Summary
콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.
Abstract
전 세계적으로 감염원에 의한 주요 사망 원인인 결핵(TB)은 2022년에 160만 명의 목숨을 앗아갔으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 COVID-19를 능가했습니다. 이 질병은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis , M.tb)에 의해 발생합니다. 유일한 결핵 백신인 Mycobacterium bovis 균주 Bacillus Calmette-Guérin(BCG)은 세계에서 가장 오래된 허가 백신으로 여전히 사용되고 있습니다. 현재 12개의 백신이 임상시험 중이며 수십 개의 백신이 전임상 개발 중입니다. 전임상 연구에서 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에 의한 박테리아 콜로니의 계수입니다. 이 시간 소모적인 분석은 결론을 내리는 데 4-6주가 걸리고, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간이 필요하며, 시약 비용이 높고, 오염되기 쉽습니다. 여기서는 M.tb 백신 효능 결과를 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공하는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)에 대해 설명합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 또한, 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 마이코박테리아에 감염된 백신을 접종한 동물의 조직을 포함하여 다양한 출처에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 감염 연구를 위해 단세포, 균일 및 고품질 마이코박테리아 배양을 생산하는 최적화된 방법을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이러한 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축해야 한다고 제안합니다.
Introduction
결핵(TB)은 단일 감염원인인 결 핵균(M.tb)에 의한 전 세계 주요 사망 원인으로, 다른 어떤 병원체보다 더 많은 사람을 사망에 이르게 합니다. 2021년 결핵은 160만 명의 사망자를 발생시켰으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 코로나19를 능가했습니다1. 또한 세계보건기구(WHO)의 2022년 전 세계 결핵 보고서에 따르면 코로나19 팬데믹으로 인해 새로운 결핵 사례가 증가했습니다. 세계보건기구(WHO)는 또한 이 기간 동안 결핵 진단을 받은 사람의 수가 크게 감소했다고 보고하고 있으며, 이로 인해 결핵 발병 건수는 더 증가할 수 있다1.
BCG(Bacillus Calmette-Guérin)는 100여 년 전에 백신으로 처음 사용된 병원성 Mycobacterium bovis의 약독화 생균주입니다. 이 백신은 결핵에 대한 유일한 백신이며 세계에서 가장 오래된 허가된 백신으로 여전히 사용되고 있습니다 2,3. 현재 12개의 백신이 서로 다른 임상시험 단계에 있으며4 수십 개의 백신이 전임상 개발 중에 있습니다5,6. 결핵 백신의 전임상 평가에는 안전성 및 면역원성7 평가가 포함되며, 이는 제브라피시, 마우스, 기니피그, 토끼, 소, 비인간 영장류와 같은 다양한 동물 모델에서 얻을 수 있다 8,9,10. 또한, M.tb 감염 및/또는 전염에 대한 보호를 유도하는 백신의 능력, 즉 백신 효능을 평가하기 위해서는 in vivo 5,11에서 M.tb 이의 제기가 필요합니다. 흥미롭게도, BCG 백신 접종은 훈련된 면역 14의 메커니즘을 통해 다른 박테리아 및 바이러스 병원체의 생존에 영향을 미치는 비특이적 효과를 유도한다12,13. 감염된 동물에서 생존 가능한 박테리아 부담을 정량화하기 위해 선택하는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석 5,15를 통해 박테리아 콜로니를 계수하는 것입니다. CFU는 특정 성장 조건에서 군체를 형성하는 미생물(박테리아 또는 곰팡이)의 수를 추정하는 단위입니다. CFU는 생존 가능한 미생물과 복제 가능한 미생물에서 유래하며, 각 군집 내에서 살아있는 미생물의 절대적인 수를 추정하기는 어렵습니다. 군체가 하나 이상의 미생물에서 유래했는지 여부는 불확실합니다. CFU 단위는 이러한 불확실성을 반영하므로 동일한 샘플의 반복실험에서 큰 변동성을 관찰할 수 있습니다. 시간이 많이 소요되는 이 분석에는 생물안전 레벨 3(BSL3) 시설, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간에서 작업하도록 훈련된 전문 기술자가 필요하며, 결론을 내리는 데 4주에서 6주가 소요되며 오염되기 쉽습니다.
