Summary
Bestemmelsen af kolonidannende enheder (CFU) er guldstandardteknikken til kvantificering af bakterier, herunder Mycobacterium tuberculosis , som kan tage uger at danne synlige kolonier. Her beskriver vi en mikro-CFU til CFU-bestemmelse med øget tidseffektivitet, reduceret laboratorieplads og reagensomkostninger og skalerbarhed til eksperimenter med medium og høj kapacitet.
Abstract
Tuberkulose (TB), den største dødsårsag på verdensplan af et smitstof, dræbte 1.6 millioner mennesker i 2022 og blev kun overgået af COVID-19 under pandemien 2019-2021. Sygdommen er forårsaget af bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Mycobacterium bovis-stammen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), den eneste TB-vaccine, er den ældste licenserede vaccine i verden, der stadig er i brug. I øjeblikket er der 12 vacciner i kliniske forsøg og snesevis af vacciner under præklinisk udvikling. Den foretrukne metode til vurdering af effekten af TB-vacciner i prækliniske undersøgelser er optælling af bakteriekolonier ved hjælp af den kolonidannende enheds (CFU) assay. Dette tidskrævende assay tager 4 til 6 uger at konkludere, kræver betydelig laboratorie- og inkubatorplads, har høje reagensomkostninger og er tilbøjelig til kontaminering. Her beskriver vi en optimeret metode til kolonitælling, mikro-CFU (mCFU), der tilbyder en enkel og hurtig løsning til at analysere M.tb-vaccinens effektivitetsresultater. mCFU-analysen kræver ti gange færre reagenser, reducerer inkubationsperioden tre gange, tager 1 til 2 uger at konkludere, reducerer laboratorieplads og reagensomkostninger og minimerer sundheds- og sikkerhedsrisici forbundet med at arbejde med et stort antal M.tb. For at evaluere effektiviteten af en TB-vaccine kan der desuden indhentes prøver fra en række forskellige kilder, herunder væv fra vaccinerede dyr, der er inficeret med mykobakterier. Vi beskriver også en optimeret metode til at producere en encellet, ensartet mykobakteriekultur af høj kvalitet til infektionsstudier. Endelig foreslår vi, at disse metoder bør anvendes universelt til prækliniske undersøgelser af bestemmelse af vaccineeffektivitet, hvilket i sidste ende fører til tidsreduktion i udviklingen af vacciner mod tuberkulose.
Introduction
Tuberkulose (TB) er den største dødsårsag på verdensplan af et enkelt infektiøst middel, bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb), der dræber flere mennesker end noget andet patogen. I 2021 var TB ansvarlig for 1.6 millioner dødsfald og blev overgået af COVID-19 under pandemien 2019-20211. Ifølge Verdenssundhedsorganisationens globale TB-rapport fra 2022 var COVID-19-pandemien desuden ansvarlig for en stigning i nye TB-tilfælde. WHO rapporterer også om store fald i antallet af personer diagnosticeret med TB i denne periode, hvilket yderligere kan øge antallet af TB-tilfælde1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er en levende svækket stamme af den patogene Mycobacterium bovis, der blev brugt for første gang som vaccine for mere end 100 år siden. Dette er den eneste vaccine mod TB og er den ældste licenserede vaccine i verden, der stadig er i brug 2,3. I øjeblikket er der 12 vacciner i forskellige faser af kliniske forsøg4, og snesevis af vacciner er under præklinisk udvikling 5,6. Præklinisk vurdering af vacciner mod TB omfatter evaluering af sikkerhed og immunogenicitet7, som kan opnås i forskellige dyremodeller såsom zebrafisk, mus, marsvin, kaniner, kvæg og ikke-menneskelige primater 8,9,10. Derudover kræver vurdering af en vaccines evne til at inducere beskyttelse mod M.tb-infektion og/eller transmission, dvs. vaccineeffektiviteten, en M.tb-provokation in vivo 5,11. Interessant nok inducerer BCG-vaccination ikke-specifikke virkninger, der påvirker overlevelsen af andre bakterielle og virale patogener12,13 gennem mekanismen for trænet immunitet14. For at kvantificere den levedygtige bakteriebyrde i et inficeret dyr er den valgte metode tælling af bakteriekolonier gennem den kolonidannende enheds (CFU) assay 5,15. CFU er en enhed, der estimerer antallet af mikroorganismer (bakterier eller svampe), der danner kolonier under specifikke vækstbetingelser. CFU'er stammer fra levedygtige og replikative mikroorganismer, og det absolutte antal levende mikroorganismer inden for hver koloni er vanskeligt at estimere. Det er usikkert, om en koloni stammer fra en eller flere mikroorganismer. CFU-enheden afspejler denne usikkerhed, hvorfor der kan observeres en stor variation i replikater af den samme prøve. Dette tidskrævende assay kræver specialiserede teknikere, der er uddannet til at arbejde i et biosikkerhedsniveau 3 (BSL3) facilitet, betydeligt laboratorie- og inkubatorrum, tager fra 4 til 6 uger at konkludere og er tilbøjelig til forurening.
