Summary
Bestemmelse av kolonidannende enheter (CFU) er gullstandardteknikken for å kvantifisere bakterier, inkludert Mycobacterium tuberculosis som kan ta uker å danne synlige kolonier. Her beskriver vi en mikro-CFU for CFU-bestemmelse med økt tidseffektivitet, redusert laboratorieplass og reagenskostnader, og skalerbarhet til middels og høy gjennomstrømningseksperimenter.
Abstract
Tuberkulose (TB), den ledende dødsårsaken over hele verden av et smittsomt agens, drepte 1,6 millioner mennesker i 2022, og ble bare overgått av Covid-19 under pandemien 2019-2021. Sykdommen forårsakes av bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Mycobacterium bovis-stammen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), den eneste TB-vaksinen, er den eldste lisensierte vaksinen i verden, fortsatt i bruk. For tiden er det 12 vaksiner i kliniske studier og dusinvis av vaksiner under preklinisk utvikling. Den valgte metoden som brukes til å vurdere effekten av TB-vaksiner i prekliniske studier, er oppregningen av bakteriekolonier ved CFU-analysen (kolonidannende enheter). Denne tidkrevende analysen tar 4 til 6 uker å konkludere, krever betydelig laboratorie- og inkubatorplass, har høye reagenskostnader og er utsatt for forurensning. Her beskriver vi en optimalisert metode for kolonioppregning, mikro-CFU (mCFU), som tilbyr en enkel og rask løsning for å analysere M.tb-vaksineeffektresultater . mCFU-analysen krever ti ganger færre reagenser, reduserer inkubasjonsperioden tre ganger, tar 1 til 2 uker å konkludere, reduserer laboratorieplass og reagenskostnader, og minimerer helse- og sikkerhetsrisikoen forbundet med å jobbe med et stort antall M.tb. Videre, for å evaluere effekten av en TB-vaksine, kan prøver fås fra en rekke kilder, inkludert vev fra vaksinerte dyr infisert med mykobakterier. Vi beskriver også en optimalisert metode for å produsere en encellet, ensartet mykobakteriekultur av høy kvalitet for infeksjonsstudier. Til slutt foreslår vi at disse metodene skal være universelt vedtatt for prekliniske studier av vaksineeffektbestemmelse, noe som til slutt fører til tidsreduksjon i utviklingen av vaksiner mot TB.
Introduction
Tuberkulose (TB) er den ledende dødsårsaken over hele verden av et enkelt smittsomt middel, bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb), som dreper flere mennesker enn noe annet patogen. I 2021 var tuberkulose ansvarlig for 1,6 millioner dødsfall og ble forbigått av COVID-19 under pandemien 2019-20211. Dessuten, ifølge Verdens helseorganisasjons globale TB-rapport fra 2022, var COVID-19-pandemien ansvarlig for en økning i nye TB-tilfeller. WHO rapporterer også store dråper i antall personer diagnostisert med TB i denne perioden, noe som kan øke ytterligere antall TB-tilfeller1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er en levende-svekket stamme av den patogene Mycobacterium bovis, brukt for første gang som en vaksine for mer enn 100 år siden. Dette er den eneste vaksinen mot tuberkulose og er den eldste lisensierte vaksinen i verden som fortsatt er i bruk 2,3. For tiden er det 12 vaksiner i ulike faser av kliniske studier4, og dusinvis av vaksiner er under preklinisk utvikling 5,6. Preklinisk vurdering av vaksiner mot tuberkulose inkluderer evaluering av sikkerhet og immunogenitet7, som kan fås i ulike dyremodeller som sebrafisk, mus, marsvin, kaniner, storfe og ikke-menneskelige primater 8,9,10. I tillegg krever vurdering av en vaksines kapasitet til å indusere beskyttelse mot M.tb-infeksjon og / eller overføring, dvs. vaksineeffektiviteten, en M.tb-utfordring in vivo 5,11. Interessant nok induserer BCG-vaksinasjon ikke-spesifikke effekter som påvirker overlevelsen av andre bakterielle og virale patogener12,13 gjennom mekanismen for trent immunitet14. For å kvantifisere den levedyktige bakteriebyrden i et infisert dyr, er den valgte metoden oppregningen av bakteriekoloniergjennom CFU-analysen (kolonidannende enheter) 5,15. CFU er en enhet som estimerer antall mikroorganismer (bakterier eller sopp) som danner kolonier under spesifikke vekstforhold. CFU stammer fra levedyktige og replikerende mikroorganismer, og det absolutte antall levende mikroorganismer i hver koloni er vanskelig å anslå. Det er usikkert om en koloni har sitt utspring fra en eller flere mikroorganismer. CFU-enheten reflekterer denne usikkerheten, og det kan derfor observeres stor variasjon i replikater av samme utvalg. Denne tidkrevende analysen krever spesialiserte teknikere opplært til å jobbe i et biosikkerhetsnivå 3 (BSL3) anlegg, betydelig laboratorie- og inkubatorplass, tar fra 4 til 6 uker å konkludere, og er utsatt for forurensning.
