत सफलतापूर्वक उत्पादित किया गया है, जिसका उपयोग पशु चुनौती अध्ययन के लिए भी किया जा सकता है।

  1. संस्कृति 7H9 शोरबा में BCG के 50 एमएल, 37 डिग्री सेल्सियस पर, 200 आरपीएम पर आंदोलन के साथ। प्रयोग की जरूरतों के अनुसार मात्रा बदलें।
  2. हर दिन, 8-10 दिनों के लिए, संस्कृति के 100 माइक्रोन इकट्ठा करें और 1 एमएल क्यूवेट में पीबीएस के 900 माइक्रोन जोड़कर इसे पतला करें। फिर बैक्टीरिया के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा आगे बढ़ें (आयुध डिपो λ=600 एनएम पर; ओडी600) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में। उन मूल्यों से एक विकास वक्र खींचें। संस्कृति के मध्य-लॉग चरण की पहचान करें (जब आयुध डिपो समय की प्रति इकाई लगातार दोगुना हो रहा है)।
  3. एक बाद की संस्कृति तैयार करें और चरण 3.1 और 3.2 के रूप में मध्य / देर से लॉग विकास चरण तक पहुँचने तक सेते हैं. मार्गदर्शन के रूप में पिछले चरण में प्राप्त मूल्यों का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि व्यवहार्य बैक्टीरिया की अच्छी गुणवत्ता वाली संस्कृति को बनाए रखने के लिए संस्कृति स्थिर विकास चरण (जब आयुध डिपो स्थिर होने लगती है) तक नहीं पहुंचती है।
  4. मध्य/देर से लॉग विकास चरण में संस्कृति को इकट्ठा करें। 10 मिनट के लिए 3000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  5. बैक्टीरिया को धोने के लिए पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें। 10 मिनट के लिए 3000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  6. संक्रमण मीडिया के 5 एमएल के साथ बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें। ट्यूब को 15 मिनट के लिए अल्ट्रासाउंड स्नान में रखें, 80 हर्ट्ज पर पूर्ण शक्ति।
  7. 10 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। गोली से बचने सतह पर तैरनेवाला लीजिए क्योंकि यह बैक्टीरिया के गुच्छों में समृद्ध है जिसे उच्च गुणवत्ता वाले बीसीजी संस्कृति में टाला जाना चाहिए और इसे त्याग देना चाहिए।
  8. सतह पर तैरनेवाला के आयुध डिपो को मापें। यहां, घातीय विकास चरण में संस्कृतियां, 0.1 के आयुध डिपो600 के साथ, 1 x 107 सीएफयू /
    नोट: प्रत्येक प्रयोगशाला स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर आयुध डिपो600 और सीएफयू के बीच एक रैखिक प्रतिगमन स्थापित करने के लिए प्रयोगों शुरू करने से पहले अपने स्वयं के बीसीजी विकास घटता का उत्पादन करना चाहिए. कृपया ध्यान दें कि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में अलग-अलग प्रकाश पथ दूरी होती है, जो एक ही नमूने के लिए प्राप्त रीडिंग को भिन्न कर सकती है।
  9. प्रत्येक मेजबान सेल संस्कृति में जोड़ने के लिए बैक्टीरिया की संख्या स्थापित करने के लिए सरल गणना करें। प्रति मेजबान सेल बैक्टीरिया की संख्या संक्रमण की बहुलता (एमओआई) है। मेजबान सेल प्रति 10 बैक्टीरिया के एमओआई का उपयोग करें, जो बीसीजी संक्रमण प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाने वाला सबसे आम एमओआई है।

4. माइक्रो-कॉलोनी बनाने वाली इकाई परख

नोट: इन विवो या इन विट्रो संक्रमण प्रयोग पूरा होने के बाद, बैक्टीरिया की गणना एमसीएफयू द्वारा की जा सकती है। विवो अध्ययन के लिए, नमूनों को पहले एक मनका बीटर या किसी अन्य ऊतक homogenizer में homogenized किया जाना चाहिए. बीसीजी से संक्रमित मैक्रोफेज / डेंड्राइटिक कोशिकाओं / न्यूट्रोफिल के इन विट्रो संस्कृतियों के लिए, नमूनों को गैर-आयनिक डिटर्जेंट (जैसे, गैर-आयनिक, गैर-विकृतीकरण डिटर्जेंट का 0.05% समाधान) का उपयोग करके लाइज़ किया जाना चाहिए।