I denne undersøgelse beskriver vi en optimeret metode til kolonitælling, mikro-CFU (mCFU), og tilbyder en enkel og hurtig løsning til at analysere resultaterne 15,16,17,18,19,20. mCFU-analysen kræver ti gange færre reagenser, reducerer inkubationsperioden tre gange, tager 1 til 2 uger at konkludere, reducerer laboratorieplads og reagensomkostninger og minimerer sundheds- og sikkerhedsrisici forbundet med at arbejde med et stort antal M.tb. Vi foreslår, at denne metode anvendes universelt til prækliniske undersøgelser af bestemmelse af vaccineeffektivitet, hvilket i sidste ende fører til tidsreduktion i udviklingen af vacciner mod tuberkulose. Endelig er denne optimerede metode til CFU-tælling blevet brugt til at kvantificere ikke kun mykobakterier, men også andre bakterier, såsom Escherichia coli og Ralstonia solanacearum21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen beskrevet her er for BCG, men kan anvendes på alle mykobakterier. BCG kan bruges som surrogatbakterie til TB-forsøg, når BSL3-faciliteter ikke er tilgængelige22. Følgende procedurer med BCG bør udføres under et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) og følge de relevante retningslinjer for biosikkerhed og god laboratoriepraksis for manipulation af farlige mikroorganismer i gruppe 2.
1. Forberedelse af kulturmedier
- Forbered Middlebrook 7H9 bouillon suppleret med 10% (v / v) oliesyre, albumin, dextrose og katalase (OADC) berigelse i henhold til leverandørens instruktioner. Suppler bouillon med 0,05% (v / v) tyloxapol.
BEMÆRK: Tyloxapol er en ikke-ionisk flydende polymer, der er blevet brugt som overfladeaktivt middel til at forhindre bakteriel klumpdannelse16. - Forbered Middlebrook 7H10 fast medium suppleret med 10% (v / v) OADC-berigelse i henhold til leverandørens instruktioner.
- Fordel 40 ml medium pr. kvadratisk petriskål (120 mm x 120 mm). Lad pladerne tørre for at minimere kondens ved agarens overflade.
BEMÆRK: Denne specifikke størrelse petriskål er grundlæggende for at muliggøre direkte transponering af mindst 96 dråber fra en 96-brønds plade. Effektiv tørring af pladerne vil senere lette pletteringen af små dråber bakteriel suspension og forhindre dråberne i at sprede sig. - Forbered enten Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) eller Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) til fremstilling af infektionsmediet. I begge tilfælde suppleres mediet med 10% føtalt kalveserum, 1% L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat. Tilsæt ikke penicillin og streptomycin til mediet.
2. Forberedelse af prøver
- Få prøver fra en række forskellige kilder. For at kvantificere CFU for at evaluere effektiviteten af en TB-vaccine skal du typisk erhverve prøver fra vaccineret og uvaccineret dyrevæv. For eksempel vasker muselunge og milt11 eller makaklunge, thorax og perifere lymfeknuder, milt, lever, hud, blod, knoglemarv og bronchoalveolær skylning23. Alternativt kan man få prøver fra in vitro-kulturer af makrofager/dendritiske celler/neutrofiler inficeret med BCG 18,19,20,24,25,26.