이 연구에서는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)를 설명하고 결과 15,16,17,18,19,20을 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 우리는 이 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어야 하며, 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축할 것을 제안합니다. 마지막으로, 이 최적화된 CFU 계수 방법은 마이코박테리아뿐만 아니라 대장균(Escherichia coli) 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum21)과 같은 다른 박테리아도 정량화하는 데 사용되었습니다.
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Protocol
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 BCG용이지만 모든 마이코박테리아에 적용할 수 있습니다. BCG는 BSL3 시설을 이용할 수 없을 때 결핵 실험을 위한 대리 세균으로 사용될 수 있다22. BCG를 사용하는 다음 절차는 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행해야하며 위험 그룹 2 미생물 조작에 대한 적절한 생물 안전 지침 및 우수 실험실 관행을 따라야합니다.
1. 배양액 준비
- 공급업체의 지침에 따라 7%(v/v) 올레산, 알부민, 덱스트로오스 및 카탈라아제(OADC) 농축이 보충된 Middlebrook 9H10 육수를 준비합니다. 육수에 0.05%(v/v)의 타이록사폴을 보충합니다.
참고: Tyloxapol은 박테리아 덩어리 형성을 방지하기 위해 계면활성제로 사용된 비이온성 액체 폴리머입니다16. - 공급업체의 지침에 따라 7%(v/v) OADC 농축이 보충된 Middlebrook 10H10 고체 배지를 준비합니다.
- 정사각형 페트리 접시(120mm x 120mm)당 40mL의 배지를 분배합니다. 한천 표면의 응결을 최소화하기 위해 플레이트를 건조시키십시오.
알림: 이 특정 크기의 페트리 접시는 96웰 플레이트에서 최소 96개의 물방울을 직접 전치할 수 있도록 하는 데 기본입니다. 플레이트의 효과적인 건조는 나중에 박테리아 현탁액의 작은 물방울의 도금을 용이하게 하고 물방울이 퍼지는 것을 방지합니다. - 감염 배지를 생산하기 위해 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI 1640) 또는 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM)를 준비합니다. 두 경우 모두 배지에 10% 태아 송아지 혈청, 1% L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨을 보충하십시오. 페니실린과 스트렙토마이신을 배지에 첨가하지 마십시오.
2. 샘플 준비
- 다양한 출처에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 일반적으로 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 CFU를 정량화하려면 백신을 접종한 동물과 접종하지 않은 동물 조직에서 샘플을 채취합니다. 예를 들어, 쥐의 폐 및 비장(spleen)11 또는 원숭이 폐(macaque lung), 흉부 및 말초 림프절(superracic lymph nodes), 비장(spleen), 간(liver), 피부(skin), 혈액(blood), 골수(bone marrow), 기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage wash)23이 있다. 또는 BCG 18,19,20,24,25,26에 감염된 대식세포/수지상세포/호중구의 시험관 내 배양에서 샘플을 얻습니다.
3. BCG 문화의 생산
참고: 결핵 백신의 생체 내 연구의 목표는 BCG의 효능을 개선하는 것입니다. 따라서 BCG 백신 접종 그룹이 일반적으로 대조군으로 사용됩니다. 인간 백신 접종에 사용되는 BCG 균주는 동물 모델 테스트에 이상적입니다. 이 경우 BCG 문화는 공급자의 지침27에 따라 재구성되어야 합니다. 그러나, 생체 내 연구를 위한 BCG 배양물은 또한 사내에서 생산될 수 있다11. 체외 감염 프로토콜을 위한 단세포, 균일 및 고품질 BCG 배양의 생산은 동물 챌린지 연구에도 사용할 수 있는 다음 프로토콜을 사용하여 여러 연구 11,16,18,19,20,26,28,29에서 매우 성공적으로 생산되었습니다.
- BCG 50mL를 7H9 육수에 넣고 37°C에서 200rpm에서 교반하여 배양합니다. 실험의 필요에 따라 볼륨을 변경합니다.
- 매일 8-10일 동안 100μL의 배양액을 수집하고 1mL 큐벳에 900μL의 PBS를 첨가하여 희석합니다. 그런 다음 박테리아의 광학 밀도를 측정하여 진행합니다(λ=600nm에서 OD; OD600)을 분광 광도계에 담았다. 이러한 값에서 성장 곡선을 그립니다. 문화권의 중간 로그 단계(OD가 시간 단위당 일관되게 두 배가 되는 경우)를 식별합니다.