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग सीरियल dilutions: चित्रा 1 ए में योजना के अनुसार एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली में, lysates के सीरियल 10 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन. पंक्तियों A और E पर lysates वितरित करें। प्रत्येक प्लेट के लिए, नमूनों और/या replicates की अधिकतम संख्या 24 है.
  2. धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए शेष कुओं के लिए dH2O के 180 माइक्रोन जोड़ें.
  3. 12-चैनल विंदुक का उपयोग करके, पंक्ति ए में lysates को फिर से निलंबित करें और 20 माइक्रोन को पंक्ति बी (20 माइक्रोन लाइसेट + 180 माइक्रोन डीएच2हे) में स्थानांतरित करें। अच्छी तरह से समरूप करें। क्रमिक रूप से पंक्तियों बी और सी के लिए इस चरण को पंक्ति डी में अंतिम कमजोर पड़ने तक पहुंचने तक दोहराएं।
    नोट: हम आम तौर पर तीन dilutions (100, 101, 102, 103) प्रदर्शन, इस प्रकार 12 नमूनों और / या replicates के प्रत्येक सेट के लिए प्लेट (एडी या ईएच) की 4 पंक्तियों का उपयोग कर.
  4. माइक्रो छोटी बूंद चढ़ाना: चित्रा 1 बी के अनुसार, ठोस मध्यम वर्ग प्लेट के लिए 96 अच्छी तरह से थाली की प्रत्येक पंक्ति से 5 माइक्रोन स्थानांतरित करने के लिए एक 0.5-10 माइक्रोन (पतली युक्तियों को प्राथमिकता दी जाती है) मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करें।
  5. धीरे-धीरे 5 माइक्रोन बूंदों को पाइप करते समय, उन्हें अगर को थोड़ा छूने की अनुमति दें। यह अगर की ओर टिप से छोटी बूंद को दूर करने में मदद करेगा और टिप के अंदर तरल के प्रतिधारण की संभावना को कम करेगा।
  6. बूंदों को सूखने दें, अगर प्लेट को बंद करें, और बैक्टीरिया के विकास की निगरानी करते हुए इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, प्लेटों को सूखने से रोकने के लिए एक सील प्लास्टिक बैग में अगर प्लेटों को सेते हैं।
  7. माइक्रो कॉलोनी गिनती: इनक्यूबेशन के लगभग 6-10 दिनों के बाद, नग्न आंखों (चित्रा 2) को दृश्यमान, व्यक्तिगत कालोनियों के लिए जांचें.
  8. एक उल्टे ऑप्टिकल खुर्दबीन या आवर्धक कांच के सबसे कम बढ़ाई उद्देश्य (4x या कम) का उपयोग कालोनियों गिनती. गिनती कमजोर पड़ने में किया जाना चाहिए जहां कॉलोनियों की संख्या 300 से कम और 30 से अधिक है। वैकल्पिक रूप से, कंप्यूटर पर कॉलोनियों को मैन्युअल रूप से गिनने के लिए छोटी बूंद की तस्वीर लेने के लिए कैमरे का उपयोग करें या कॉलोनी गिनती को स्वचालित करने के लिए इमेजजे जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
  9. CFU/mL में सेल नंबर व्यक्त करने के लिए, निम्न समीकरण का उपयोग करें:
    Equation 1
    जहां C = गिने गए कॉलोनियों की संख्या, V = μL में चढ़ाया गया आयतन, और Dil = कमजोर पड़ने जहां कॉलोनियों की गणना की गई थी (100, 101, 102, 103)। उदाहरण के लिए, यदि 30 कालोनियों को कमजोर पड़ने में 5 माइक्रोन छोटी बूंद में गिना गया10 2, तो:
    Equation 2