3. Produktion af BCG-kultur
BEMÆRK: For in vivo-studier af TB-vacciner er målet at forbedre effekten af BCG. Derfor anvendes BCG-vaccinerede grupper normalt som kontrol. BCG-stammer, der anvendes til vaccination af mennesker, er ideelle til test i dyremodeller. I dette tilfælde skal en BCG-kultur rekonstitueres i overensstemmelse med leverandørens anvisninger27. En BCG-kultur til in vivo-undersøgelser kan dog også produceres internt11. Produktionen af encellet, ensartet og højkvalitets BCG-kultur til in vitro-infektionsprotokoller er blevet produceret meget vellykket i flere undersøgelser 11,16,18,19,20,26,28,29 ved hjælp af følgende protokol, som også kan bruges til dyreudfordringsundersøgelser.
- Dyrkning 50 ml BCG i 7H9 bouillon ved 37 °C med omrøring ved 200 o / min. Varier lydstyrken efter eksperimentets behov.
- Hver dag i 8-10 dage samles 100 μL af kulturen og fortyndes ved at tilsætte 900 μL PBS i en 1 ml kuvette. Fortsæt derefter med at måle bakteriernes optiske tæthed (OD ved λ = 600 nm; OD600) i et spektrofotometer. Tegn en vækstkurve ud fra disse værdier. Identificer kulturens midterste logfase (når OD fordobles konsekvent pr. Tidsenhed).
- Forbered en efterfølgende kultur og inkuber, indtil den midterste/sene logvækstfase nås som i trin 3.1 og 3.2. Brug de værdier, der er opnået i det forrige trin, som vejledning. Sørg for, at kulturen ikke når den stationære vækstfase (når OD begynder at stabilisere) for at opretholde en kultur af god kvalitet af levedygtige bakterier.
- Saml kulturen i midten/sen logvækstfase. Centrifuger ved 3000 x g i 10 min. Supernatanten fjernes.
- Tilsæt 10 ml PBS for at vaske bakterierne. Centrifuger ved 3000 x g i 10 min. Supernatanten fjernes.
- Resuspender bakterierne med 5 ml infektionsmedier. Placer røret i et ultralydbad i 15 min, fuld effekt ved 80 Hz.
- Centrifuger ved 1000 x g i 10 min. Supernatanten opsamles, undgå pellet, da den er rig på bakterieklumper, som bør undgås i en BCG-kultur af høj kvalitet, og kassér den.
- Supernatantens OD måles. Her svarer kulturer i den eksponentielle vækstfase med en OD600 på 0,1 til 1 x 107 CFU/ml.
BEMÆRK: Hvert laboratorium bør producere sine egne BCG-vækstkurver, før eksperimenter påbegyndes for at etablere en lineær regression mellem OD600 og CFU ved hjælp af spektrofotometeret. Bemærk, at spektrofotometre har forskellige lysbaneafstande, som kan variere aflæsningerne opnået for den samme prøve. - Udfør enkle beregninger for at fastslå antallet af bakterier, der skal tilsættes til hver værtscellekultur. Antallet af bakterier pr. værtscelle er Multiplicity of Infection (MOI). Brug en MOI på 10 bakterier pr. Værtscelle, som er den mest almindelige MOI, der anvendes til BCG-infektionseksperimenter.
4. Analyse af mikrokolonidannende enhed
BEMÆRK: Når et in vivo - eller in vitro-infektionsforsøg er afsluttet, kan tællingen af bakterier udføres af mCFU. Ved in vivo-undersøgelser skal prøverne først homogeniseres i en perlepisker eller en anden vævshomogenisator. For in vitro-kulturer af makrofager/dendritiske celler/neutrofiler, der er inficeret med BCG, skal prøverne lyseres med et nonionisk vaskemiddel (f.eks. 0,05 % opløsning af nonionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel).
- Serielle fortyndinger ved hjælp af en 96-brøndplade: Udfør serielle 10-foldige fortyndinger af lysaterne i en steril 96-brøndplade i henhold til skemaet i figur 1A. Fordel lysaterne på række A og E. For hver plade er det maksimale antal prøver og/eller replikater 24.
- Der tilsættes 180 μLdH2Otil de resterende huller for at udføre seriefortyndingen.
- Brug en 12-kanals pipette til at resuspendere lysaterne i række A og overføre 20 μL til række B (20 μL lysat + 180 μL dH2O). Homogeniser godt. Gentag dette trin sekventielt for række B og C, indtil du når den sidste fortynding i række D.
