Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

Abstract

שחפת, סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי, הרגה 1.6 מיליון בני אדם בשנת 2022, רק עקף על ידי COVID-19 במהלך המגיפה 2019-2021. המחלה נגרמת על ידי החיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb). זן Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), החיסון היחיד לשחפת, הוא החיסון המורשה העתיק ביותר בעולם, שעדיין נמצא בשימוש. נכון לעכשיו, ישנם 12 חיסונים בניסויים קליניים ועשרות חיסונים בפיתוח פרה-קליני. שיטת הבחירה המשמשת להערכת היעילות של חיסוני שחפת במחקרים פרה-קליניים היא ספירת מושבות חיידקים על ידי בדיקת יחידות יוצרות מושבה (CFU). בדיקה זו גוזלת זמן רב ואורכת 4 עד 6 שבועות, דורשת שטח מעבדה ואינקובטור משמעותי, יש לה עלויות ריאגנטים גבוהות והיא מועדת לזיהום. כאן אנו מתארים שיטה אופטימלית לספירת מושבות, מיקרו-CFU (mCFU), המציעה פתרון פשוט ומהיר לניתוח תוצאות יעילות החיסון M.tb . בדיקת mCFU דורשת פי עשרה פחות ריאגנטים, מפחיתה את תקופת הדגירה פי שלושה, לוקח שבוע עד שבועיים לסיים, מפחיתה את שטח המעבדה ואת עלות המגיב, וממזערת את סיכוני הבריאות והבטיחות הקשורים לעבודה עם מספר גדול של M.tb. יתר על כן, כדי להעריך את יעילותו של חיסון נגד שחפת, ניתן לקבל דגימות ממגוון מקורות, כולל רקמות מבעלי חיים מחוסנים הנגועים במיקובקטריה. אנו מתארים גם שיטה אופטימלית לייצור תרבית מיקובקטריאלית חד-תאית, אחידה ואיכותית למחקרי זיהום. לבסוף, אנו מציעים לאמץ שיטות אלה באופן אוניברסלי למחקרים פרה-קליניים של קביעת יעילות החיסון, מה שיוביל בסופו של דבר לקיצור זמן בפיתוח חיסונים נגד שחפת.

Introduction

שחפת היא סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי יחיד, חיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb), והורגת יותר אנשים מכל פתוגן אחר. בשנת 2021, שחפת הייתה אחראית ל -1.6 מיליון מקרי מוות ועקפה את COVID-19 במהלך המגיפה 2019-20211. יתר על כן, על פי דו"ח השחפת העולמי של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2022, מגפת COVID-19 הייתה אחראית לעלייה במקרי שחפת חדשים. ארגון הבריאות העולמי מדווח גם על ירידה גדולה במספר האנשים שאובחנו עם שחפת בתקופה זו, מה שעלול להגדיל עוד יותר את מספר מקרי השחפת1.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG) הוא זן חי מוחלש של Mycobacterium bovis הפתוגני ששימש לראשונה כחיסון לפני יותר מ-100 שנה. זהו החיסון היחיד נגד שחפת והוא החיסון המורשה העתיק ביותר בעולם שעדיין בשימוש 2,3. נכון לעכשיו, ישנם 12 חיסונים בשלבים שונים של ניסויים קליניים4, ועשרות חיסונים נמצאים בפיתוח פרה-קליני 5,6. הערכה פרה-קלינית של חיסונים נגד שחפת כוללת הערכה של הבטיחות והאימונוגניות7, שניתן להשיג במודלים מגוונים של בעלי חיים כגון דגי זברה, עכברים, שרקנים, ארנבות, בקר ופרימטים לא אנושיים 8,9,10. בנוסף, הערכת יכולתו של חיסון לגרום להגנה מפני זיהום ו/או העברה של M.tb, כלומר יעילות החיסון, דורשת אתגר M.tb in vivo 5,11. באופן מעניין, חיסון BCG גורם להשפעות לא ספציפיות המשפיעות על הישרדותם של פתוגנים חיידקיים ונגיפיים אחרים12,13 באמצעות מנגנון של חסינות מאומנת14. כדי לכמת את הנטל החיידקי הקיים בחיה נגועה, שיטת הבחירה היא ספירת מושבות חיידקים באמצעות בדיקת יחידות יוצרות מושבה (CFU) 5,15. CFU היא יחידה המעריכה את מספר המיקרואורגניזמים (חיידקים או פטריות) היוצרים מושבות בתנאי גידול ספציפיים. CFUs מקורם במיקרואורגניזמים בני קיימא ומשכפלים, וקשה להעריך את המספר המוחלט של מיקרואורגניזמים חיים בתוך כל מושבה. לא בטוח אם המושבה נוצרה ממיקרואורגניזם אחד או יותר. יחידת CFU משקפת אי ודאות זו, ולכן ניתן לראות שונות גדולה בהעתקים של אותו מדגם. בדיקה גוזלת זמן זו דורשת טכנאים מיוחדים שהוכשרו לעבוד במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL3), שטח מעבדה ואינקובטור משמעותי, לוקח בין 4 ל -6 שבועות להסיק, והוא נוטה לזיהום.