Figure 1
चित्र 1. एमसीएफयू प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) 96-वेल प्लेट में बीसीजी युक्त लाइसेट्स के सीरियल 10-गुना कमजोर पड़ने। (बी)स्क्वायर पेट्री डिश जिसमें ठोस संस्कृति माध्यम होता है और प्रत्येक 5 माइक्रोन की 96 बूंदों द्वारा ओवरले किया जाता है। बूंदों एक multichannel विंदुक का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली से सीधे pipetted हैं. BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. 10 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद बीसीजी की माइक्रो-कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां। बाईं ओर, एक वर्ग पेट्री डिश की एक तस्वीर 5 माइक्रोन प्रत्येक की 96 बूंदों द्वारा ओवरले की गई है, जैसा कि पहले चित्रा 1बी में दर्शाया गया था। दाईं ओर, 3 बूंदों की अलग-अलग तस्वीरें एक मूल लाइसेट (100) और दो कमजोर पड़ने (101, 102) के अनुरूप हैं। तस्वीरें 18-55 मिमी ज़ूम लेंस (प्लेट) या 105 मिमी मैक्रो लेंस (बूंदों) से लैस डीएसआरएल कैमरे का उपयोग करके ली गई थीं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. फिजी में माइक्रो-कॉलोनी बनाने वाली इकाई की गिनती (ImageJ)

नोट: एमसीएफयू विधि नमूनों के बड़े सेटों के सीएफयू मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है। बूंदों की तस्वीरें कॉलोनी गिनती की सुविधा के लिए पीछे विश्लेषण के लिए दर्ज किया जा सकता है. कई फोटोग्राफिक डिवाइस इस उद्देश्य के लिए पर्याप्त गुणवत्ता वाले चित्र बना सकते हैं। इनमें डिजिटल कैमरा, वेबकैम, कैमरा से जुड़े माइक्रोस्कोप और आवर्धक चश्मा और सेल फोन शामिल हैं। ImageJ जैसे मुफ्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर उन छवियों में मैनुअल या स्वचालित कॉलोनी की गिनती की संभावना प्रदान करता है। दोनों तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए, फिजी का उपयोग किया जाएगा, जो इमेजजे का एक वितरण है जो वैज्ञानिक छवि विश्लेषण30 के लिए कई उपकरणों को पैकेज करता है। फिजी को https://fiji.sc/ से डाउनलोड किया जा सकता है।

  1. मैनुअल गिनती विधि
    1. फिजी में mCFU वाली छवि खोलें। सेल काउंटर का विश्लेषण > प्लगइन्स >का चयन करें।
    2. कक्ष काउंटर मेनू पर, प्रारंभ करें का चयन करें और फिर किसी काउंटर का चयन करें (उदा., प्रकार 1).
    3. प्रत्येक कॉलोनी पर क्लिक करके आगे बढ़ें। प्रत्येक क्लिक चित्र पर दिखाया जाएगा और काउंटर (चित्रा 3) को अपडेट करेगा। गलती से होने वाले क्लिक को पूर्ववत करने के लिए, हटाएं चुनें.
    4. काउंटर पर प्रदर्शित मूल्य पंजीकृत करें। गिनती रीसेट करने के लिए रीसेट बटन पर क्लिक करें और अतिरिक्त नमूनों को गिनने के लिए एक नई छवि खोलें।
      नोट: इस प्लगइन पर आगे के निर्देश https://imagej.net/plugins/cell-counter पर पाए जा सकते हैं।
  2. स्वचालित गिनती विधि
    1. फिजी में mCFU वाली छवि खोलें। छवि का चयन करें > 8 -बिट > टाइप करें। यह छवि को 8-बिट ग्रे-स्केल छवि में बदल देगा।
    2. टूल बार में ओवल टूल का चयन करें और कॉलोनियों के साथ क्षेत्र के चारों ओर एक अंडाकार बनाएं (चित्र 4A)। अंडाकार को खींचे जाने के बाद समायोजित किया जा सकता है।
    3. बाहरी क्षेत्र (चित्रा 4 बी) से किसी भी हस्तक्षेप को हटाने के लिए, संपादित करें > बाहर साफ़ करें का चयन करें। छवि का चयन करें > > थ्रेशोल्ड समायोजित करें।
    4. थ्रेशोल्ड मेनू में स्लाइडर्स को तब तक ले जाएं जब तक कि कॉलोनियों को लाल रंग में दिखाई न दें और पृष्ठभूमि शोर कम से कम न हो जाए (चित्र 4C)।
    5. लागू करें का चयन करें और थ्रेशोल्ड विंडो से बाहर निकलें। एक काले और सफेद छवि (चित्रा 4 डी) उत्पन्न होता है.
    6. कणों का विश्लेषण > विश्लेषण करें चुनें. विश्लेषण कण खिड़की में, कॉलोनी क्षेत्र (1 और अनंत के बीच, वर्ग पिक्सल में मापा के बीच) और परिपत्र (0 और 1 के बीच, जहां 1 एक पूर्ण चक्र है) के लिए सीमा निर्दिष्ट करें; चित्रा 4ई)।
    7. शो पॉपअप मेनू में बाह्यरेखाएँ चुनें. परिणाम विंडो में प्रत्येक कॉलोनी के लिए विस्तृत माप के लिए प्रदर्शन परिणाम की जाँच करें. किसी भी पिछले माप को मिटाने के लिए स्पष्ट परिणाम की जाँच करें। माप के सारांशित परिणाम प्रदर्शित करने के लिए सारांशित बॉक्स की जाँच करें (चित्रा 4ई)।
    8. ठीक का चयन करके विश्लेषक आरंभ करें। एक नई विंडो प्रकट होती है, जो उन सभी उल्लिखित कॉलोनियों को प्रदर्शित करती है जिनका पता लगाया गया था और गिना गया था। परिणाम विंडो प्रत्येक कॉलोनी के लिए विवरण प्रदर्शित करता है, और संक्षेप परिणाम विंडो कुल कालोनियों गिना (चित्रा 4F) से पता चलता है.
      नोट: आकार और परिपत्र के लिए सेटिंग्स छवि के संकल्प और बढ़ाई और कालोनियों के आकार और आकार के साथ भिन्न होंगे। प्रक्रिया को कई बार दोहराएं जब तक कि सबसे अच्छी सेटिंग्स नहीं मिलती हैं जो सभी कॉलोनियों का पता लगाती हैं। विश्लेषण कणों प्लगइन पर आगे के निर्देश https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap पर पाया जा सकता है।