- 후속 배양을 준비하고 3.1 및 3.2단계에서와 같이 중간/후기 로그 성장 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 이전 단계에서 얻은 값을 지침으로 사용합니다. 배양이 고정 성장 단계(OD가 안정화되기 시작할 때)에 도달하지 않도록 하여 생존 가능한 박테리아의 양호한 품질의 배양을 유지합니다.
- 로그 증가 중간/후기 단계에서 배양을 수집합니다. 3000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
- PBS 10mL를 추가하여 박테리아를 씻어냅니다. 3000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
- 5mL의 감염 배지로 박테리아를 재현탁시킵니다. 튜브를 초음파 수조에 15분 동안 넣고 80Hz에서 최대 전력으로 가열합니다.
- 1000 x g 에서 10분 동안 원심분리기 펠릿을 피하는 상층액은 고품질 BCG 배양에서 피해야 하는 박테리아 덩어리가 풍부하므로 수집하여 폐기하십시오.
- 상층액의 OD를 측정합니다. 여기서 OD600 이 0.1인 기하급수적 성장 단계의 배양액은 1 x 107 CFU/mL에 해당합니다.
참고: 각 실험실은 분광 광도계를 사용하여 OD600과 CFU 사이의 선형 회귀를 설정하기 위해 실험을 시작하기 전에 자체 BCG 성장 곡선을 생성해야 합니다. 분광 광도계는 광 경로 거리가 다르기 때문에 동일한 샘플에 대해 얻은 판독값이 달라질 수 있습니다. - 간단한 계산을 수행하여 각 숙주 세포 배양에 추가할 박테리아 수를 설정합니다. 숙주 세포당 박테리아 수는 감염 다중성(MOI)입니다. 숙주 세포당 10개의 박테리아 MOI를 사용하며, 이는 BCG 감염 실험에 사용되는 가장 일반적인 MOI입니다.
4. 단위 분석실험을 형성하는 마이크로 콜로니
참고: in vivo 또는 in vitro 감염 실험이 완료된 후 mCFU로 박테리아 계수를 수행할 수 있습니다. in vivo 연구의 경우, 먼저 비드 비터 또는 다른 조직 균질화기에서 샘플을 균질화해야 합니다. BCG에 감염된 대식세포/수지상세포/호중구의 시험관 내 배양의 경우 비이온성 세제(예: 비이온성, 비변성 세제의 0.05% 용액)를 사용하여 샘플을 용해해야 합니다.
- 96웰 플레이트를 사용한 연속 희석: 그림 1A의 계획에 따라 멸균 96웰 플레이트에서 용해물을 연속 10배 희석합니다. 용해물을 행 A와 E에 분포시킵니다. 각 플레이트의 최대 샘플 및/또는 반복실험 수는 24개입니다.
- 나머지 웰에 180μL의dH2O를 추가하여 연속 희석을 수행합니다.
- 12채널 피펫을 사용하여 A열에서 용해물을 재현탁시키고 20μL를 B열로 옮깁니다(20μL 용해물 + 180μLdH2O). 잘 균질화하십시오. D 행의 마지막 희석에 도달 할 때까지 B 행과 C 행에 대해이 단계를 순차적으로 반복합니다.
참고: 우리는 일반적으로 세 번의 희석(100, 101, 102, 103)을 수행하므로 12개의 샘플 및/또는 반복 횟수의 각 세트에 대해 4줄의 플레이트(AD 또는 EH)를 사용합니다. - 마이크로 액적 도금: 그림 1B에 따라 0.5-10μL(얇은 팁 선호) 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 행에서 단단한 중간 정사각형 플레이트로 5μL를 전달합니다.
- 5μL 방울을 천천히 피펫팅하면서 한천에 약간 닿도록 합니다. 이렇게 하면 팁에서 한천 쪽으로 물방울을 제거하고 팁 내부에 액체가 머무를 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다.
- 물방울을 건조시키고 한천 플레이트를 닫은 다음 박테리아 성장을 모니터링하면서 37°C에서 배양합니다. 선택적으로, 플레이트가 건조되는 것을 방지하기 위해 밀봉된 비닐 봉지에 한천 플레이트를 배양합니다.
- 마이크로 콜로니 카운팅: 약 6-10일의 배양 후 육안으로 볼 수 있는 개별 콜로니를 확인합니다(그림 2).