במחקר זה, אנו מתארים שיטה אופטימלית לספירת מושבות, מיקרו-CFU (mCFU), ומציעים פתרון פשוט ומהיר לניתוח התוצאות 15,16,17,18,19,20. בדיקת mCFU דורשת פי עשרה פחות ריאגנטים, מפחיתה את תקופת הדגירה פי שלושה, לוקח שבוע עד שבועיים לסיים, מפחיתה את שטח המעבדה ואת עלות המגיב, וממזערת את סיכוני הבריאות והבטיחות הקשורים לעבודה עם מספר גדול של M.tb. אנו מציעים לאמץ שיטה זו באופן אוניברסלי למחקרים פרה-קליניים של קביעת יעילות החיסון, מה שיוביל בסופו של דבר לקיצור זמן בפיתוח חיסונים נגד שחפת. לבסוף, שיטה אופטימלית זו של ספירת CFU שימשה לכימות לא רק מיקובקטריה אלא גם חיידקים אחרים, כגון Escherichia coli ו- Ralstonia solanacearum21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מיועד ל-BCG, אך ניתן להחיל אותו על כל מיקובקטריה. BCG יכול לשמש כחיידק חלופי לניסויי שחפת כאשר מתקני BSL3 אינם זמינים22. יש לבצע את ההליכים הבאים באמצעות BCG תחת מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) ולעקוב אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית המתאימות ונוהלי מעבדה טובים למניפולציה של מיקרואורגניזמים מקבוצת סיכון 2.

1. הכנת מדיה תרבותית

  1. הכינו ציר Middlebrook 7H9 בתוספת 10% (v/v) חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז והעשרה של קטלאז (OADC), בהתאם להוראות הספק. להשלים את המרק עם 0.05% (v/v) של tyloxapol.
    הערה: Tyloxapol הוא פולימר נוזלי לא יוני ששימש כחומר פעילי שטח למניעת היווצרות גושים חיידקיים16.
  2. הכינו מדיום מוצק Middlebrook 7H10 בתוספת העשרת OADC של 10% (v/v) בהתאם להוראות הספק.
  3. מפזרים 40 מ"ל בינוני לכל צלחת פטרי מרובעת (120 מ"מ x 120 מ"מ). הניחו לצלחות להתייבש כדי למזער את העיבוי על פני השטח של האגר.
    הערה: גודל ספציפי זה של צלחת פטרי הוא בסיסי כדי לאפשר טרנספוזלציה ישירה של לפחות 96 טיפות מצלחת של 96 בארות. ייבוש יעיל של הצלחות יקל בהמשך על ציפוי טיפות קטנות של תרחיף חיידקי וימנע את התפשטות הטיפות.
  4. הכינו את Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) או את Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) כדי לייצר את מדיום הזיהום. בכל מקרה, יש להשלים את המדיום עם 10% סרום עגל עוברי, 1% L-גלוטמין ו-1 mM נתרן פירובט. אין להוסיף פניצילין וסטרפטומיצין למדיום.