Figure 3
चित्र 3. फिजी सॉफ्टवेयर पर सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग करके एमसीएफयू की गिनती के लिए एक मैनुअल विधि। नीले डॉट्स पहले से ही उपयोगकर्ता द्वारा क्लिक की गई कॉलोनियों को इंगित करते हैं। दाईं ओर का मेनू अब तक गिने गए कॉलोनियों की संख्या प्रदर्शित करता है (गिनती 41 है)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एमसीएफयू की गिनती के लिए एक स्वचालित विधि। (ए, बी) कालोनियों के साथ ब्याज के क्षेत्र अंडाकार चयन उपकरण का उपयोग कर चुना है, और बाहर क्षेत्र स्पष्ट बाहर आदेश का उपयोग कर हटा दिया है. (सी, डी) कालोनियों की एक काले और सफेद छवि दहलीज उपकरण का उपयोग कर उत्पन्न किया है. (ई, एफ) कालोनियों की संख्या विश्लेषण कण उपकरण का उपयोग मात्रा निर्धारित की है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

यहां वर्णित एमसीएफयू परख एक पेट्री डिश से कम से कम 96 गुना तक प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी की मात्रा को बढ़ाता है। चित्रा 5 तपेदिक के इलाज के लिए एक मेजबान निर्देशित दवा के रूप में saquinavir (एसक्यूवी)31,32 के पुनर्निर्मित उपयोग के लिए दो दवा-वितरण विधियों की तुलना को दर्शाया गया है। इस परख में, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस के चार अलग-अलग उपभेदों का उपयोग प्राथमिक मानव मैक्रोफेज को संक्रमित करने के लिए किया गया था। M. तपेदिक पुर्तगाली नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के डॉ रिकार्डो जॉर्ज (आईएनएसए) द्वारा सक्रिय टीबी वाले रोगियों से पृथक H37Rv प्रयोगशाला तनाव और तीन नैदानिक उपभेद: एक दवा-अतिसंवेदनशील तनाव (आईएनएसए कोड 33427), एक बहु-दवा प्रतिरोधी (एमडीआर) तनाव (आईएनएसए कोड 34192), और एक बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी (एक्सडीआर) तनाव (आईएनएसए कोड 163761)। प्रत्येक तनाव द्वारा प्रत्येक संक्रमण को आठ अलग-अलग उपचार स्थितियों में गुणा किया गया था, जिसमें संबंधित गैर-उपचारित नियंत्रणों के लिए फ्री-ड्रग या लिपोसोम-लोडेड दवा की तीन अलग-अलग सांद्रता की तुलना की गई थी। अंत में, प्रत्येक स्थिति का विश्लेषण संक्रमण के बाद चार अलग-अलग समय बिंदुओं पर किया गया था। इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल विकास को मापने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु से निकाले गए लाइसेट्स की कुल मात्रा 32 थी। इसके बाद प्रत्येक लाइसेट में तीन सीरियल कमजोर पड़ने से संख्या 128 नमूनों तक बढ़ गई। चार बार के अंकों से गुणा करने पर 512 नमूनों में परिणामों का विश्लेषण किया गया। चूंकि प्रयोग को कम से कम तीन अलग-अलग रक्त दाताओं से मैक्रोफेज का उपयोग करके दोहराया गया था, इसलिए विश्लेषण किए गए नमूनों की कुल संख्या बढ़कर 1536 हो गई। यहां वर्णित एमसीएफयू विधि का उपयोग करते हुए, इस प्रयोग में केवल 16 वर्ग पेट्री व्यंजन बनाम 1536 के लिए जिम्मेदार है जो मानक सीएफयू प्रोटोकॉल का उपयोग करके आवश्यक होगा। जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, इस पद्धति के साथ प्राप्त परिणाम उपचार के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित कर सकते हैं।

