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Medicine

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Abstract

La tuberculose, première cause de décès par agent infectieux dans le monde, a tué 1,6 million de personnes en 2022, n’étant dépassée que par la COVID-19 pendant la pandémie de 2019-2021. La maladie est causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La souche de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), le seul vaccin contre la tuberculose, est le plus ancien vaccin homologué au monde, toujours utilisé. À l’heure actuelle, 12 vaccins font l’objet d’essais cliniques et des dizaines de vaccins sont en cours de développement préclinique. La méthode de choix utilisée pour évaluer l’efficacité des vaccins antituberculeux dans les études précliniques est le dénombrement des colonies bactériennes par le test des unités formant colonies (UFC). Ce test fastidieux prend de 4 à 6 semaines à conclure, nécessite un espace de laboratoire et d’incubateur important, a des coûts de réactifs élevés et est sujet à la contamination. Nous décrivons ici une méthode optimisée pour le dénombrement des colonies, la micro-UFC (mCFU), qui offre une solution simple et rapide pour analyser les résultats d’efficacité du vaccin contre la tubercule anti-M.tb . Le test mCFU nécessite dix fois moins de réactifs, réduit la période d’incubation par trois, prenant 1 à 2 semaines pour conclure, réduit l’espace de laboratoire et le coût des réactifs, et minimise les risques pour la santé et la sécurité associés au travail avec un grand nombre de M.tb. De plus, pour évaluer l’efficacité d’un vaccin antituberculeux, des échantillons peuvent être prélevés à partir de diverses sources, y compris des tissus d’animaux vaccinés infectés par des mycobactéries. Nous décrivons également une méthode optimisée pour produire une culture mycobactérienne unicellulaire, uniforme et de haute qualité pour les études d’infection. Enfin, nous proposons que ces méthodes soient universellement adoptées pour les études précliniques de détermination de l’efficacité des vaccins, ce qui, en fin de compte, conduirait à réduire le temps de développement des vaccins contre la tuberculose.

Introduction

La tuberculose est la principale cause de décès dans le monde causée par un seul agent infectieux, la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M.tb), qui tue plus de personnes que tout autre agent pathogène. En 2021, la tuberculose a été responsable de 1,6 million de décès et a été dépassée par la COVID-19 pendant la pandémie de 2019-20211. De plus, selon le rapport mondial sur la tuberculose de 2022 de l’Organisation mondiale de la santé, la pandémie de COVID-19 a été responsable d’une augmentation des nouveaux cas de tuberculose. L’OMS signale également une forte baisse du nombre de personnes diagnostiquées avec la tuberculose au cours de cette période, ce qui pourrait encore augmenter le nombre de cas de tuberculose1.

Le bacille de Calmette-Guérin (BCG) est une souche vivante atténuée de l’agent pathogène Mycobacterium bovis, utilisée pour la première fois comme vaccin il y a plus de 100 ans. C’est le seul vaccin contre la tuberculose et le plus ancien vaccin homologué au monde encore utilisé 2,3. À l’heure actuelle, 12 vaccins sont en cours d’essais cliniques4 et des dizaines de vaccins sont en cours de développement préclinique 5,6. L’évaluation préclinique des vaccins contre la tuberculose comprend l’évaluation de l’innocuité et de l’immunogénicité7, qui peut être obtenue dans divers modèles animaux tels que le poisson-zèbre, la souris, le cochon d’Inde, le lapin, le bétail et les primates non humains 8,9,10. De plus, l’évaluation de la capacité d’un vaccin à induire une protection contre l’infection et/ou la transmission de M.tb, c’est-à-dire l’efficacité du vaccin, nécessite une provocation M.tb in vivo 5,11. Il est intéressant de noter que la vaccination par le BCG induit des effets non spécifiques qui affectent la survie d’autres agents pathogènes bactériens et viraux12,13 par le mécanisme de l’immunité entraînée14. Pour quantifier la charge bactérienne viable chez un animal infecté, la méthode de choix est le dénombrement des colonies bactériennes à l’aide du test des unités formant colonie (UFC) 5,15. L’UFC est une unité qui estime le nombre de micro-organismes (bactéries ou champignons) qui forment des colonies dans des conditions de croissance spécifiques. Les UFC proviennent de micro-organismes viables et réplicatifs, et le nombre absolu de micro-organismes vivants au sein de chaque colonie est difficile à estimer. On ne sait pas avec certitude si une colonie provient d’un ou de plusieurs micro-organismes. L’unité UFC reflète cette incertitude, d’où une grande variabilité peut être observée dans les répétitions d’un même échantillon. Ce test qui prend beaucoup de temps nécessite des techniciens spécialisés formés pour travailler dans une installation de niveau de biosécurité 3 (BSL3), un espace de laboratoire et d’incubateur important, prend de 4 à 6 semaines pour être conclu et est sujet à la contamination.

Dans cette étude, nous décrivons une méthode optimisée pour le dénombrement des colonies, le micro-UFC (mCFU), et proposons une solution simple et rapide pour analyser les résultats 15,16,17,18,19,20. Le test mCFU nécessite dix fois moins de réactifs, réduit la période d’incubation par trois, prenant 1 à 2 semaines pour conclure, réduit l’espace de laboratoire et le coût des réactifs, et minimise les risques pour la santé et la sécurité associés au travail avec un grand nombre de M.tb. Nous proposons que cette méthode soit universellement adoptée pour les études précliniques de détermination de l’efficacité des vaccins, ce qui conduirait à terme à une réduction du temps nécessaire à la mise au point de vaccins contre la tuberculose. Enfin, cette méthode optimisée de dénombrement de l’UFC a été utilisée pour quantifier non seulement les mycobactéries mais aussi d’autres bactéries, telles que Escherichia coli et Ralstonia solanacearum21.

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Protocol

REMARQUE : Le protocole décrit ici est pour le BCG mais peut être appliqué à n’importe quelle mycobactérie. Le BCG peut être utilisé comme bactérie de substitution pour les expériences sur la tuberculose lorsque les installations BSL3 ne sont pas disponibles22. Les procédures suivantes utilisant le BCG doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) et suivre les directives de biosécurité appropriées et les bonnes pratiques de laboratoire pour la manipulation des micro-organismes du groupe de danger 2.

1. Préparation des milieux de culture

  1. Préparez le bouillon Middlebrook 7H9 enrichi à 10 % (v/v) d’acide oléique, d’albumine, de dextrose et de catalase (OADC), selon les instructions du fournisseur. Complétez le bouillon avec 0,05 % (v/v) de tyloxapol.
    REMARQUE : Tyloxapol est un polymère liquide non ionique qui a été utilisé comme tensioactif pour empêcher la formation de grumeaux bactériens16.
  2. Préparer le milieu solide Middlebrook 7H10 complété par un enrichissement OADC à 10 % (v/v) selon les instructions du fournisseur.
  3. Répartir 40 mL de boîte de Pétri moyenne par carré (120 mm x 120 mm). Laissez sécher les plaques pour minimiser la condensation à la surface de la gélose.
    REMARQUE : Cette taille spécifique de boîte de Pétri est fondamentale pour permettre la transposition directe d’au moins 96 gouttelettes à partir d’une plaque à 96 puits. Un séchage efficace des plaques facilitera plus tard le placage de petites gouttelettes de suspension bactérienne et empêchera les gouttelettes de se propager.
  4. Préparez soit le milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), soit le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) pour produire le milieu d’infection. Dans les deux cas, complétez le milieu avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium. N’ajoutez pas de pénicilline et de streptomycine au milieu.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Procurez-vous des échantillons provenant de diverses sources. En règle générale, pour quantifier l’UFC afin d’évaluer l’efficacité d’un vaccin antituberculeux, il faut prélever des échantillons de tissus animaux vaccinés et non vaccinés. Par exemple, les poumons et la ratede souris 11 ou les poumons de macaques, les ganglions lymphatiques thoraciques et périphériques, la rate, le foie, la peau, le sang, la moelle osseuse et le lavage broncho-alvéolaire23. Vous pouvez également obtenir des échantillons provenant de cultures in vitro de macrophages, de cellules dendritiques ou de neutrophiles infectés par le BCG 18,19,20,24,25,26.

3. Production de culture BCG

NOTE : Pour les études in vivo des vaccins antituberculeux, l’objectif est d’améliorer l’efficacité du BCG. Par conséquent, les groupes vaccinés par le BCG sont généralement utilisés comme témoin. Les souches de BCG utilisées pour la vaccination humaine sont idéales pour les tests sur des modèles animaux. Dans ce cas, une culture du BCG doit être reconstituée selon les instructions du fournisseur27. Cependant, une culture BCG pour les études in vivo peut également être produite en interne11. La production d’une culture de BCG unicellulaire, uniforme et de haute qualité pour les protocoles d’infection in vitro a été produite avec beaucoup de succès dans plusieurs études 11,16,18,19,20,26,28,29, en utilisant le protocole suivant, qui peut également être utilisé pour les études de provocation animale.

  1. Culture 50 mL de BCG dans un bouillon 7H9, à 37 °C, avec agitation à 200 tr/min. Variez le volume en fonction des besoins de l’expérience.
  2. Chaque jour, pendant 8 à 10 jours, prélever 100 μL de la culture et la diluer en ajoutant 900 μL de PBS dans une cuvette de 1 mL. Procédez ensuite en mesurant la densité optique des bactéries (OD à λ=600 nm ; OD600) dans un spectrophotomètre. Tracez une courbe de croissance à partir de ces valeurs. Identifiez la phase mi-logarithmique de la culture (lorsque la DO double de façon constante par unité de temps).
  3. Préparer une culture subséquente et incuber jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase de croissance logarithmique / tardive comme aux étapes 3.1 et 3.2. Utilisez les valeurs obtenues à l’étape précédente à titre indicatif. Assurez-vous que la culture n’atteint pas la phase de croissance stationnaire (lorsque la DO commence à se stabiliser) pour maintenir une culture de bonne qualité de bactéries viables.
  4. Récoltez la culture à la phase de croissance des logarithmes au milieu ou à la fin de la phase de croissance. Centrifuger à 3000 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant.
  5. Ajouter 10 mL de PBS pour éliminer les bactéries. Centrifuger à 3000 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant.
  6. Remettre la bactérie en suspension avec 5 mL de milieu d’infection. Placez le tube dans un bain à ultrasons pendant 15 min, à pleine puissance à 80 Hz.
  7. Centrifuger à 1000 x g pendant 10 min. Récupérez le surnageant en évitant la pastille car elle est riche en amas bactériens qui doivent être évités dans une culture BCG de haute qualité et jetez-la.
  8. Mesurez la DO du surnageant. Ici, les cultures en phase de croissance exponentielle, avec un OD600 de 0,1, sont équivalentes à 1 x 107 UFC/mL.
    NOTE : Chaque laboratoire doit produire ses propres courbes de croissance du BCG avant de commencer les expériences afin d’établir une régression linéaire entre OD600 et CFU à l’aide du spectrophotomètre. Veuillez noter que les spectrophotomètres ont des distances de trajet de la lumière différentes, ce qui peut faire varier les lectures obtenues pour un même échantillon.
  9. Effectuez des calculs simples pour établir le nombre de bactéries à ajouter à chaque culture de cellules hôtes. Le nombre de bactéries par cellule hôte est la multiplicité d’infection (MOI). Utilisez un moment d’inertie de 10 bactéries par cellule hôte, qui est le moment d’inertie le plus couramment utilisé pour les expériences d’infection par le BCG.

4. Essai de l’unité formant des micro-colonies

REMARQUE : Une fois l’expérience d’infection in vivo ou in vitro terminée, le dénombrement des bactéries peut être effectué par mCFU. Pour les études in vivo , les échantillons doivent d’abord être homogénéisés dans un batteur à billes ou un autre homogénéisateur de tissus. Pour les cultures in vitro de macrophages, de cellules dendritiques ou de neutrophiles infectés par le BCG, les échantillons doivent être lysés à l’aide d’un détergent non ionique (p. ex., solution à 0,05 % de détergent non ionique non dénaturant).

  1. Dilutions en série à l’aide d’une plaque à 96 puits : effectuer des dilutions en série de 10 fois des lysats, dans une plaque stérile à 96 puits selon le schéma de la figure 1A. Répartissez les lysats sur les rangs A et E. Pour chaque plaque, le nombre maximum d’échantillons et/ou de répétitions est de 24.
  2. Ajouter 180 μL de dH2O dans les puits restants pour effectuer la dilution en série.
  3. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, remettre en suspension les lysats de la rangée A et transférer 20 μL dans la rangée B (lysat de 20 μL + 180 μL dH2O). Bien homogénéiser. Répétez cette étape séquentiellement pour les rangs B et C jusqu’à ce que vous atteigniez la dernière dilution du rang D.
    REMARQUE : Nous effectuons généralement trois dilutions (100, 101, 102, 103), utilisant ainsi 4 rangées de la plaque (A-D ou E-H) pour chaque ensemble de 12 échantillons et/ou répétitions.
  4. Placage par microgouttelettes : utiliser une pipette multicanaux de 0,5 à 10 μL (de préférence à pointes fines) pour transférer 5 μL de chaque rangée de la plaque à 96 puits vers la plaque carrée moyenne solide, conformément à la figure 1B.
  5. Tout en pipetant lentement les gouttelettes de 5 μL, laissez-les toucher légèrement la gélose. Cela aidera à faire décoller la gouttelette de l’embout vers la gélose et à réduire la possibilité de rétention du liquide à l’intérieur de l’embout.
  6. Laissez sécher les gouttelettes, fermez la plaque de gélose et incubez-la à 37 °C tout en surveillant la croissance bactérienne. Si vous le souhaitez, incubez les plaques de gélose dans un sac en plastique scellé pour éviter qu’elles ne sèchent.
  7. Dénombrement des microcolonies : après environ 6 à 10 jours d’incubation, vérifier la présence de colonies individuelles, visibles à l’œil nu (figure 2).
  8. Comptez les colonies à l’aide de l’objectif de grossissement le plus faible (4x ou moins) d’un microscope optique inversé ou d’une loupe. Les dénombrements doivent être effectués dans les dilutions où le nombre de colonies est inférieur à 300 et supérieur à 30. Vous pouvez également utiliser un appareil photo pour prendre une photo de la gouttelette afin de compter manuellement les colonies sur l’ordinateur ou utiliser un logiciel tel qu’ImageJ pour automatiser le comptage des colonies.
  9. Pour exprimer le nombre de cellules en UFC/mL, utilisez l’équation suivante :
    Equation 1
    Où C = nombre de colonies dénombrées, V = volume plaqué en μL et Dil = dilution là où les colonies ont été comptées (100, 101, 102, 103). Par exemple, si 30 colonies ont été dénombrées dans une gouttelette de 5 μL en dilution 102, alors :
    Equation 2

Figure 1
Graphique 1. Représentation schématique du protocole mCFU. (A) Dilutions en série 10 fois des lysats contenant du BCG dans une plaque à 96 puits. (B) Boîte de Pétri carrée contenant un milieu de culture solide et recouverte de 96 gouttelettes de 5 μL chacune. Les gouttelettes sont pipetées directement à partir de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Unités formant des micro-colonies de BCG après 10 jours d’incubation. À gauche, une photo d’une boîte de Pétri carrée recouverte de 96 gouttelettes de 5 μL chacune, comme le montre la figure 1B. À droite, des photos individuelles de 3 gouttelettes correspondent à un lysat original (100) et à deux dilutions (101, 102). Les photos ont été prises à l’aide d’un appareil photo DSRL équipé d’un objectif zoom 18-55 mm (plaque) ou d’un objectif macro 105 mm (gouttelettes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Comptage des unités formant des micro-colonies aux Fidji (ImageJ)

REMARQUE : La méthode mCFU permet la quantification CFU de grands ensembles d’échantillons. Des photos des gouttelettes peuvent être enregistrées pour une analyse a posteriori afin de faciliter le dénombrement des colonies. Plusieurs appareils photographiques permettent de produire des images d’une qualité suffisante à cet effet. Il s’agit notamment d’appareils photo numériques, de webcams, de microscopes et de loupes fixés à des caméras, ainsi que de téléphones portables. Un logiciel gratuit d’analyse d’images tel qu’ImageJ offre la possibilité de compter manuellement ou automatiquement les colonies dans ces images. Pour démontrer les deux méthodes, Fiji sera utilisé, qui est une distribution d’ImageJ qui regroupe plusieurs outils pour l’analyse scientifique d’images30. Fidji peut être téléchargé à partir de https://fiji.sc/.

  1. Méthode de comptage manuel
    1. Ouvrez l’image contenant le mCFU aux Fidji. Sélectionnez Plugins > Analyser > compteur de cellules.
    2. Dans le menu Compteur de cellules, sélectionnez Initialiser , puis sélectionnez un compteur (par exemple, Type 1).
    3. Procédez en cliquant sur chaque colonie. Chaque clic sera affiché sur l’image et mettra à jour le compteur (Figure 3). Pour annuler les clics accidentels, sélectionnez Supprimer.
    4. Enregistrez la valeur affichée sur le compteur. Cliquez sur le bouton Réinitialiser pour réinitialiser le comptage et ouvrir une nouvelle image pour compter des échantillons supplémentaires.
      REMARQUE : De plus amples instructions sur ce plugin peuvent être trouvées à https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Méthode de comptage automatisée
    1. Ouvrez l’image contenant le mCFU aux Fidji. Sélectionnez Image > Tapez > 8 bits. Cela convertira l’image en une image en niveaux de gris 8 bits.
    2. Sélectionnez l’outil Ovale dans la barre d’outils et dessinez un ovale autour de la zone où se trouvent les colonies (Figure 4A). L’ovale peut être ajusté après avoir été dessiné.
    3. Sélectionnez Edit > Clear Outside (Modifier effacer l’extérieur) pour supprimer toute interférence de la zone extérieure (Figure 4B). Sélectionnez Image > Ajuster > seuil.
    4. Déplacez les curseurs dans le menu Seuil jusqu’à ce que les colonies apparaissent en rouge et que le bruit de fond soit réduit au minimum (Figure 4C).
    5. Sélectionnez Appliquer et quittez la fenêtre de seuil. Une image en noir et blanc est générée (Figure 4D).
    6. Sélectionnez Analyser > Analyser les particules. Dans la fenêtre d’analyse des particules, spécifiez la plage de la zone de la colonie (entre 1 et l’infini, mesurée en pixels carrés) et de la circularité (entre 0 et 1, où 1 est un cercle parfait ; Graphique 4E).
    7. Sélectionnez Contours dans le menu contextuel Afficher. Cochez la case Afficher les résultats pour obtenir des mesures détaillées pour chaque colonie dans la fenêtre des résultats. Cochez la case Effacer les résultats pour effacer toutes les mesures précédentes. Cochez la case Summarize (Récapituler ) pour afficher les résultats résumés des mesures (Figure 4E).
    8. Lancez l’analyseur en sélectionnant OK. Une nouvelle fenêtre apparaît, affichant toutes les colonies délimitées qui ont été détectées et comptées. La fenêtre des résultats affiche les détails de chaque colonie, et la fenêtre des résultats résumés montre le nombre total de colonies dénombrées (Figure 4F).