BEMÆRK: Vi udfører normalt tre fortyndinger (100, 101, 102, 103) og bruger således 4 rækker af pladen (A-D eller E-H) til hvert sæt af 12 prøver og / eller replikater. - Mikrodråbebelægning: Brug en 0,5-10 μL (tynde spidser foretrækkes) multikanalpipette til at overføre 5 μL fra hver række af 96-brøndpladen til den faste mellemstore firkantede plade i henhold til figur 1B.
- Mens du langsomt pipetterer de 5 μL dråber, lad dem røre agaren let. Dette vil medvirke til at fjerne dråben fra spidsen mod agaren og reducere muligheden for tilbageholdelse af væsken inde i spidsen.
- Lad dråberne tørre, luk agarpladen og inkuber den ved 37 °C, mens bakterievæksten overvåges. Eventuelt inkuberes agarpladerne i en forseglet plastpose for at forhindre, at pladerne tørrer.
- Mikrokolonitælling: Efter ca. 6-10 dages inkubation kontrolleres for individuelle kolonier, der er synlige med det blotte øje (figur 2).
- Tæl kolonierne ved hjælp af det laveste forstørrelsesmål (4x eller lavere) af et inverteret optisk mikroskop eller forstørrelsesglas. Der bør foretages tællinger i fortyndingerne, hvor antallet af kolonier er lavere end 300 og højere end 30. Alternativt kan du bruge et kamera til at tage et billede af dråben for manuelt at tælle kolonier på computeren eller bruge software som ImageJ til at automatisere kolonitælling.
- Hvis du vil udtrykke celletal i CFU/ml, skal du bruge følgende ligning:
Hvor C = antal talte kolonier, V = rumfang belagt i μL, og Dil = fortynding, hvor kolonierne blev talt (100, 101, 102, 103). For eksempel, hvis 30 kolonier blev talt i en 5 μL dråbe i fortynding 102, så:
Figur 1. Skematisk gengivelse af mCFU-protokollen. A) Serielle 10 gange fortyndinger af de BCG-holdige lysater i en plade med 96 huller. B) Kvadratisk petriskål indeholdende fast næringssubstrat og overtrukket med 96 dråber á 5 μL hver. Dråber pipetteres direkte fra 96-brøndpladen ved hjælp af en multikanalpipette. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Mikrokolonidannende enheder af BCG efter 10 dages inkubation. Til venstre et foto af en firkantet petriskål overlejret med 96 dråber på hver 5 μL, som tidligere vist i figur 1B. Til højre svarer individuelle fotos af 3 dråber til et originalt lysat (10:0) og to fortyndinger (10,1, 10,2). Billeder blev taget ved hjælp af et DSRL-kamera udstyret med et 18-55 mm zoomobjektiv (plade) eller et 105 mm makroobjektiv (dråber). Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Tælling af mikrokolonidannende enhed i Fiji (ImageJ)
BEMÆRK: mCFU-metoden muliggør CFU-kvantificering af store sæt prøver. Billeder af dråberne kan optages til efterfølgende analyse for at lette kolonitællingen. Flere fotografiske enheder kan producere billeder med tilstrækkelig kvalitet til dette formål. Disse omfatter digitale kameraer, webkameraer, kameramonterede mikroskoper og forstørrelsesglas og mobiltelefoner. Gratis billedanalysesoftware som ImageJ giver mulighed for manuel eller automatiseret kolonitælling i disse billeder. For at demonstrere begge metoder vil Fiji blive brugt, som er en distribution af ImageJ, der pakker flere værktøjer til videnskabelig billedanalyse30. Fiji kan downloades fra https://fiji.sc/.
- Manuel optællingsmetode
- Åbn billedet, der indeholder mCFU i Fiji. Vælg Plugins > analysere > celletæller.
- I menuen Celletæller skal du vælge Initialiser og derefter vælge en tæller (f.eks. Type 1).
- Fortsæt ved at klikke på hver koloni. Hvert klik vises på billedet og opdaterer tælleren (figur 3). Hvis du vil fortryde utilsigtede klik, skal du vælge Slet.
- Registrer den værdi, der vises på tælleren. Klik på knappen Nulstil for at nulstille optællingen og åbne et nyt billede for at tælle yderligere eksempler.