- 도립 광학 현미경 또는 돋보기의 가장 낮은 배율 대물렌즈(4x 이하)를 사용하여 콜로니를 계산합니다. 콜로니의 수가 300 미만이고 30 이상인 희석액에서 계수를 수행해야합니다. 또는 카메라를 사용하여 물방울 사진을 찍어 컴퓨터에서 수동으로 콜로니를 계산하거나 ImageJ와 같은 소프트웨어를 사용하여 콜로니 카운팅을 자동화합니다.
- 세포 수를 CFU/mL로 표현하려면 다음 방정식을 사용하십시오.
여기서 C = 계수된 콜로니의 수, V = μL로 도금된 부피, Dil = 콜로니가 계수된 희석(100, 101, 102, 103). 예를 들어, 희석 102에서 5 μL 액적에서 30 콜로니를 계수하면 다음과 같습니다.
그림 1. mCFU 프로토콜의 개략도 표현. (A) 96웰 플레이트에서 BCG 함유 용해물의 연속 10배 희석. (B) 고체 배양 배지를 포함하고 각각 5μL의 96개 방울로 오버레이된 정사각형 페트리 접시. 액적은 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 직접 피펫팅됩니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 10일간의 배양 후 BCG의 미세 집락 형성 단위. 왼쪽은 이전에 그림 1B에 표시된 것처럼 각각 5μL의 96개 방울로 겹쳐진 정사각형 페트리 접시의 사진입니다. 오른쪽에서 3 개의 물방울의 개별 사진은 원래 용해물 (100)과 2 개의 희석 (101, 102)에 해당합니다. 사진은 18-55mm 줌 렌즈(플레이트) 또는 105mm 매크로 렌즈(물방울)가 장착된 DSRL 카메라를 사용하여 촬영했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 피지에서 단위를 세는 마이크로 콜로니 형성 (ImageJ)
참고: mCFU 분석법을 사용하면 대규모 샘플 세트의 CFU 정량화가 가능합니다. 콜로니 계수를 용이하게 하기 위해 사후 분석을 위해 액적의 사진을 기록할 수 있습니다. 여러 사진 장치는 이러한 목적을 위해 충분한 품질의 이미지를 생성할 수 있습니다. 여기에는 디지털 카메라, 웹캠, 카메라 부착 현미경 및 돋보기, 휴대폰이 포함됩니다. ImageJ와 같은 무료 이미지 분석 소프트웨어는 이러한 이미지에서 수동 또는 자동 콜로니 카운팅의 가능성을 제공합니다. 두 가지 방법을 모두 시연하기 위해, 과학적 이미지 분석(30)을 위한 여러 도구들을 패키징하는 ImageJ의 배포판인 피지가 사용될 것이다. 피지는 https://fiji.sc/ 에서 다운로드 할 수 있습니다.
- 수동 계수 방법
- 피지에서 mCFU가 포함된 이미지를 엽니다. Plugins(플러그인) > Analyze > Cell Counter(세포 카운터 분석)를 선택합니다.
- 셀 카운터 메뉴에서 초기화 를 선택한 다음 카운터를 선택합니다(예: 1 입력).
- 각 식민지를 클릭하여 진행하십시오. 클릭할 때마다 그림에 표시되고 카운터가 업데이트됩니다(그림 3). 실수로 클릭한 것을 취소하려면 삭제를 선택합니다.
- 카운터에 표시된 값을 등록합니다. 재설정 버튼을 클릭하여 카운트를 재설정하고 새 이미지를 열어 추가 샘플을 카운트합니다.
참고: 이 플러그인에 대한 자세한 지침은 https://imagej.net/plugins/cell-counter 에서 확인할 수 있습니다.
- 자동 계수 방법
- 피지에서 mCFU가 포함된 이미지를 엽니다. 이미지 > 유형 > 8비트를 선택합니다. 이렇게 하면 이미지가 8비트 회색조 이미지로 변환됩니다.
- 도구 모음에서 Oval 도구를 선택하고 콜로니가 있는 영역 주위에 타원을 그립니다(그림 4A). 타원은 그린 후 조정할 수 있습니다.
- Edit(편집) > Clear Outside(외부 지우기)를 선택하여 외부 영역의 간섭을 제거합니다(그림 4B). [이미지]> [임계값 조정]> 선택합니다.