Figure 5
चित्रा 5. mCFU विधि अगर प्लेटों की एक छोटी संख्या से डेटा की एक उच्च मात्रा का उत्पादन कर सकते हैं. प्रयोगों के इस सेट ने मानव मैक्रोफेज में एमटीबी प्रयोगशाला और नैदानिक उपभेदों की इंट्रासेल्युलर हत्या को प्रेरित करने के लिए दवा सैक्विनावीर (एसक्यूवी) की प्रभावकारिता का परीक्षण किया। एसक्यूवी को मैक्रोफेज संस्कृतियों को अपने मुक्त रूप में प्रशासित किया गया था या लिपोसोम्स (लिपएसक्यूवी) में लोड किया गया था। उपचार तीन अलग-अलग सांद्रता में किए गए थे: 50, 20, और 10 μg / mL। मैक्रोफेज 3 घंटे के लिए विभिन्न एमटीबी उपभेदों से संक्रमित थे और फिर लिपएसक्यूवी और मुफ्त एसक्यूवी की चयनित सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। दवा के बिना लिपोसोम (लिपअनलोडेड) और डीएमएसओ को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। बैक्टीरियल इंट्रासेल्युलर अस्तित्व का मूल्यांकन करने के लिए, असतत समय बिंदुओं पर, मैक्रोफेज को lysed किया गया था, और बैक्टीरियल निलंबन के धारावाहिक कमजोर पड़ने को 7H10 अगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था। mCFU इकाइयों को 2-3 सप्ताह के बाद गिना गया। रेखाएं कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्रति नमूना औसत एमसीएफयू दर्शाती हैं। बार्स संक्रमण के बाद 7 दिन में संबंधित नियंत्रणों के सापेक्ष गणना किए गए औसत एमसीएफयू प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रतीक एक अलग दाता से मैक्रोफेज के साथ प्रत्येक प्रयोग का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। एकाधिक समूह तुलना एक तरह से एनोवा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया, एक होल्म-सिडक के बाद के बाद हॉक परीक्षण. * पी ≤0.05, ** पी ≤0.01, *** पी ≤0.001। इस आंकड़ेको 33 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