      REMARQUE : Les paramètres de taille et de circularité varient en fonction de la résolution et du grossissement de l’image, ainsi que de la taille et de la forme des colonies. Répétez le processus plusieurs fois jusqu’à ce que les meilleurs paramètres soient trouvés pour détecter toutes les colonies. Vous trouverez de plus amples instructions sur le plugin d’analyse des particules à l’adresse https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figure 3
Graphique 3. Une méthode manuelle pour compter les mCFU à l’aide du plug-in de compteur de cellules sur le logiciel Fiji. Les points bleus indiquent les colonies sur lesquelles l’utilisateur a déjà cliqué. Le menu de droite affiche le nombre de colonies dénombrées jusqu’à présent (le décompte est de 41). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Méthode automatisée de comptage des mCFU à l’aide d’un logiciel fidjien. (A, B) La zone d’intérêt avec les colonies est sélectionnée à l’aide de l’outil de sélection ovale, et la zone extérieure est supprimée à l’aide de la commande Effacer l’extérieur. (C, D) Une image en noir et blanc des colonies est générée à l’aide de l’outil de seuil. (E, F) Le nombre de colonies est quantifié à l’aide de l’outil Analyser les particules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Le test mCFU décrit ici augmente la quantité d’informations pouvant être récupérées à partir d’une seule boîte de Pétri à au moins 96 fois. La figure 5 illustre une comparaison de deux méthodes d’administration de médicaments pour l’utilisation réorientée du saquinavir (SQV)31,32 comme médicament dirigé contre l’hôte pour traiter la tuberculose. Dans ce test, quatre souches différentes de Mycobacterium tuberculosis ont été utilisées pour infecter les macrophages humains primaires. M. tuberculosis H37Rv et trois souches cliniques isolées chez des patients atteints de tuberculose active par le Dr Ricardo Jorge (INSA) de l’Institut national de la santé portugais : une souche sensible aux médicaments (code INSA 33427), une souche multirésistante (MDR) (code INSA 34192) et une souche ultrarésistante aux médicaments (XDR) (code INSA 163761). Chaque infection par chaque souche a ensuite été multipliée en huit conditions de traitement différentes, en comparant trois concentrations différentes de médicament libre ou chargé de liposomes aux témoins respectifs non traités. Enfin, chaque condition a été analysée à quatre moments différents après l’infection. Pour quantifier la croissance bactérienne intracellulaire, la quantité totale de lysats extraits de chaque point temporel était de 32. S’en sont suivies trois dilutions en série pour chaque lysat, ce qui a porté le nombre à 128 échantillons. Multiplié par les quatre points analysés, les résultats ont été obtenus dans 512 échantillons. Étant donné que l’expérience a été répétée en utilisant des macrophages provenant d’au moins trois donneurs de sang différents, le nombre total d’échantillons analysés est passé à 1536. En utilisant la méthode mCFU décrite ici, cette expérience n’a pris en compte que 16 boîtes de Pétri carrées contre 1536 qui seraient nécessaires en utilisant le protocole CFU standard. Comme le montre la figure 5, les résultats obtenus avec cette méthode peuvent démontrer des différences statistiquement significatives entre les traitements.