2. הכנת מדגם

  1. קבל דוגמאות ממגוון מקורות. בדרך כלל, כדי לכמת CFU כדי להעריך את היעילות של חיסון לשחפת, לרכוש דגימות מרקמות בעלי חיים מחוסנים ולא מחוסנים. לדוגמה, ריאות עכבר וטחול11 או ריאות מקוק, בלוטות לימפה החזה וההיקפי, טחול, כבד, עור, דם, מח עצם, ושטיפת סימפונות23. לחלופין, יש לקבל דגימות מתרביות חוץ גופיות של מקרופאגים/תאים דנדריטיים/נויטרופילים הנגועים ב-BCG 18,19,20,24,25,26.

3. ייצור תרבות BCG

הערה: עבור מחקרי in vivo של חיסונים נגד שחפת, המטרה היא לשפר את היעילות של BCG. לכן, קבוצות מחוסנות BCG משמשות בדרך כלל כביקורת. זני BCG המשמשים לחיסון בני אדם אידיאליים לניסויים במודלים של בעלי חיים. במקרה זה, יש לבנות מחדש תרבית של BCG בהתאם להוראות הספק27. עם זאת, ניתן לייצר תרבית BCG למחקרי in vivo גם בתוך הבית11. הייצור של תרבית BCG חד-תאית, אחידה ואיכותית עבור פרוטוקולי זיהום חוץ גופי הופק בהצלחה רבה במספר מחקרים 11,16,18,19,20,26,28,29, תוך שימוש בפרוטוקול הבא, שיכול לשמש גם למחקרי אתגר בבעלי חיים.

  1. תרבית 50 מ"ל של BCG במרק 7H9, ב 37 ° C, עם תסיסה ב 200 סל"ד. שנו את עוצמת הקול בהתאם לצרכי הניסוי.
  2. כל יום, במשך 8-10 ימים, לאסוף 100 μL של התרבות ולדלל אותו על ידי הוספת 900 μL של PBS בקובט 1 מ"ל. לאחר מכן המשך על ידי מדידת הצפיפות האופטית של חיידקים (OD ב λ = 600 ננומטר; OD600) בספקטרופוטומטר. צייר עקומת צמיחה מערכים אלה. זהה את שלב אמצע יומן הרישום של התרבית (כאשר OD מכפיל את עצמו באופן עקבי ליחידת זמן).
  3. הכינו תרבית עוקבת ודגרו עד שמגיעים לשלב צמיחת היומן האמצעי/מאוחר כמו בשלבים 3.1 ו-3.2. השתמש בערכים שהתקבלו בשלב הקודם כהדרכה. ודא כי התרבית אינה מגיעה לשלב הצמיחה הנייחת (כאשר OD מתחיל להתייצב) כדי לשמור על תרבית באיכות טובה של חיידקים קיימא.
  4. אסוף את התרבית בשלב צמיחת היומן האמצעי/מאוחר. צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 10 דקות. הסר את supernatant.
  5. הוסף 10 מ"ל של PBS כדי לשטוף את החיידקים. צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 10 דקות. הסר את supernatant.
  6. להשעות את החיידקים עם 5 מ"ל של מדיה זיהום. הניחו את הצינור באמבט אולטרסאונד למשך 15 דקות, בעוצמה מלאה של 80 הרץ.
  7. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות. אספו את הסופרנאטנט והימנעו מהגלולה מכיוון שהיא עשירה בגושי חיידקים שיש להימנע מהם בתרבית BCG איכותית והשליכו אותה.
  8. למדוד את OD של supernatant. כאן, תרבויות בשלב הצמיחה המעריכית, עם OD600 של 0.1, שקולות ל- 1 x 107 CFU/mL.
    הערה: כל מעבדה צריכה לייצר עקומות גדילה BCG משלה לפני תחילת ניסויים כדי לבסס רגרסיה ליניארית בין OD600 ו- CFU באמצעות ספקטרופוטומטר. שים לב שלספקטרופוטומטרים יש מרחקי נתיב אור שונים, שיכולים לשנות את הקריאות המתקבלות עבור אותה דגימה.
  9. בצע חישובים פשוטים כדי לקבוע את מספר החיידקים שיש להוסיף לכל תרבית תאים מארחת. מספר החיידקים לכל תא מארח הוא ריבוי זיהומים (MOI). השתמשו ב-MOI של 10 חיידקים לכל תא מארח, שהוא ה-MOI הנפוץ ביותר המשמש לניסויי זיהום BCG.