- 콜로니가 빨간색으로 나타나고 배경 잡음이 최소화될 때까지 임계값 메뉴의 슬라이더를 움직입니다(그림 4C).
- 적용을 선택하고 임계값 창을 종료합니다. 흑백 이미지가 생성됩니다(그림 4D).
- 분석(Analyze) > 입자 분석(Analyze Particles)을 선택합니다. 입자 분석 창에서 콜로니 면적(1과 무한대 사이, 제곱 픽셀로 측정) 및 원형도(0과 1 사이, 여기서 1은 완전한 원)의 범위를 지정합니다. 그림 4E).
- 표시 팝업 메뉴에서 윤곽선을 선택합니다. 결과 창에서 각 콜로니에 대한 자세한 측정값을 보려면 결과 표시(Display Results )를 확인하십시오. Clear Results(결과 지우기 )를 선택하여 이전 측정값을 지웁니다. 요약( Summarize ) 상자를 선택하여 요약된 측정 결과를 표시합니다(그림 4E).
- 확인을 선택하여 분석기를 시작합니다. 새 창이 나타나고 감지되고 계수된 모든 윤곽선이 표시됩니다. 결과 창에는 각 콜로니에 대한 세부 정보가 표시되고, 요약된 결과 창에는 개수된 총 콜로니가 표시됩니다(그림 4F).
참고: 크기 및 원형도에 대한 설정은 이미지의 해상도와 배율, 콜로니의 크기 및 모양에 따라 달라집니다. 모든 콜로니를 감지하는 최상의 설정을 찾을 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다. 파티클 분석 플러그인에 대한 자세한 내용은 https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap 에서 확인할 수 있습니다.
그림 3. Fiji 소프트웨어의 셀 카운터 플러그인을 사용하여 mCFU를 계산하는 수동 방법입니다. 파란색 점은 사용자가 이미 클릭한 콜로니를 나타냅니다. 오른쪽 메뉴에는 지금까지 계산된 식민지 수가 표시됩니다(개수는 41개). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. Fiji 소프트웨어를 사용하여 mCFU를 계산하는 자동화된 방법입니다. (ᄀ, ᄂ) 콜로니가 있는 관심 영역은 타원형 선택 도구를 사용하여 선택되고 외부 영역은 clear outside 명령을 사용하여 제거됩니다. (씨, 디) 콜로니의 흑백 이미지는 임계값 도구를 사용하여 생성됩니다. (E, F) 콜로니의 수는 입자 분석 도구를 사용하여 정량화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
여기에 설명된 mCFU 분석은 단일 페트리 접시에서 검색할 수 있는 정보의 양을 최소 96배로 증가시킵니다. 그림 5는 결핵 치료를 위한 숙주 지향 약물로서 사퀴나비르(SQV)31,32의 용도 변경에 대한 두 가지 약물 전달 방법의 비교를 보여줍니다. 이 분석에서는 Mycobacterium tuberculosis의 4가지 다른 균주를 사용하여 1차 인간 대식세포를 감염시켰습니다. 결핵(M. tuberculosis) H37Rv 실험실 균주 및 포르투갈 국립 보건원의 Dr. Ricardo Jorge(INSA)가 활동성 결핵 환자로부터 분리한 3가지 임상 균주: 약물 감수성 균주(INSA 코드 33427), 다제내성(MDR) 균주(INSA 코드 34192) 및 광범위 약물 내성(XDR) 균주(INSA 코드 163761). 각 균주에 의한 각 감염은 8개의 상이한 치료 조건으로 더 증식되어, 3개의 상이한 농도의 유리-약물 또는 리포좀-로딩 약물을 각각의 비처리된 대조군과 비교하였다. 마지막으로, 각 질환은 감염 후 4개의 서로 다른 시점에서 분석되었습니다. 세포 내 박테리아 성장을 정량화하기 위해 각 시점에서 추출된 용해물의 총량은 32였습니다. 그 후 각 용해물에 3개의 연속 희석을 하여 샘플 수를 128개로 늘렸습니다. 4개의 시점을 곱하면 512개 샘플의 분석 결과가 분석됩니다. 적어도 세 명의 다른 헌혈자의 대식세포를 사용하여 실험을 반복했기 때문에 분석된 샘플의 총 수는 1536개로 증가했습니다. 여기에 설명된 mCFU 방법을 사용하여 이 실험은 표준 CFU 프로토콜을 사용하여 필요한 1536개의 정사각형 페트리 접시에 비해 16개의 정사각형 페트리 접시만 설명했습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 이 방법으로 얻은 결과는 처리 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타낼 수 있습니다.
그림 5. mCFU 분석법은 적은 수의 한천 플레이트에서 많은 양의 데이터를 생성할 수 있습니다. 이 일련의 실험은 인간 대식세포에서 M.tb 실험실 및 임상 균주의 세포 내 사멸을 유도하는 약물 사퀴나비르(SQV)의 효능을 테스트했습니다. SQV를 자유 형태로 대식세포 배양에 투여하거나 리포좀(LipSQV)에 로드했습니다. 처리는 50, 20 및 10μg/mL의 세 가지 농도로 수행되었습니다. 대식세포를 3시간 동안 상이한 M.tb 균주에 감염시킨 후 선택된 농도의 LipSQV 및 유리 SQV로 처리하였다. 약물이 없는 리포좀(LipUnloaded)과 DMSO를 대조군으로 사용했습니다. 박테리아의 세포 내 생존을 평가하기 위해, 이산적인 시점에서, 대식세포를 용해시키고, 박테리아 현탁액의 연속 희석액을 7H10 한천 플레이트에 도말하였다. mCFU 단위는 2-3주 후에 계산되었습니다. 선은 최소 3개의 독립적인 실험에서 샘플당 평균 mCFU를 나타냅니다. 막대는 감염 후 7일째에 각 대조군과 관련하여 계산된 평균 mCFU 백분율을 나타냅니다. 기호는 다른 기증자의 대식세포를 사용한 각 실험을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용한 후 Holm-Sidak 사후 검정을 사용하여 다중 그룹 비교를 수행했습니다. * 피 ≤0.05, ** 피 ≤0.01, *** 피 ≤0.001. 이 수치는33에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
결핵은 특히 저소득 및 중간 소득 국가에서 그 중요성이 커지고 있는 중요한 공중 보건 문제입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 결핵을 진단하고 치료하기 위한 의료 환경의 붕괴는 신규 사례 발생률에 부정적인 영향을 미쳤습니다1. 또한, 이 전염병을 통제하기 위해서는 다제내성 및 광범위한 약물 내성 M.tb 균주, M.tb와 HIV의 동시 감염이 시급히 해결되어야 한다 1,34. BCG를 대체하거나 개선할 수 있는 새로운 백신이 현재 임상시험 중이며, 향후35년 안에 새로운 후보물질이 시장에 출시될 수 있다. 결핵에 대한 새로운 백신 후보 물질의 개발은 다양한 동물 모델을 사용한 전임상 연구에 의존합니다. 동물 모델에서 백신 효능을 결정하기 위해서는 백신의 보호 효과를 입증하기 위해 감염된 장기의 박테리아 부담 정량화가 필요합니다 5,36. 현재 감염된 마우스와 인간이 아닌 영장류의 박테리아 부담을 정량화하는 직간접적인 방법이 있습니다. 직접적인 방법에는 형광 auramine-o 및Ziehl-Neelsen 37을 사용한 조직학적 준비 및 박테리아 염색, RT-qPCR38을 기반으로 한 샘플의 마이코박테리아 부하 정량 등이 포함됩니다.
마이코박테리아 성장 억제 분석(MGIA)은 BACTEC MGIT 시스템을 기반으로 하는 시험관 내 분석법이며 백신을 접종한 동물과 백신을 접종하지 않은 동물의 살아있는 마이코박테리아 부담을 정량화하는 데 사용되는 민감한 방법입니다. 이 시스템은 특별히 설계된 시험관에서 마이코박테리아 의 존재를 테스트할 수 있는 완전 자동화된 기기입니다. 바이알에는 샘플의 산소 농도에 반응하는 형광 리포터가 포함되어 있습니다. 형광은 소비되는 산소의 양에 비례하며, 매 시간39 샘플에 존재하는 살아있는 박테리아의 수를 나타냅니다. MGIA 방법에서는 PBMC 및 자가 혈청 샘플을 동물에서 수집하여 96시간 동안 마이코박테리아와 공동 배양합니다. 그런 다음 부착 단핵구를 용해하여 세포 내 마이코박테리아를 방출합니다. 이 시스템은 산소 소비량(40)을 측정하여 간접적으로 박테리아 부담을 정량화할 것이다. 이 방법은 전형적으로 약물 내성 연구에 사용되지만, 최근에는 결핵 백신 효능 평가(40)에 적용되고 있다.
이러한 방법은 표준 CFU로 보완하여 생존 가능한 마이코박테리아의 총 수를 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 쥐 에어로졸 M.tb 챌린지 실험에서 백신 후보의 평가는 CFU11에 의해 조직에서 얻은 콜로니를 열거함으로써 달성됩니다.
여기에 설명된 mCFU 분석법은 사용되는 시약과 필요한 실험실 공간 측면에서 더 빠르고 저렴하기 때문에 기존 CFU 방법에 비해 크게 개선될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 단일 실험에서 많은 샘플 세트를 동시에 비교할 수 있으므로 분석 간 변동의 영향을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 그림 5에 설명된 실험에서 볼 수 있듯이 16개의 정사각형 페트리 접시에서 mCFU 방법을 사용하여 1536개의 샘플에 대해 CFU를 측정했으며, 이는 사용된 플레이트 수가 96배 감소했음을 나타냅니다. 이는 가용성이 문제가 될 수 있는 1차 생물학적 및 임상 샘플을 사용하는 실험과 더 관련이 있습니다. 콜로니가 한천 플레이트에 표시되는 컴팩트한 형태는 특수 또는 일반적인 이미지 기록 장비를 편리하게 사용할 수 있도록 합니다. 이는 Fiji 소프트웨어를 사용하여 여기에 설명된 것과 같은 자동 콜로니 계수 방법과 결합되어 CFU를 식별하고 정량화하는 사용자의 능력에 대한 의존도를 줄이는 데 도움이 됩니다. 그렇다 하더라도, 표준 CFU 기법과 마찬가지로, 이 방법은 병합된 콜로니를 구별할 수 없기 때문에 CFU가 과소 대표될 가능성이 있습니다. 그러나 정량화를 수행하기 위해 더 높은 희석액을 선택하거나 과잉 증식으로 인해 콜로니 병합이 발생하기 전에 현미경으로 콜로니를 계수하여 이를 최소화할 수 있습니다. 이는 샘플이 이질적인 성장률을 가진 콜로니를 생성하는 경우 더 관련이 있습니다. 연구자는 이러한 경우 특정 실험 조건에 대해 mCFU 구현을 검증해야 합니다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 다음과 같습니다: 연속 희석은 96웰 플레이트를 사용하여 수행되어야 하며 희석액은 완전히 혼합되어야 합니다. 미세 방울 도금은 0.5-10 μL 멀티 채널 피펫으로 수행하여 배지를 만지거나 손상시키지 않고 5 웰 플레이트의 각 행에서 단단한 중간 사각형 플레이트로 96 μL를 전달해야합니다. 마이크로 콜로니 계수는 배양 6-10일 사이에 수행해야 합니다. 그러나 계산 시 식민지가 과도하게 크거나 너무 작지 않도록 주의해야 합니다.
이 기술의 수정 및 문제 해결에는 다양한 박테리아 균주의 활용이 포함됩니다. 따라서 각 균주에 대해 최적의 성장 배지를 사용해야 합니다. 이 기술의 한계는 기존 CFU 방법의 한계와 동일하며, 여기에는 낮은 희석액에서 박테리아를 열거하는 어려움이 포함됩니다. 또한 이 방법의 특정 제한 사항에는 콜로니를 열거하기 위해 현미경을 사용해야 한다는 것이 포함됩니다.
마지막으로, 이 방법은 결핵 예방 접종 연구에서 박테리아 부담을 정량화하고 약물 내성/감수성 연구 및 숙주-병원체 상호 작용 연구에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 5 는 인간 대식세포에서 임상 균주, 다양한 약물 제형으로 처리된 다중 약물 내성 및 광범위한 약물 내성 균주를 포함한 M.tb 균주의 세포 내 사멸 측정을 위한 mCFU의 적용을 보여줍니다. 중요한 것은 이 방법은 각 유기체의 배양 조건이 충족되는 경우 모든 미생물에도 적용할 수 있다는 것입니다.
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Disclosures
DP와 PJGB는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 및 EXPL/SAU-INF/0742/2021 보조금에 따라 Universidade Católica Portuguesa 의과대학의 내부 자금과 Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)의 외부 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 - 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
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