I denne studien beskriver vi en optimalisert metode for kolonioppregning, mikro-CFU (mCFU), og tilbyr en enkel og rask løsning for å analysere resultatene 15,16,17,18,19,20. mCFU-analysen krever ti ganger færre reagenser, reduserer inkubasjonsperioden tre ganger, tar 1 til 2 uker å konkludere, reduserer laboratorieplass og reagenskostnader, og minimerer helse- og sikkerhetsrisikoen forbundet med å jobbe med et stort antall M.tb. Vi foreslår at denne metoden skal være universelt vedtatt for prekliniske studier av vaksineeffektbestemmelse, noe som til slutt fører til tidsreduksjon i utviklingen av vaksiner mot TB. Endelig har denne optimaliserte metoden for CFU-oppregning blitt brukt til å kvantifisere ikke bare mykobakterier, men også andre bakterier, som Escherichia coli og Ralstonia solanacearum21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen beskrevet her er for BCG, men kan brukes på alle mykobakterier. BCG kan brukes som surrogatbakterie for tuberkuloseforsøk når BSL3-fasiliteter ikke er tilgjengelige22. Følgende prosedyrer ved bruk av BCG bør utføres under et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) laboratorium og følge passende retningslinjer for biosikkerhet og god laboratoriepraksis for manipulering av mikroorganismer i faregruppe 2.
1. Kultur media forberedelse
- Forbered Middlebrook 7H9 buljong supplert med 10% (v / v) oljesyre, albumin, dextrose og katalase (OADC) anrikning, i henhold til leverandørens instruksjoner. Tilsett buljongen med 0,05 % (v/v) tyloksapol.
MERK: Tyloxapol er en ikke-ionisk flytende polymer som har blitt brukt som et overflateaktivt middel for å forhindre bakteriell klumpdannelse16. - Forbered Middlebrook 7H10 fast medium supplert med 10% (v / v) OADC-anrikning i henhold til leverandørens instruksjoner.
- Fordel 40 ml medium per kvadrat petriskål (120 mm x 120 mm). La platene tørke for å minimere kondens på overflaten av agar.
MERK: Denne spesifikke størrelsen på petriskålen er grunnleggende for å tillate direkte transponering av minst 96 dråper fra en 96-brønnsplate. Effektiv tørking av platene vil senere lette plating av små dråper bakteriell suspensjon og forhindre at dråpene sprer seg. - Forbered enten Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) eller Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) for å produsere infeksjonsmediet. I begge tilfeller, suppler mediet med 10% føtal kalveserum, 1% L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat. Ikke legg penicillin og streptomycin til mediet.
2. Forberedelse av prøve
- Få prøver fra en rekke kilder. Vanligvis, for å kvantifisere CFU for å evaluere effekten av en TB-vaksine, skaffe prøver fra vaksinert og uvaccinert animalsk vev. For eksempel vasker musens lunge og milt11 eller makaklunge, thorax og perifere lymfeknuter, milt, lever, hud, blod, benmarg og bronkoalveolær skylling23. Alternativt kan du ta prøver fra in vitro-kulturer av makrofager/dendrittiske celler/nøytrofile infisert med BCG 18,19,20,24,25,26.
3. Produksjon av BCG-kultur
MERK: For in vivo-studier av TB-vaksiner er målet å forbedre effekten av BCG. Derfor brukes BCG-vaksinerte grupper vanligvis som kontroll. BCG-stammer som brukes til humant vaksinasjon er ideelle for testing i dyremodeller. I dette tilfellet må en kultur av BCG rekonstitueres i henhold til leverandørens instruksjoner27. Imidlertid kan en BCG-kultur for in vivo-studier også produseres internt11. Produksjonen av encellet, ensartet BCG-kultur av høy kvalitet for in vitro-infeksjonsprotokoller har blitt produsert med stor suksess i flere studier 11,16,18,19,20,26,28,29, ved hjelp av følgende protokoll, som også kan brukes til dyreutfordringsstudier.
- Dyrkning 50 ml BCG i 7H9 buljong, ved 37 °C, med omrøring ved 200 o / min. Varier volumet i henhold til eksperimentets behov.
- Hver dag, i 8-10 dager, samle 100 μL av kulturen og fortynn den ved å tilsette 900 μL PBS i en 1 ml kuvette. Fortsett deretter ved å måle den optiske tettheten av bakterier (OD ved λ = 600 nm; OD600) i et spektrofotometer. Tegn en vekstkurve fra disse verdiene. Identifiser midtloggfasen av kulturen (når OD dobler konsekvent per tidsenhet).
- Forbered en påfølgende kultur og inkuber til du når den midterste/sene tømmervekstfasen som i trinn 3.1 og 3.2. Bruk verdiene som ble oppnådd i forrige trinn, som veiledning. Sørg for at kulturen ikke når den stasjonære vekstfasen (når OD begynner å stabilisere seg) for å opprettholde en god kvalitetskultur av levedyktige bakterier.
- Samle kulturen i midt/sen tømmervekstfase. Sentrifuge ved 3000 x g i 10 min. Fjern supernatanten.
- Tilsett 10 ml PBS for å vaske bakteriene. Sentrifuge ved 3000 x g i 10 min. Fjern supernatanten.
- Resuspender bakteriene med 5 ml infeksjonsmedier. Plasser røret i et ultralydbad i 15 minutter, full effekt ved 80 Hz.
- Sentrifuge ved 1000 x g i 10 min. Samle supernatanten unngå pelleten, da den er rik på bakterieklumper som bør unngås i en BCG-kultur av høy kvalitet, og kast den.
- Mål OD for supernatanten. Her er kulturer i eksponentiell vekstfase, med en OD600 på 0,1, ekvivalent med 1 x 107 CFU / ml.
MERK: Hvert laboratorium bør produsere sine egne BCG-vekstkurver før de starter eksperimenter for å etablere en lineær regresjon mellom OD600 og CFU ved hjelp av spektrofotometeret. Vær oppmerksom på at spektrofotometre har forskjellige lysbaneavstander, som kan variere avlesningene som er oppnådd for samme prøve. - Utfør enkle beregninger for å fastslå antall bakterier som skal legges til hver vertscellekultur. Antall bakterier per vertscelle er Multiplicity of Infection (MOI). Bruk en MOI på 10 bakterier per vertscelle, som er den vanligste MOI som brukes til BCG-infeksjonseksperimenter.
4. Analyse av mikrokolonidannende enhet
MERK: Etter at et in vivo eller in vitro infeksjonseksperiment er fullført, kan tellingen av bakterier utføres av mCFU. For in vivo-studier må prøvene først homogeniseres i en perlevisper eller en annen vevshomogenisator. For in vitro-kulturer av makrofager/dendrittiske celler/nøytrofile infiserte med BCG, må prøvene lyseres med et ikke-ionisk vaskemiddel (f.eks. 0,05 % oppløsning av ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel).
- Serielle fortynninger ved bruk av en 96-brønnsplate: Utfør serielle 10 ganger fortynninger av lysatene, i en steril 96-brønnsplate i henhold til skjemaet i figur 1A. Fordel lysatene på rad A og E. For hver plate er maksimalt antall prøver og/eller replikater 24.
- Tilsett 180 μL dH2O til de gjenværende brønnene for å utføre seriell fortynning.
- Bruk en 12-kanals pipette til å resuspendere lysatene i rad A og overfør 20 μL til rad B (20 μL lysat + 180 μL dH2O). Homogeniser godt. Gjenta dette trinnet sekvensielt for rad B og C til du når den siste fortynningen i rad D.
MERK: Vi utfører vanligvis tre fortynninger (100, 101, 102, 103), og bruker dermed 4 rader av platen (A-D eller E-H) for hvert sett med 12 prøver og / eller replikerer. - Mikrodråpebelegg: Bruk en 0,5-10 μL (tynne spisser foretrekkes) flerkanals pipette for å overføre 5 μL fra hver rad av 96-brønnsplaten til den faste middels firkantede platen, i henhold til figur 1B.
- Mens du sakte pipetterer de 5 μL dråpene, la dem berøre agar litt. Dette vil bidra til å ta av dråpen fra spissen mot agar og redusere muligheten for oppbevaring av væsken inne i spissen.
- La dråpene tørke, lukk agarplaten og inkuber den ved 37 °C mens bakterieveksten overvåkes. Eventuelt inkuber agarplatene i en forseglet plastpose for å forhindre at platene tørker.
- Mikrokolonitelling: Etter ca. 6-10 dagers inkubasjon, sjekk for individuelle kolonier, synlige for det blotte øye (figur 2).
- Tell koloniene ved hjelp av det laveste forstørrelsesmålet (4x eller lavere) av et invertert optisk mikroskop eller forstørrelsesglass. Tellinger bør utføres i fortynninger der antall kolonier er lavere enn 300 og høyere enn 30. Alternativt kan du bruke et kamera til å ta et bilde av dråpen for å telle kolonier manuelt på datamaskinen eller bruke programvare som ImageJ for å automatisere kolonitelling.
- For å uttrykke cellenumre i CFU / ml, bruk følgende formel:
Hvor C = antall kolonier telt, V = volum belagt i μL, og Dil = fortynning der koloniene ble talt (100, 101, 102, 103). For eksempel, hvis 30 kolonier ble talt i en 5 μL dråpe i fortynning 102, så:
Figur 1. Skjematisk fremstilling av mCFU-protokollen. (A) Serielle 10 ganger fortynninger av BCG-holdige lysater i en 96-brønnsplate. (B) Firkantet petriskål som inneholder fast dyrkningsmedium og overlagt med 96 dråper på 5 μL hver. Dråper pipetteres direkte fra 96-brønnplaten ved hjelp av en flerkanalspipett. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Mikrokolonidannende enheter av BCG etter 10 dagers inkubasjon. Til venstre, et bilde av en firkantet petriskål overlagt med 96 dråper på 5 μL hver, som tidligere representert i figur 1B. Til høyre svarer individuelle bilder av 3 dråper til et originalt lysat (100) og to fortynninger (101, 102). Bildene ble tatt med et DSRL-kamera utstyrt med et 18-55 mm zoomobjektiv (plate) eller et 105 mm makroobjektiv (dråper). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Mikrokolonidannende enhetstelling på Fiji (ImageJ)
MERK: mCFU-metoden tillater CFU-kvantifisering av store sett med prøver. Bilder av dråpene kan registreres for etterfølgende analyse for å lette kolonitelling. Flere fotografiske enheter kan produsere bilder med tilstrekkelig kvalitet til dette formålet. Disse inkluderer digitale kameraer, webkameraer, kameramonterte mikroskoper og forstørrelsesbriller og mobiltelefoner. Gratis bildeanalyseprogramvare som ImageJ tilbyr muligheten for manuell eller automatisert kolonitelling i disse bildene. For å demonstrere begge metodene vil Fiji bli brukt, som er en distribusjon av ImageJ som pakker flere verktøy for vitenskapelig bildeanalyse30. Fiji kan lastes ned fra https://fiji.sc/.
- Manuell tellemetode
- Åpne bildet som inneholder mCFU på Fiji. Velg plugins > analyser > celleteller.
- Velg Initialiser på celletellermenyen, og velg deretter en teller (for eksempel Type 1).
- Fortsett ved å klikke på hver koloni. Hvert klikk vises på bildet og telleren oppdateres (figur 3). Hvis du vil angre utilsiktede klikk, velger du Slett.
- Registrer verdien som vises på disken. Klikk på Tilbakestill-knappen for å tilbakestille tellingen og åpne et nytt bilde for å telle flere prøver.
MERK: Ytterligere instruksjoner om dette pluginet finner du på https://imagej.net/plugins/cell-counter.
- Automatisert tellemetode
- Åpne bildet som inneholder mCFU på Fiji. Velg Bilde > Skriv > 8-bit. Dette konverterer bildet til et 8-biters gråtonebilde.
- Velg det ovale verktøyet på verktøylinjen, og tegn en oval rundt området med koloniene (figur 4A). Den ovale kan justeres etter å ha blitt trukket.
- Velg Rediger > Fjern utenfor for å fjerne forstyrrelser fra uteområdet (figur 4B). Velg bilde > juster terskelen >.
- Flytt glidebryterne i terskelmenyen til koloniene vises i rødt og bakgrunnsstøyen er minimert (figur 4C).
- Velg Bruk og gå ut av terskelvinduet. Det genereres et svart-hvitt-bilde (figur 4D).
- Velg Analyser > analyser partikler. I vinduet analyser partikler angir du området for koloniareal (mellom 1 og uendelig, målt i kvadrerte piksler) og sirkularitet (mellom 0 og 1, hvor 1 er en perfekt sirkel; Figur 4E).
- Velg Disposisjoner i popup-menyen. Merk av for Vis resultater for detaljerte målinger for hver koloni i resultatvinduet. Merk av for Fjern resultater for å slette eventuelle tidligere målinger. Merk av for Oppsummer for å vise de oppsummerte resultatene av målingene (figur 4E).
- Start analysatoren ved å velge OK. Et nytt vindu vises, og viser alle de skisserte koloniene som ble oppdaget og talt. Resultatvinduet viser detaljene for hver koloni, og det oppsummerte resultatvinduet viser det totale antallet kolonier som er talt (figur 4F).
MERK: Innstillingene for størrelse og sirkularitet vil variere med bildets oppløsning og forstørrelse og kolonienes størrelse og form. Gjenta prosessen flere ganger til de beste innstillingene er funnet som oppdager alle kolonier. Ytterligere instruksjoner om analysepartikler plugin finner du på https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.
Figur 3. En manuell metode for å telle mCFU ved hjelp av celletellerpluggen på Fiji-programvaren. De blå prikkene indikerer kolonier som allerede er klikket på av brukeren. Menyen til høyre viser antall kolonier telt så langt (tallet er 41). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. En automatisert metode for å telle mCFU ved hjelp av Fiji-programvare. (A, B) Interesseområdet med koloniene velges ved hjelp av det ovale markeringsverktøyet, og uteområdet fjernes ved hjelp av kommandoen clear outside. (C, D) Et svart-hvitt-bilde av koloniene genereres ved hjelp av terskelverktøyet. (E, F) Antall kolonier kvantifiseres ved hjelp av analysepartikkelverktøyet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mCFU-analysen beskrevet her øker mengden informasjon som kan hentes fra en enkelt petriskål til minst 96 ganger. Figur 5 viser en sammenligning av to medikamentleveringsmetoder for gjenbruk av sakinavir (SQV)31,32 som vertsrettet legemiddel for behandling av tuberkulose. I denne analysen ble fire forskjellige stammer av Mycobacterium tuberculosis brukt til å infisere primære humane makrofager. M. tuberkulose H37Rv laboratoriestamme og tre kliniske stammer isolert fra pasienter med aktiv TB av det portugisiske nasjonale helseinstituttets Dr. Ricardo Jorge (INSA): en stofffølsom stamme (INSA-kode 33427), en multippel stoffresistent (MDR) stamme (INSA-kode 34192) og en omfattende stoffresistent (XDR) stamme (INSA-kode 163761). Hver infeksjon av hver stamme ble videre multiplisert i åtte forskjellige behandlingsbetingelser som sammenlignet tre forskjellige konsentrasjoner av fritt legemiddel eller liposombelastet legemiddel med de respektive ikke-behandlede kontrollene. Til slutt ble hver tilstand analysert på fire forskjellige tidspunkter etter infeksjon. For å kvantifisere intracellulær bakterievekst var den totale mengden lysater ekstrahert fra hvert tidspunkt 32. Dette ble etterfulgt av tre seriefortynninger til hvert lysat som økte antallet til 128 prøver. Multiplisert med de fire tidspunktene analyserte resultatene i 512 prøver. Siden forsøket ble gjentatt ved hjelp av makrofager fra minst tre forskjellige blodgivere, økte det totale antallet analyserte prøver til 1536. Ved å bruke mCFU-metoden beskrevet her, utgjorde dette eksperimentet bare 16 kvadratiske petriskåler mot 1536 som ville være nødvendig ved bruk av standard CFU-protokoll. Som vist i figur 5 kan resultatene oppnådd med denne metoden vise statistisk signifikante forskjeller mellom behandlingene.
Figur 5. mCFU-metoden kan produsere store mengder data fra et lite antall agarplater. Dette settet med eksperimenter testet effekten av stoffet sakinavir (SQV) for å indusere intracellulær drap av M.tb-laboratoriet og kliniske stammer i humane makrofager. SQV ble administrert til makrofagkulturene i fri form eller lastet i liposomer (LipSQV). Behandlingene ble utført i tre ulike konsentrasjoner: 50, 20 og 10 μg/ml. Makrofager ble infisert med forskjellige M.tb-stammer i 3 timer og deretter behandlet med utvalgte konsentrasjoner av LipSQV og fri SQV. Liposomer uten medikamentet (LipUnloaded) og DMSO ble brukt som kontrollpersoner. For å evaluere bakteriell intracellulær overlevelse ble makrofager lysert på diskrete tidspunkter, og seriefortynninger av bakteriesuspensjonen ble belagt på 7H10-agarplater. mCFU-enheter ble talt etter 2-3 uker. Linjer viser gjennomsnittlig mCFU per prøve fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Barer representerer gjennomsnittlig mCFU-prosentandel beregnet i forhold til de respektive kontrollene på dag 7 etter infeksjon. Symboler representerer hvert eksperiment med makrofager fra en annen donor. Feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. Flere gruppesammenligninger ble utført med enveis ANOVA etterfulgt av en Holm-Sidak post-hoc-test. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Dette tallet er endret fra33. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tuberkulose er et viktig folkehelseproblem med økende betydning, særlig i lav- og mellominntektsland. Forstyrrelsen av helsetjenester for å diagnostisere og behandle TB under COVID-19-pandemien forårsaket en negativ innvirkning på forekomsten av nye tilfeller1. I tillegg må de multi-stoff- og omfattende stoffresistente M.tb-stammene, og co-infeksjonen av M.tb og HIV snarest adresseres for å kontrollere denne epidemien 1,34. Nye vaksiner for å erstatte eller forbedre BCG er for tiden i kliniske studier, og nye kandidater kan komme på markedet i de kommende årene35. Utviklingen av nye vaksinekandidater mot tuberkulose er avhengig av prekliniske studier ved hjelp av ulike dyremodeller. Vaksineeffektbestemmelsen i dyremodeller krever kvantifisering av bakteriell byrde i de infiserte organene for å demonstrere den beskyttende effekten av vaksinen 5,36. For tiden er det direkte og indirekte metoder for å kvantifisere bakteriebyrden i infiserte mus og ikke-menneskelige primater. De direkte metodene inkluderer histologiske preparater og bakteriell farging ved bruk av fluorescerende auramin-o og Ziehl-Neelsen37, kvantifisering av mykobakteriell belastning i prøver basert på RT-qPCR38 og andre.
Mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) er en in vitro-analyse basert på BACTEC MGI-systemet og er en sensitiv metode som brukes til å kvantifisere levende mykobakteriell byrde hos vaksinerte og uvaksinerte dyr. Systemet er et helautomatisk instrument som kan teste for tilstedeværelse av mykobakterier i spesialdesignede reagensrør. Hetteglasset inneholder en fluorescerende reporter som reagerer på konsentrasjonen av oksygen i prøven. Fluorescensen er proporsjonal med mengden oksygen som forbrukes, noe som gir en indikasjon på antall levende bakterier som er tilstede i prøven, hver time39. I MGIA-metoden samles PBMC og autologe serumprøver fra dyr og dyrkes sammen med mykobakterier i 96 timer. Deretter lyseres adherente monocytter for å frigjøre intracellulære mykobakterier. Systemet vil kvantifisere bakteriebelastningen indirekte ved å måle oksygenforbruk40. Denne metoden brukes vanligvis til stoffresistensstudier, men har nylig blitt brukt til TB-vaksineeffektevalueringen40.