4. בדיקת יחידה ליצירת מושבות מיקרו

הערה: לאחר השלמת ניסוי זיהום in vivo או in vitro , ספירת החיידקים יכולה להתבצע על ידי mCFU. עבור מחקרי in vivo , דגימות חייבות להיות הומוגניות תחילה במקציף חרוזים או הומוגנייזר רקמות אחר. עבור תרביות חוץ גופיות של מקרופאגים/תאים דנדריטיים/נויטרופילים הנגועים ב-BCG, הדגימות חייבות להיות בליזה באמצעות חומר ניקוי לא יוני (למשל, תמיסה של 0.05% של חומר ניקוי לא יוני, לא דנטורציה).

  1. דילולים סדרתיים באמצעות צלחת בעלת 96 בארות: בצעו דילולים סדרתיים של פי 10 של הליזאטים, בלוח סטרילי בעל 96 בארות בהתאם לסכמה באיור 1A. פיזור הליזטים בשורות A ו- E. עבור כל לוחית, המספר המרבי של דגימות ו / או עותקים משוכפלים הוא 24.
  2. הוסף 180 μL של dH2O לבארות הנותרות כדי לבצע את הדילול הטורי.
  3. באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, השהה מחדש את הליזטים בשורה A והעבר 20 μL לשורה B (20 μL lysate + 180 μL dH2O). הומוגניזציה היטב. חזור על שלב זה ברצף עבור שורות B ו- C עד שתגיע לדילול האחרון בשורה D.
    הערה: בדרך כלל אנו מבצעים שלושה דילולים (100, 101, 102, 103), ובכך משתמשים ב -4 שורות של הצלחת (A-D או E-H) עבור כל קבוצה של 12 דגימות ו / או משוכפלים.
  4. ציפוי מיקרו טיפתי: השתמשו בפיפטה רב-ערוצית של 0.5-10 μL (עדיף קצוות דקים) כדי להעביר 5 μL מכל שורה של צלחת 96 בארות לצלחת הריבועית הבינונית המוצקה, לפי איור 1B.
  5. תוך כדי פיטום איטי של טיפות 5 μL, אפשרו להן לגעת מעט באגר. זה יעזור להוריד את הטיפה מהקצה לכיוון האגר ולהפחית את האפשרות של שימור הנוזל בתוך הקצה.
  6. הניחו לטיפות להתייבש, סגרו את צלחת האגר ודגרו עליה בטמפרטורה של 37°C תוך מעקב אחר צמיחת חיידקים. לחלופין, יש לדגור על צלחות האגר בשקית ניילון אטומה כדי למנוע התייבשות של הצלחות.
  7. ספירת מיקרו-מושבות: לאחר כ-6-10 ימי דגירה, בדקו אם יש מושבות בודדות, הנראות לעין בלתי (איור 2).
  8. ספור את המושבות באמצעות מטרת ההגדלה הנמוכה ביותר (פי 4 ומטה) של מיקרוסקופ אופטי הפוך או זכוכית מגדלת. יש לבצע ספירות בדילולים שבהם מספר המושבות נמוך מ-300 וגבוה מ-30. לחלופין, השתמש במצלמה כדי לצלם תמונה של הטיפה כדי לספור מושבות באופן ידני במחשב או השתמש בתוכנה כגון ImageJ כדי להפוך את ספירת המושבות לאוטומטית.
  9. כדי לבטא מספרי תאים ב- CFU/mL, השתמש במשוואה הבאה:
    Equation 1
    כאשר C = מספר המושבות שנספרו, V = נפח מצופה μL, ודילול = דילול שבו נספרו המושבות (100, 101, 102, 103). לדוגמה, אם 30 מושבות נספרו בטיפה של 5 μL בדילול 102, אז:
    Equation 2