BEMÆRK: Yderligere instruktioner om dette plugin kan findes på https://imagej.net/plugins/cell-counter.
- Automatisk optællingsmetode
- Åbn billedet, der indeholder mCFU i Fiji. Vælg Billede > Skriv > 8 -bit. Dette konverterer billedet til et 8-bit gråtonebillede.
- Vælg det ovale værktøj på værktøjslinjen, og tegn en oval rundt om området med kolonierne (figur 4A). Ovalen kan justeres efter tegning.
- Vælg Rediger > Ryd udenfor for at fjerne interferens fra det udvendige område (figur 4B). Vælg Billede > Juster > tærskel.
- Flyt skyderne i tærskelmenuen, indtil kolonierne vises med rødt, og baggrundsstøj minimeres (figur 4C).
- Vælg Anvend , og luk tærskelvinduet. Der genereres et sort-hvidt billede (figur 4D).
- Vælg Analysér > Analysér partikler. I vinduet Analysér partikler skal du angive området for koloniareal (mellem 1 og uendeligt, målt i kvadrerede pixels) og cirkularitet (mellem 0 og 1, hvor 1 er en perfekt cirkel; Figur 4E).
- Vælg Konturer i pop op-menuen Vis. Kontroller Vis resultater for detaljerede målinger for hver koloni i resultatvinduet. Markér Ryd resultater for at slette eventuelle tidligere målinger. Markér afkrydsningsfeltet Opsummer for at få vist de opsummerede resultater af målingerne (figur 4E).
- Start analysatoren ved at vælge OK. Der vises et nyt vindue, der viser alle de skitserede kolonier, der blev registreret og talt. Resultatvinduet viser detaljerne for hver koloni, og vinduet opsummerede resultater viser det samlede antal optalte kolonier (figur 4F).
BEMÆRK: Indstillingerne for størrelse og cirkularitet varierer med billedets opløsning og forstørrelse og koloniernes størrelse og form. Gentag processen flere gange, indtil de bedste indstillinger er fundet, der registrerer alle kolonier. Yderligere instruktioner om plugin til analyse af partikler kan findes på https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.
Figur 3. En manuel metode til at tælle mCFU ved hjælp af celletæller-plugin på Fiji-software. De blå prikker angiver kolonier, som brugeren allerede har klikket på. Menuen til højre viser antallet af kolonier, der hidtil er talt (antallet er 41). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. En automatiseret metode til at tælle mCFU ved hjælp af Fiji-software. (A, B) Området af interesse med kolonierne vælges ved hjælp af det ovale markeringsværktøj, og det udvendige område fjernes ved hjælp af kommandoen clear outside. (C, D) Et sort-hvidt billede af kolonierne genereres ved hjælp af tærskelværktøjet. (E, F) Antallet af kolonier kvantificeres ved hjælp af værktøjet til analyse af partikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mCFU-analysen, der er beskrevet her, øger mængden af information, der kan hentes fra en enkelt petriskål, til mindst 96 gange. Figur 5 viser en sammenligning af to lægemiddelleveringsmetoder til genanvendt brug af saquinavir (SQV)31,32 som et værtsrettet lægemiddel til behandling af tuberkulose. I dette assay blev fire forskellige stammer af Mycobacterium tuberculosis anvendt til at inficere primære humane makrofager. M. tuberkulose H37Rv laboratoriestamme og tre kliniske stammer isoleret fra patienter med aktiv TB af det portugisiske nationale sundhedsinstituts Dr. Ricardo Jorge (INSA): en lægemiddelmodtagelig stamme (INSA-kode 33427), en multipel lægemiddelresistent (MDR) stamme (INSA-kode 34192) og en omfattende lægemiddelresistent (XDR) stamme (INSA-kode 163761). Hver infektion med hver stamme blev yderligere multipliceret i otte forskellige behandlingsbetingelser, der sammenlignede tre forskellige koncentrationer af frit lægemiddel eller liposomfyldt lægemiddel med de respektive ikke-behandlede kontroller. Endelig blev hver tilstand analyseret på fire forskellige tidspunkter efter infektion. For at kvantificere intracellulær bakterievækst var den samlede mængde lysater ekstraheret fra hvert tidspunkt 32. Dette blev efterfulgt af tre serielle fortyndinger til hvert lysat, hvilket øgede antallet til 128 prøver. Multipliceret med de fire analyserede point resulterer i 512 prøver. Da eksperimentet blev gentaget ved hjælp af makrofager fra mindst tre forskellige bloddonorer, steg det samlede antal analyserede prøver til 1536. Ved hjælp af mCFU-metoden beskrevet her tegnede dette eksperiment sig kun for 16 kvadratiske petriskåle versus 1536, der ville være nødvendige ved hjælp af standard CFU-protokollen. Som vist i figur 5 kan resultaterne opnået med denne metode demonstrere statistisk signifikante forskelle mellem behandlingerne.