टीबी एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है, जिसका महत्व बढ़ रहा है, खासकर निम्न और मध्यम आय वाले देशों में। COVID-19 महामारी के दौरान टीबी के निदान और उपचार के लिए स्वास्थ्य देखभाल सेटिंग्स में व्यवधान नेनए मामलों की घटनाओं पर नकारात्मक प्रभाव डाला। इसके अलावा, बहु-दवा और व्यापक रूप से दवा प्रतिरोधी एमटीबी उपभेदों, और एमटीबी और एचआईवी के सह-संक्रमण को इस महामारी 1,34 को नियंत्रित करने के लिए तत्काल संबोधित किया जाना चाहिए। बीसीजी को बदलने या सुधारने के लिए नए टीके वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में हैं, और आनेवाले वर्षों में नए उम्मीदवार बाजार में आ सकते हैं। टीबी के खिलाफ नए टीके का विकास विभिन्न पशु मॉडलों का उपयोग करके पूर्व-नैदानिक अध्ययनों पर निर्भर करता है। पशु मॉडल में टीका प्रभावकारिता निर्धारण टीका 5,36 के सुरक्षात्मक प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए संक्रमित अंगों में बैक्टीरिया के बोझ मात्रा का ठहराव की आवश्यकता है. वर्तमान में, संक्रमित चूहों और गैर-मानव प्राइमेट्स में बैक्टीरिया के बोझ को निर्धारित करने के लिए प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तरीके हैं। प्रत्यक्ष तरीकों में फ्लोरोसेंट ऑरामाइन-ओ और ज़िहल-नीलसेन37 का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल तैयारी और बैक्टीरियल धुंधला हो जाना, आरटी-क्यूपीसीआर38 के आधार पर नमूनों में माइकोबैक्टीरियल लोड की मात्रा का ठहराव, और अन्य शामिल हैं।

माइकोबैक्टीरियल ग्रोथ इनहिबिशन परख (MGIA) BACTEC MGIT प्रणाली पर आधारित एक इन विट्रो परख है और यह एक संवेदनशील विधि है जिसका उपयोग टीकाकरण और गैर-टीकाकृत जानवरों में जीवित माइकोबैक्टीरियल बोझ को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रणाली एक पूरी तरह से स्वचालित उपकरण है जो विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए टेस्ट ट्यूबों में माइकोबैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए परीक्षण कर सकती है। शीशी में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर होता है जो नमूने में ऑक्सीजन की एकाग्रता पर प्रतिक्रिया करता है। प्रतिदीप्ति खपत ऑक्सीजन की मात्रा के लिए आनुपातिक है, नमूने में मौजूद जीवित बैक्टीरिया की संख्या का संकेत दे रही है, हर घंटे39. एमजीआईए विधि में, पीबीएमसी और ऑटोलॉगस सीरम नमूने जानवरों से एकत्र किए जाते हैं और 96 घंटे के लिए माइकोबैक्टीरिया के साथ सह-सुसंस्कृत होते हैं। फिर, इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरिया को छोड़ने के लिए पक्षपाती मोनोसाइट्स को lysed किया जाता है। सिस्टम ऑक्सीजन की खपत को मापने के द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से बैक्टीरिया के बोझ को निर्धारित करेगा40. इस विधि आम तौर पर दवा प्रतिरोध अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन हाल ही में टीबी टीका प्रभावकारिता मूल्यांकन40 के लिए लागू किया गया है.

व्यवहार्य माइकोबैक्टीरिया की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए इन विधियों को मानक सीएफयू के साथ पूरक किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक murine एयरोसोल M.tb चुनौती प्रयोग में टीका उम्मीदवारों का मूल्यांकन CFU11 द्वारा ऊतकों से प्राप्त कालोनियों की गणना करके प्राप्त किया है.