Figure 1
איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול mCCU. (A) דילול סדרתי של פי 10 של הליזטים המכילים BCG בצלחת של 96 בארות. (B) צלחת פטרי מרובעת המכילה מדיום תרבית מוצקה ומעליה 96 טיפות של 5 מיקרוליטר כל אחת. הטיפות נלקחות ישירות מהצלחת בעלת 96 הקידוחים באמצעות פיפטה רב ערוצית. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. מיקרו-מושבה יוצרת יחידות של BCG לאחר 10 ימי דגירה. משמאל, תמונה של צלחת פטרי מרובעת שעליה 96 טיפות של 5 מיקרוליטר כל אחת, כפי שהוצג קודם לכן באיור 1B. מימין, תמונות בודדות של 3 טיפות מתאימות לליזט מקורי (100) ושני דילולים (101, 102). התמונות צולמו באמצעות מצלמת DSRL המצוידת בעדשת זום 18-55 מ"מ (לוחית) או עדשת מאקרו 105 מ"מ (טיפות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. ספירת יחידות יוצרות מושבות מיקרו בפיג'י (ImageJ)

הערה: שיטת mCFU מאפשרת כימות CFU של קבוצות גדולות של דגימות. תמונות של הטיפות עשויות להיות מוקלטות לניתוח אחורי כדי להקל על ספירת המושבה. מספר מכשירי צילום יכולים להפיק תמונות באיכות מספקת למטרה זו. אלה כוללים מצלמות דיגיטליות, מצלמות רשת, מיקרוסקופים מחוברים למצלמה ומשקפיים מגדלים, וטלפונים סלולריים. תוכנה חינמית לניתוח תמונות כגון ImageJ מציעה את האפשרות של ספירת מושבות ידנית או אוטומטית בתמונות אלה. כדי להדגים את שתי השיטות, ייעשה שימוש בפיג'י, שהיא הפצה של ImageJ שאורזת מספר כלים לניתוח תמונות מדעי30. פיג'י ניתן להוריד מ https://fiji.sc/.