Disse metodene kan suppleres med standard CFU for å bestemme totalt antall levedyktige mykobakterier. For eksempel oppnås evalueringen av vaksinekandidater i et M.tb-utfordringseksperiment med murine aerosol ved å oppregne kolonier oppnådd fra vev ved CFU11.
mCFU-metoden beskrevet her kan være en betydelig forbedring i forhold til den klassiske CFU-metoden, da den er raskere å utføre og billig når det gjelder reagenser som brukes og når det gjelder laboratorieplass som kreves. Denne metoden tillater samtidig sammenligning av et stort sett med prøver i et enkelt eksperiment, og reduserer dermed effekten av analyse-til-analyse-variasjoner. For eksempel, som vist i forsøket beskrevet i figur 5, ble CFU bestemt for 1536 prøver ved bruk av mCFU-metoden i 16 kvadratiske petriskåler, noe som representerer en 96 ganger reduksjon i antall anvendte plater. Dette er mer relevant for forsøk med primære biologiske og kliniske prøver, der tilgjengeligheten kan være et problem. Den kompakte formen der koloniene vises på en agarplate, tillater praktisk bruk av spesialisert eller vanlig bildeopptaksutstyr. Dette, i kombinasjon med automatiserte kolonitellingsmetoder som den som er beskrevet her ved hjelp av Fiji-programvaren, bidrar til å redusere avhengigheten av brukerens evne til å identifisere og kvantifisere CFU. Likevel, som standard CFU-teknikken, lider denne metoden av manglende evne til å skille sammenslåtte kolonier som fører til en potensiell underrepresentasjon av CFU. Dette kan imidlertid minimeres ved å velge en høyere fortynning for å utføre kvantifiseringen eller ved å telle koloniene under mikroskopet før gjengroingen resulterer i kolonisammenslåing. Dette er mer relevant hvis prøven produserer kolonier med heterogene vekstrater. Forskere bør validere mCFU-implementering for deres spesifikke eksperimentelle forhold i disse tilfellene.
De kritiske trinnene i protokollen er følgende punkter: De serielle fortynningene som er gjort, skal utføres ved hjelp av en 96-brønnsplate, og fortynningene må blandes grundig; mikrodråpebelegget skal utføres med en 0,5-10 μL flerkanals pipette for å overføre 5 μL fra hver rad av 96-brønnplaten til den faste medium firkantede platen uten å berøre og skade mediet; Mikrokolonitellingen må utføres mellom 6-10 dager med inkubasjon. På telletidspunktet må det imidlertid tas hensyn til at koloniene ikke er for store eller for små.
Modifikasjonene og feilsøking av teknikken inkluderer bruk av forskjellige bakteriestammer. Derfor, for hver stamme, bør det optimale vekstmediet brukes. Begrensningene i teknikken er identiske med begrensningene i den konvensjonelle CFU-metoden, som inkluderer vanskeligheten med å oppregne bakterier i lave fortynninger. I tillegg inkluderer spesifikke begrensninger av denne metoden nødvendigheten av å bruke et mikroskop for å oppregne koloniene.
Endelig kan denne metoden brukes til å kvantifisere bakteriebyrden i TB-vaksinasjonsstudier og for testresistens / følsomhetsstudier og vertspatogeninteraksjonsstudier. For eksempel viser figur 5 anvendelsen av mCFU for bestemmelse av intracellulær drap av M.tb-stammer , inkludert kliniske stammer, multiresistente og omfattende stoffresistente stammer behandlet med forskjellige legemiddelformuleringer, i humane makrofager. Det er viktig at denne metoden også kan brukes på enhver mikroorganisme, forutsatt at dyrkingsbetingelsene for hver organisme er oppfylt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DP og PJGB erklærer at studien ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av intern finansiering fra Det medisinske fakultet, Universidade Católica Portuguesa, og ekstern finansiering fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), under tilskuddene UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020, og EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 - 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
References
- World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O.
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D.
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J.
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