Figur 5. mCFU-metoden kan producere store mængder data fra et lille antal agarplader. Dette sæt eksperimenter testede effektiviteten af lægemidlet saquinavir (SQV) til at inducere intracellulær drab af M.tb laboratorie- og kliniske stammer i humane makrofager. SQV blev administreret til makrofagkulturerne i sin frie form eller indlæst i liposomer (LipSQV). Behandlingerne blev udført i tre forskellige koncentrationer: 50, 20 og 10 μg/ml. Makrofager blev inficeret med forskellige M.tb-stammer i 3 timer og derefter behandlet med udvalgte koncentrationer af LipSQV og fri SQV. Liposomer uden lægemidlet (LipUnloaded) og DMSO blev brugt som kontrol. For at evaluere bakteriel intracellulær overlevelse blev makrofager lyseret på diskrete tidspunkter, og serielle fortyndinger af bakteriesuspensionen blev belagt på 7H10 agarplader. mCFU-enheder blev talt efter 2-3 uger. Linjer viser den gennemsnitlige mCFU pr. prøve fra mindst 3 uafhængige eksperimenter. Barer repræsenterer den gennemsnitlige mCFU-procent beregnet i forhold til de respektive kontroller på dag 7 efter infektion. Symboler repræsenterer hvert eksperiment med makrofager fra en anden donor. Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Flere gruppesammenligninger blev udført ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af en Holm-Sidak post-hoc test. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Dette tal er ændret fra33. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TB er et vigtigt folkesundhedsproblem med stigende betydning, navnlig i lav- og mellemindkomstlande. Afbrydelsen af sundhedsindstillinger for at diagnosticere og behandle TB under COVID-19-pandemien forårsagede en negativ indvirkning på forekomsten af nye tilfælde1. Derudover skal multi-drug og extensivt lægemiddelresistente M.tb-stammer og co-infektion af M.tb og HIV behandles hurtigst muligt for at kontrollere denne epidemi 1,34. Nye vacciner til erstatning eller forbedring af BCG er i øjeblikket i kliniske forsøg, og nye kandidater kan komme på markedet i de kommende år35. Udviklingen af nye vaccinekandidater mod TB er afhængig af prækliniske undersøgelser ved hjælp af forskellige dyremodeller. Bestemmelsen af vaccineeffektiviteten i dyremodeller kræver kvantificering af bakteriel belastning i de inficerede organer for at påvise vaccinens beskyttende virkning 5,36. I øjeblikket er der direkte og indirekte metoder til at kvantificere bakteriebyrden hos inficerede mus og ikke-menneskelige primater. De direkte metoder omfatter histologiske præparater og bakteriel farvning ved anvendelse af fluorescerende auramin-o og Ziehl-Neelsen37, kvantificering af mykobakteriel belastning i prøver baseret på RT-qPCR38 og andre.
Det mykobakterielle væksthæmningsassay (MGIA) er et in vitro-assay baseret på BACTEC MGIT-systemet og er en følsom metode, der anvendes til at kvantificere levende mykobakteriel byrde hos vaccinerede og uvaccinerede dyr. Systemet er et fuldautomatisk instrument, der kan teste for tilstedeværelsen af mykobakterier i specialdesignede reagensglas. Hætteglasset indeholder en fluorescerende reporter, der reagerer på koncentrationen af ilt i prøven. Fluorescensen er proportional med mængden af forbrugt ilt, hvilket giver en indikation af antallet af levende bakterier til stede i prøven hver time39. I MGIA-metoden indsamles PBMC'er og autologe serumprøver fra dyr og dyrkes sammen med mykobakterier i 96 timer. Derefter lyseres klæbende monocytter for at frigive intracellulære mykobakterier. Systemet vil kvantificere bakteriebyrden indirekte ved at måle iltforbruget40. Denne metode anvendes typisk til lægemiddelresistensundersøgelser, men er for nylig blevet anvendt til TB-vaccineeffektivitetsevalueringen40.