  1. שיטת ספירה ידנית
    1. פתח את התמונה המכילה את mCFU בפיג'י. בחר תוספים > לנתח מונה תאים >.
    2. בתפריט מונה תאים, בחר אתחול ולאחר מכן בחר מונה (לדוגמה, סוג 1).
    3. המשך על ידי לחיצה על כל מושבה. כל קליק יוצג בתמונה ויעדכן את המונה (איור 3). כדי לבטל לחיצות בשוגג, בחר מחק.
    4. רשום את הערך המוצג על הדלפק. לחץ על הלחצן איפוס כדי לאפס את הספירה ולפתוח תמונה חדשה כדי לספור דוגמאות נוספות.
      הערה: הוראות נוספות על תוסף זה ניתן למצוא בכתובת https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. שיטת ספירה אוטומטית
    1. פתח את התמונה המכילה את mCFU בפיג'י. בחר Image > Type > 8 סיביות. פעולה זו תמיר את התמונה לתמונה בקנה מידה אפור של 8 סיביות.
    2. בחרו בכלי אליפסה בסרגל הכלים וציירו אליפסה מסביב לאזור עם המושבות (איור 4A). ניתן לכוונן את האליפסה לאחר הציור.
    3. בחר Edit > Clear Outside כדי להסיר הפרעות מהאזור החיצוני (איור 4B). בחר תמונה > התאם סף >.
    4. הזיזו את המחוונים בתפריט הסף עד שהמושבות יופיעו באדום ורעש הרקע ימוזער (איור 4C).
    5. בחר החל וצא מחלון הסף. נוצרת תמונה בשחור-לבן (איור 4D).
    6. בחר נתח > נתח חלקיקים. בחלון ניתוח חלקיקים, ציין את הטווח עבור שטח מושבה (בין 1 לאינסוף, הנמדד בפיקסלים בריבוע) ומעגליות (בין 0 ל- 1, כאשר 1 הוא עיגול מושלם; איור 4E).
    7. בחר קווי מתאר בתפריט הקופצני של ההצגה. בדוק את הצג תוצאות לקבלת מדידות מפורטות עבור כל מושבה בחלון התוצאות. סמן את נקה תוצאות כדי למחוק מדידות קודמות. סמן את התיבה סיכום כדי להציג את התוצאות המסוכמות של המדידות (איור 4E).
    8. הפעל את המנתח על-ידי בחירה באפשרות אישור. מופיע חלון חדש, המציג את כל המושבות המסומנות שזוהו ונספרו. חלון התוצאות מציג את הפרטים עבור כל מושבה, וחלון התוצאות המסוכמות מציג את סך כל המושבות שנספרו (איור 4F).
      הערה: הגדרות הגודל והמעגליות ישתנו בהתאם לרזולוציה וההגדלה של התמונה ולגודל ולצורה של המושבות. חזור על התהליך מספר פעמים עד שיימצאו ההגדרות הטובות ביותר המזהות את כל המושבות. הוראות נוספות על תוסף ניתוח חלקיקים ניתן למצוא בכתובת https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figure 3
איור 3. שיטה ידנית לספירת mCFU באמצעות תוסף מונה התא בתוכנת פיג'י. הנקודות הכחולות מציינות מושבות שכבר לחצו עליהן על ידי המשתמש. התפריט מימין מציג את מספר המושבות שנספרו עד כה (הספירה היא 41). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. שיטה אוטומטית לספירת mCFU באמצעות תוכנת פיג'י. (א, ב) אזור העניין עם המושבות נבחר בעזרת כלי הבחירה הסגלגלה, והאזור החיצוני מוסר בעזרת הפקודה Clear Outside. (ג, ד) תמונה בשחור-לבן של המושבות נוצרת באמצעות הכלי סף. (ה, ו) מספר המושבות מכומת באמצעות כלי ניתוח חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדיקת mCFU המתוארת כאן מגדילה את כמות המידע שניתן לאחזר מצלוחית פטרי בודדת לפחות פי 96. איור 5 מתאר השוואה בין שתי שיטות למתן תרופות לשימוש מחדש בסקינביר (SQV)31,32 כתרופה המכוונת על ידי המאכסן לטיפול בשחפת. בניסוי זה, ארבעה זנים שונים של Mycobacterium tuberculosis שימשו כדי להדביק מקרופאגים אנושיים ראשוניים. מ. שחפת זן מעבדה H37Rv ושלושה זנים קליניים שבודדו מחולים עם שחפת פעילה על ידי ד"ר ריקרדו חורחה מהמכון הלאומי לבריאות של פורטוגל (INSA): זן רגיש לתרופות (קוד INSA 33427), זן עמיד לתרופות מרובות (MDR) (קוד INSA 34192), וזן עמיד לתרופות (XDR) (קוד INSA 163761). כל זיהום על ידי כל זן הוכפל עוד יותר לשמונה מצבי טיפול שונים, תוך השוואת שלושה ריכוזים שונים של תרופה חופשית או תרופה טעונה בליפוזומים לבקרות הלא מטופלות בהתאמה. לבסוף, כל מצב נותח בארבע נקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. כדי לכמת את צמיחת החיידקים התוך-תאיים, הכמות הכוללת של ליזטים שהופקו מכל נקודת זמן הייתה 32. לאחר מכן בוצעו שלושה דילולים סדרתיים לכל ליזט שהגדילו את המספר ל-128 דגימות. כפול ארבע נקודות הזמן שנותחו הביא לתוצאות של 512 דגימות. מכיוון שהניסוי חזר על עצמו באמצעות מקרופאגים מלפחות שלושה תורמי דם שונים, המספר הכולל של הדגימות שנותחו עלה ל-1536. באמצעות שיטת mCFU המתוארת כאן, ניסוי זה לקח בחשבון רק 16 צלחות פטרי מרובעות לעומת 1536 שהיו נחוצות באמצעות פרוטוקול CFU סטנדרטי. כפי שניתן לראות באיור 5, התוצאות המתקבלות בשיטה זו יכולות להדגים הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הטיפולים.