Figure 5
Graphique 5. La méthode mCFU peut produire de grandes quantités de données à partir d’un petit nombre de plaques de gélose. Cette série d’expériences a testé l’efficacité du médicament saquinavir (SQV) pour induire la destruction intracellulaire des souches de laboratoire et cliniques de M.tb dans les macrophages humains. Le SQV a été administré aux cultures de macrophages sous sa forme libre ou chargé en liposomes (LipSQV). Les traitements ont été effectués à trois concentrations différentes : 50, 20 et 10 μg/mL. Les macrophages ont été infectés par différentes souches de M.tb pendant 3 h, puis traités avec des concentrations sélectionnées de LipSQV et de SQV libre. Des liposomes sans le médicament (LipUnloaded) et du DMSO ont été utilisés comme témoins. Pour évaluer la survie intracellulaire des bactéries, à des moments discrets, les macrophages ont été lysés et des dilutions en série de la suspension bactérienne ont été plaquées sur des plaques de gélose 7H10. Les unités mCFU ont été comptées après 2 à 3 semaines. Les lignes représentent la mUFC moyenne par échantillon d’au moins 3 expériences indépendantes. Les barres représentent le pourcentage moyen de mUFC calculé par rapport aux témoins respectifs au jour 7 après l’infection. Les symboles représentent chaque expérience avec des macrophages provenant d’un donneur différent. Les barres d’erreur représentent l’erreur type de la moyenne. Des comparaisons de plusieurs groupes ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA à un facteur suivie d’un test post-hoc de Holm-Sidak. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Ce chiffre a été modifié par rapport à33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La tuberculose est un problème de santé publique important qui prend de plus en plus d’importance, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire. La perturbation des établissements de santé pour diagnostiquer et traiter la tuberculose pendant la pandémie de COVID-19 a eu un impact négatif sur l’incidence des nouveaux cas1. De plus, il est urgent de s’attaquer aux souches multirésistantes et très résistantes de M.tb, ainsi qu’à la co-infection de M.tb et du VIH pour contrôler cette épidémie 1,34. De nouveaux vaccins destinés à remplacer ou à améliorer le BCG sont actuellement en cours d’essais cliniques, et de nouveaux candidats pourraient arriver sur le marché dans les années à venir35. Le développement de nouveaux candidats vaccins contre la tuberculose repose sur des études précliniques utilisant divers modèles animaux. La détermination de l’efficacité du vaccin dans des modèles animaux nécessite une quantification de la charge bactérienne dans les organes infectés pour démontrer l’effet protecteur du vaccin 5,36. À l’heure actuelle, il existe des méthodes directes et indirectes pour quantifier la charge bactérienne chez les souris infectées et les primates non humains. Les méthodes directes comprennent les préparations histologiques et la coloration bactérienne à l’aide de l’auramine-o fluorescente et du Ziehl-Neelsen37, la quantification de la charge mycobactérienne dans les échantillons sur la base de la RT-qPCR38, et d’autres.

Le test d’inhibition de la croissance mycobactérienne (MGIA) est un test in vitro basé sur le système BACTEC MGIT et est une méthode sensible utilisée pour quantifier la charge mycobactérienne vivante chez les animaux vaccinés et non vaccinés. Il s’agit d’un instrument entièrement automatisé qui permet de détecter la présence de mycobactéries dans des tubes à essai spécialement conçus. Le flacon contient un rapporteur fluorescent qui réagit à la concentration d’oxygène dans l’échantillon. La fluorescence est proportionnelle à la quantité d’oxygène consommée, ce qui donne une indication du nombre de bactéries vivantes présentes dans l’échantillon, toutes les heures39. Dans la méthode MGIA, des PBMC et des échantillons de sérum autologue sont prélevés sur des animaux et co-cultivés avec des mycobactéries pendant 96 h. Ensuite, les monocytes adhérents sont lysés pour libérer des mycobactéries intracellulaires. Le système quantifiera indirectement la charge bactérienne en mesurant la consommation d’oxygène40. Cette méthode est généralement utilisée pour les études sur la résistance aux médicaments, mais elle a été appliquée récemment à l’évaluation de l’efficacité du vaccin antituberculeux40.

Ces méthodes peuvent être complétées par l’UFC standard pour déterminer le nombre total de mycobactéries viables. Par exemple, l’évaluation des candidats vaccins dans le cadre d’une expérience de provocation M.tb en aérosol murin est réalisée en dénombrant les colonies obtenues à partir de tissus par CFU11.

La méthode mCFU décrite ici peut être une amélioration substantielle par rapport à la méthode CFU classique, car elle est plus rapide à réaliser et peu coûteuse en termes de réactifs utilisés et en termes d’espace de laboratoire requis. Cette méthode permet la comparaison simultanée d’un grand ensemble d’échantillons dans une seule expérience, diminuant ainsi les effets des variations d’un essai à l’autre. Par exemple, comme le montre l’expérience décrite à la figure 5, l’UFC a été déterminée pour 1536 échantillons à l’aide de la méthode mCFU dans 16 boîtes de Pétri carrées, ce qui représente une réduction de 96 fois du nombre de plaques utilisées. Ceci est plus pertinent pour les expériences utilisant des échantillons biologiques et cliniques primaires, où la disponibilité peut être un problème. La forme compacte dans laquelle les colonies sont affichées sur une plaque de gélose permet l’utilisation d’un équipement d’enregistrement d’images spécialisé ou commun. Ceci, combiné à des méthodes automatisées de comptage des colonies telles que celle décrite ici à l’aide du logiciel Fidji, permet de réduire la dépendance à l’égard de la capacité de l’utilisateur à identifier et à quantifier l’UFC. Malgré cela, comme la technique standard de l’UFC, cette méthode souffre de l’incapacité de distinguer les colonies fusionnées, ce qui entraîne une sous-représentation potentielle de l’UFC. Cependant, cela peut être minimisé en choisissant une dilution plus élevée pour effectuer la quantification ou en comptant les colonies au microscope avant que leur prolifération n’entraîne la fusion des colonies. Ceci est plus pertinent si l’échantillon produit des colonies avec des taux de croissance hétérogènes. Dans ces cas, les chercheurs devraient valider la mise en œuvre de la mCFU pour leurs conditions expérimentales spécifiques.

Les étapes critiques du protocole sont les suivantes : les dilutions en série effectuées doivent être effectuées à l’aide d’une plaque à 96 puits, et les dilutions doivent être soigneusement mélangées ; le placage par microgouttelettes doit être effectué à l’aide d’une pipette multicanaux de 0,5 à 10 μL pour transférer 5 μL de chaque rangée de la plaque à 96 puits vers la plaque carrée moyenne solide, sans toucher ni endommager le milieu ; Le comptage des micro-colonies doit être effectué entre 6 et 10 jours d’incubation. Cependant, au moment du dénombrement, il faut veiller à ce que les colonies ne soient ni trop grandes ni trop petites.

Les modifications et le dépannage de la technique comprennent l’utilisation de différentes souches bactériennes. Par conséquent, pour chaque variété, le milieu de culture optimal doit être utilisé. Les limites de la technique sont identiques à celles de la méthode CFU conventionnelle, qui incluent la difficulté de dénombrer les bactéries à de faibles dilutions. De plus, les limites spécifiques de cette méthode incluent la nécessité d’utiliser un microscope pour dénombrer les colonies.

Enfin, cette méthode peut être utilisée pour quantifier la charge bactérienne dans les études de vaccination antituberculeuse et pour tester les études de résistance/sensibilité aux médicaments et les études d’interaction hôte-pathogène. Par exemple, la figure 5 montre l’application de la mCFU pour la détermination de la destruction intracellulaire des souches de M.tb , y compris les souches cliniques, les souches multirésistantes et les souches ultrarésistantes aux médicaments traitées avec différentes formulations de médicaments, dans les macrophages humains. Il est important de noter que cette méthode peut également être appliquée à n’importe quel micro-organisme, à condition que les conditions de culture de chaque organisme soient remplies.

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Disclosures

DP et PJGB déclarent que l’étude a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par des fonds internes de la Faculté de médecine de l’Universidade Católica Portuguesa et des financements externes de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), dans le cadre des subventions UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 et EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

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Médecine Numéro 197 Vaccins Tuberculose Mycobacterium Tuberculosis Bacillus Calmette-Guërin© Vaccin contre la tuberculose Essais cliniques Développement préclinique Dénombrement des colonies bactériennes Dosage des unités formant colonie Dosage MCFU Coûts des réactifs Période d’incubation Espace de laboratoire Risques pour la santé et la sécurité
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