Disse metoder kan suppleres med standard CFU for at bestemme det samlede antal levedygtige mykobakterier. For eksempel opnås evalueringen af vaccinekandidater i et murine aerosol M.tb-provokationseksperiment ved at opregne kolonier opnået fra væv ved CFU11.
Den her beskrevne mCFU-metode kan være en væsentlig forbedring i forhold til den klassiske CFU-metode, da den er hurtigere at yde og billig med hensyn til anvendte reagenser og med hensyn til krævet laboratorieplads. Denne metode tillader samtidig sammenligning af et stort sæt prøver i et enkelt eksperiment, hvilket reducerer virkningerne af assay-til-assay-variationer. Som vist i eksperimentet beskrevet i figur 5 blev CFU f.eks. bestemt for 1536 prøver ved anvendelse af mCFU-metoden i 16 kvadratiske petriskåle, hvilket repræsenterer en 96 gange reduktion i antallet af anvendte plader. Dette er mere relevant for forsøg med primære biologiske og kliniske prøver, hvor tilgængelighed kan være et problem. Den kompakte form, hvori kolonierne vises på en agarplade, tillader bekvemt brugen af specialiseret eller almindeligt billedoptagelsesudstyr. Dette i kombination med automatiserede kolonitællingsmetoder som den, der er beskrevet her ved hjælp af Fiji-softwaren, hjælper med at reducere afhængigheden af brugerens evne til at identificere og kvantificere CFU'en. Alligevel lider denne metode, ligesom standard CFU-teknikken, af manglende evne til at skelne mellem fusionerede kolonier, hvilket fører til en potentiel underrepræsentation af CFU. Dette kan dog minimeres ved at vælge en højere fortynding for at udføre kvantificeringen eller ved at tælle kolonierne under mikroskopet, før deres tilgroning resulterer i kolonifusion. Dette er mere relevant, hvis prøven producerer kolonier med heterogene væksthastigheder. Forskere bør validere mCFU-implementering for deres specifikke eksperimentelle forhold i disse tilfælde.
De kritiske trin i protokollen er følgende punkter: de serielle fortyndinger, der foretages, skal udføres ved hjælp af en 96-brøndplade, og fortyndingerne skal blandes grundigt; mikrodråbebelægningen skal udføres med en 0,5-10 μL multikanalpipette for at overføre 5 μL fra hver række af 96-brøndpladen til den faste mellemstore firkantede plade uden at røre ved og beskadige mediet; Mikrokolonitællingen skal udføres mellem 6-10 dages inkubation. På tidspunktet for optællingen skal man dog sørge for, at kolonierne ikke er for store eller for små.
Modifikationerne og fejlfinding af teknikken omfatter anvendelse af forskellige bakteriestammer. Derfor bør det optimale vækstmedium anvendes for hver stamme. Teknikkens begrænsninger er identiske med begrænsningerne ved den konventionelle CFU-metode, som omfatter vanskeligheden ved at tælle bakterier i lave fortyndinger. Derudover inkluderer specifikke begrænsninger ved denne metode nødvendigheden af at bruge et mikroskop til at opregne kolonierne.
Endelig kan denne metode anvendes til at kvantificere bakteriebyrden i TB-vaccinationsundersøgelser og til test af lægemiddelresistens/følsomhedsundersøgelser og værtspatogeninteraktionsundersøgelser. For eksempel viser figur 5 anvendelsen af mCFU til bestemmelse af intracellulær drab af M.tb-stammer , herunder kliniske stammer, multiresistente og ekstensivt resistente stammer behandlet med forskellige lægemiddelformuleringer i humane makrofager. Det er vigtigt, at denne metode også kan anvendes på enhver mikroorganisme, forudsat at dyrkningsbetingelserne for hver organisme er opfyldt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DP og PJGB erklærer, at undersøgelsen blev gennemført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af intern finansiering fra Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Universidade Católica Portuguesa, og ekstern finansiering fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) under tilskuddene UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 og EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 - 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
References
- World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O.
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D.
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J.
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