Figure 5
איור 5. שיטת mCFU יכולה להפיק כמויות גבוהות של נתונים ממספר קטן של לוחות אגר. סדרת ניסויים זו בדקה את יעילותה של התרופה saquinavir (SQV) כדי לגרום להרג תוך-תאי של מעבדת M.tb וזנים קליניים במקרופאגים אנושיים. SQV ניתן לתרביות המקרופאגים בצורתו החופשית או נטען בליפוזומים (LipSQV). הטיפולים בוצעו בשלושה ריכוזים שונים: 50, 20 ו-10 מק"ג/מ"ל. המקרופאגים היו נגועים בזני M.tb שונים במשך 3 שעות ולאחר מכן טופלו בריכוזים נבחרים של LipSQV ו-SQV חופשי. ליפוזומים ללא התרופה (LipUnloaded) ו-DMSO שימשו כאמצעי ביקורת. כדי להעריך את הישרדות החיידקים התוך-תאיים, בנקודות זמן בדידות, המקרופאגים עברו ליזה, ודילול סדרתי של תרחיף החיידקים היה מצופה על לוחות אגר 7H10. יחידות mCFU נספרו לאחר 2-3 שבועות. קווים מתארים את ממוצע mCFU לדגימה מלפחות 3 ניסויים עצמאיים. עמודות מייצגות את אחוז mCFU הממוצע המחושב ביחס לבקרות בהתאמה ביום 7 לאחר ההדבקה. סמלים מייצגים כל ניסוי עם מקרופאגים מתורם אחר. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. השוואות קבוצתיות מרובות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן הולם-סידאק פוסט-הוק. * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001. נתון זה שונהמ-33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שחפת היא בעיה חשובה בבריאות הציבור עם חשיבות גוברת, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. השיבוש במסגרות הבריאות לאבחון וטיפול בשחפת במהלך מגפת COVID-19 גרם להשפעה שלילית על שכיחות המקרים החדשים1. בנוסף, יש לטפל בדחיפות בזני M.tb הרב-תרופתיים והעמידים לתרופות, ובהדבקה המשותפת של M.tb ו-HIV כדי לשלוט במגיפה זו 1,34. חיסונים חדשים שיחליפו או ישפרו את BCG נמצאים כעת בניסויים קליניים, ומועמדים חדשים עשויים להגיע לשוק בשנים הקרובות35. פיתוח מועמדים חדשים לחיסון נגד שחפת מסתמך על מחקרים פרה-קליניים המשתמשים במודלים מגוונים של בעלי חיים. קביעת יעילות החיסון במודלים של בעלי חיים דורשת כימות נטל חיידקי באיברים הנגועים כדי להדגים את ההשפעה המגנה של החיסון 5,36. כיום, ישנן שיטות ישירות ועקיפות לכימות העומס החיידקי בעכברים נגועים ובפרימטים שאינם אנושיים. השיטות הישירות כוללות תכשירים היסטולוגיים וצביעה חיידקית באמצעות אוראמין פלואורסצנטי וזיהל-נילסן37, כימות עומס מיקובקטריאלי בדגימות על בסיס RT-qPCR38 ועוד.

בדיקת עיכוב גדילה מיקובקטריאלית (MGIA) היא בדיקה חוץ גופית המבוססת על מערכת BACTEC MGIT והיא שיטה רגישה המשמשת לכימות נטל מיקובקטריאלי חי בבעלי חיים מחוסנים ולא מחוסנים. המערכת היא מכשיר אוטומטי לחלוטין שיכול לבדוק נוכחות של מיקובקטריה במבחנות שתוכננו במיוחד. הבקבוקון מכיל כתב פלואורסצנטי המגיב לריכוז החמצן בדגימה. הפלואורסצנטיות פרופורציונלית לכמות החמצן הנצרכת, ונותנת אינדיקציה למספר החיידקים החיים הנמצאים בדגימה, כל שעה39. בשיטת MGIA, PBMCs ודגימות סרום אוטולוגיות נאספים מבעלי חיים ומתורבתים יחד עם מיקובקטריה במשך 96 שעות. לאחר מכן, מונוציטים דבקים הם lysed לשחרר mycobacteria תאיים. המערכת תכמת את העומס החיידקי בעקיפין על ידי מדידת צריכת חמצן40. שיטה זו משמשת בדרך כלל למחקרי עמידות לתרופות, אך יושמה לאחרונה בהערכת יעילות החיסון לשחפת40.

שיטות אלה ניתן להשלים עם CFU סטנדרטי כדי לקבוע את המספר הכולל של מיקובקטריה קיימא. לדוגמה, הערכת מועמדים לחיסון בניסוי אתגר תרסיס מורין M.tb מושגת על ידי ספירת מושבות שהתקבלו מרקמות על ידי CFU11.