यहां वर्णित एमसीएफयू विधि क्लासिक सीएफयू विधि पर पर्याप्त सुधार हो सकती है, क्योंकि यह प्रदर्शन करने के लिए अधिक तेज़ है और उपयोग किए गए अभिकर्मकों के संदर्भ में और प्रयोगशाला स्थान की आवश्यकता के संदर्भ में सस्ती है। इस विधि एक ही प्रयोग में नमूनों का एक बड़ा सेट की एक साथ तुलना की अनुमति देता है, इस प्रकार परख-से-परख विविधताओं के प्रभाव को कम करने. उदाहरण के लिए, जैसा कि चित्रा 5 में वर्णित प्रयोग में दिखाया गया है, सीएफयू 16 वर्ग पेट्री डिश में एमसीएफयू विधि का उपयोग करके 1536 नमूनों के लिए निर्धारित किया गया था, जो उपयोग की जाने वाली प्लेटों की संख्या में 96 गुना कमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह प्राथमिक जैविक और नैदानिक नमूनों का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए अधिक प्रासंगिक है, जहां उपलब्धता एक मुद्दा हो सकता है। कॉम्पैक्ट रूप जिसमें कॉलोनियों को अगर प्लेट पर प्रदर्शित किया जाता है, आसानी से विशेष या सामान्य छवि-रिकॉर्डिंग उपकरण के उपयोग की अनुमति देता है। यह, स्वचालित कॉलोनी गिनती विधियों के साथ संयोजन में जैसे कि फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके यहां वर्णित है, सीएफयू की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने की उपयोगकर्ता की क्षमता पर निर्भरता को कम करने में मदद करता है। फिर भी, मानक सीएफयू तकनीक की तरह, यह विधि सीएफयू के संभावित अंडर-प्रतिनिधित्व के लिए विलय की गई कॉलोनियों को अलग करने में असमर्थता से ग्रस्त है। हालांकि, यह परिमाणीकरण प्रदर्शन करने के लिए एक उच्च कमजोर पड़ने का चयन करके या कॉलोनी विलय में उनके अतिवृद्धि परिणाम से पहले खुर्दबीन के तहत कालोनियों की गिनती करके कम से कम किया जा सकता है. यह अधिक प्रासंगिक है यदि नमूना विषम विकास दर के साथ कालोनियों का उत्पादन करता है। शोधकर्ताओं को उन मामलों में अपनी विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए mCFU कार्यान्वयन को मान्य करना चाहिए।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित बिंदु हैं: धारावाहिक dilutions बनाया एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और dilutions अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए; माइक्रोड्रॉपलेट चढ़ाना 0.5-10 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट के साथ किया जाना चाहिए ताकि 96-अच्छी प्लेट की प्रत्येक पंक्ति से ठोस मध्यम वर्ग प्लेट में 5 माइक्रोन स्थानांतरित किया जा सके, बिना माध्यम को छूने और नुकसान पहुंचाए; माइक्रो कॉलोनी गिनती इनक्यूबेशन के 6-10 दिनों के बीच किया जाना चाहिए. हालांकि, गिनती के समय, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि कॉलोनियां अत्यधिक बड़ी या बहुत छोटी नहीं हैं।

तकनीक के संशोधनों और समस्या निवारण में विभिन्न जीवाणु उपभेदों का उपयोग शामिल है। इसलिए, प्रत्येक तनाव के लिए, इष्टतम विकास माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए। तकनीक की सीमाएं पारंपरिक सीएफयू विधि की सीमाओं के समान हैं, जिसमें कम कमजोर पड़ने में बैक्टीरिया की गणना करने की कठिनाई शामिल है। इसके अतिरिक्त, इस विधि की विशिष्ट सीमाओं में कॉलोनियों की गणना करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की आवश्यकता शामिल है।

अंत में, इस पद्धति का उपयोग टीबी टीकाकरण अध्ययनों में बैक्टीरिया के बोझ को निर्धारित करने और परीक्षण दवा प्रतिरोध / संवेदनशीलता अध्ययन और मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत अध्ययन के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 मानव मैक्रोफेज में विभिन्न दवा योगों के साथ इलाज किए गए नैदानिक उपभेदों, बहु-दवा प्रतिरोधी और बड़े पैमाने पर दवा प्रतिरोधी उपभेदों सहित एमटीबी उपभेदों की इंट्रासेल्युलर हत्या के निर्धारण के लिए एमसीएफयू के आवेदन को दर्शाता है। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि को किसी भी सूक्ष्मजीव पर भी लागू किया जा सकता है, बशर्ते कि प्रत्येक जीव के लिए संवर्धन की स्थिति पूरी हो।

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Disclosures

डीपी और पीजेजीबी का दावा है कि अध्ययन किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम को चिकित्सा संकाय, यूनिवर्सिडेड कैटोलिका पोर्टुगुसा से आंतरिक वित्त पोषण और अनुदान UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020, और EXPL/SAU-INF/0742/2021 के तहत Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) से बाहरी फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).

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चिकित्सा अंक 197 टीके तपेदिक माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस बैसिलस कैलमेट-गुआ©रिन टीबी वैक्सीन नैदानिक परीक्षण पूर्व-नैदानिक विकास बैक्टीरियल कॉलोनियों की गणना कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों परख एमसीएफयू परख अभिकर्मक लागत इनक्यूबेशन अवधि लैब स्पेस स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिम
क्षय रोग के खिलाफ टीकों की प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए माइक्रो-कॉलोनी बनाने वाली इकाई परख
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Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

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