שיטת mCFU המתוארת כאן יכולה להוות שיפור משמעותי לעומת שיטת CFU הקלאסית, מכיוון שהיא מהירה יותר לביצוע וזולה מבחינת ריאגנטים בשימוש ומבחינת שטח מעבדה נדרש. שיטה זו מאפשרת השוואה סימולטנית של קבוצה גדולה של דגימות בניסוי יחיד, ובכך מפחיתה את ההשפעות של וריאציות מבדיקה לבדיקה. לדוגמה, כפי שניתן לראות בניסוי המתואר באיור 5, CFU נקבע עבור 1536 דגימות בשיטת mCFU ב-16 צלחות פטרי מרובעות, מה שמייצג הפחתה של פי 96 במספר הצלחות שבהן נעשה שימוש. זה רלוונטי יותר לניסויים המשתמשים בדגימות ביולוגיות וקליניות ראשוניות, שבהן זמינות עשויה להיות בעיה. הצורה הקומפקטית שבה מוצגות המושבות על צלחת אגר מאפשרת בנוחות שימוש בציוד מיוחד או נפוץ להקלטת תמונות. זה, בשילוב עם שיטות ספירת מושבות אוטומטיות כמו זו המתוארת כאן באמצעות תוכנת פיג'י, מסייע להפחית את ההסתמכות על יכולתו של המשתמש לזהות ולכמת את CFU. עם זאת, בדומה לטכניקת CFU הסטנדרטית, שיטה זו סובלת מחוסר יכולת להבחין בין מושבות ממוזגות, מה שמוביל לתת-ייצוג פוטנציאלי של ה-CFU. עם זאת, ניתן למזער זאת על ידי בחירת דילול גבוה יותר לביצוע הכימות או על ידי ספירת המושבות תחת המיקרוסקופ לפני שצמיחת היתר שלהן תגרום למיזוג מושבות. זה רלוונטי יותר אם המדגם מייצר מושבות עם שיעורי צמיחה הטרוגניים. חוקרים צריכים לאמת את יישום mCFU עבור תנאי הניסוי הספציפיים שלהם במקרים אלה.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם הנקודות הבאות: יש לבצע את הדילולים הסדרתיים שבוצעו באמצעות צלחת 96 בארות, ויש לערבב היטב את הדילולים; ציפוי microdroplet צריך להתבצע עם פיפטה רב ערוצית 0.5-10 μL כדי להעביר 5 μL מכל שורה של צלחת 96 באר לצלחת בינונית ריבוע מוצק, מבלי לגעת ולפגוע בתווך; ספירת המיקרו-מושבות חייבת להתבצע בין 6-10 ימי דגירה. עם זאת, בעת הספירה יש להקפיד שהמושבות לא יהיו גדולות מדי או קטנות מדי.

השינויים ופתרון הבעיות של הטכניקה כוללים ניצול של זני חיידקים שונים. לכן, עבור כל זן, יש להשתמש במדיום הצמיחה האופטימלי. מגבלות הטכניקה זהות למגבלות שיטת CFU הקונבנציונלית, הכוללות את הקושי למנות חיידקים בדילול נמוך. בנוסף, מגבלות ספציפיות של שיטה זו כוללות את הצורך להשתמש במיקרוסקופ כדי למנות את המושבות.

לבסוף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לכמת את העומס החיידקי במחקרי חיסון נגד שחפת ולמחקרי עמידות/רגישות לתרופות ולמחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן. לדוגמה, איור 5 מראה את היישום של mCFU לקביעת הרג תוך-תאי של זני M.tb , כולל זנים קליניים, זנים עמידים לתרופות מרובות וזנים עמידים לתרופות באופן נרחב המטופלים בפורמולציות שונות של תרופות, במקרופאגים אנושיים. חשוב לציין, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על כל מיקרואורגניזם, בתנאי שתנאי הטיפוח עבור כל אורגניזם מתקיימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DP ו-PJGB מצהירות כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שעלולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון פנימי מהפקולטה לרפואה, Universidade Católica Portuguesa, ומימון חיצוני מ- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), במסגרת המענקים UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 ו- EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).

Tags

רפואה גיליון 197 חיסונים שחפת שחפת מיקובקטריום Bacillus calmette-Guérin חיסון נגד שחפת ניסויים קליניים פיתוח פרה-קליני ספירת מושבות חיידקים בדיקת יחידות יוצרות מושבה בדיקת MCFU עלויות מגיב תקופת הדגירה שטח המעבדה סיכוני בריאות ובטיחות
בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pires, D., Bettencourt, P. J. G.… More

Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter