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Medicine

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Abstract

La tuberculosis (TB), la principal causa de muerte en todo el mundo por un agente infeccioso, mató a 1,6 millones de personas en 2022, solo superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-2021. La enfermedad es causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), la única vacuna contra la tuberculosis, es la vacuna autorizada más antigua del mundo, todavía en uso. Actualmente, hay 12 vacunas en ensayos clínicos y docenas de vacunas en desarrollo preclínico. El método de elección utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis en estudios preclínicos es la enumeración de las colonias bacterianas mediante el ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC). Este ensayo, que requiere mucho tiempo, tarda entre 4 y 6 semanas en concluir, requiere un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tiene altos costes de reactivos y es propenso a la contaminación. Aquí describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), que ofrece una solución simple y rápida para analizar los resultados de eficacia de la vacuna M.tb . El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Además, para evaluar la eficacia de una vacuna contra la tuberculosis, se pueden obtener muestras de diversas fuentes, incluidos tejidos de animales vacunados infectados con micobacterias. También describimos un método optimizado para producir un cultivo de micobacterias unicelular, uniforme y de alta calidad para estudios de infección. Por último, proponemos que estos métodos se adopten universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis.

Introduction

La tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte en todo el mundo por un solo agente infeccioso, la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), que mata a más personas que cualquier otro patógeno. En 2021, la tuberculosis fue responsable de 1,6 millones de muertes y fue superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-20211. Además, según el informe mundial sobre la tuberculosis de 2022 de la Organización Mundial de la Salud, la pandemia de COVID-19 fue responsable de un aumento de los nuevos casos de tuberculosis. La OMS también informa de grandes descensos en el número de personas diagnosticadas con tuberculosis durante este período, lo que podría aumentar aún más el número de casos de tuberculosis1.

El Bacillus Calmette-Guérin (BCG) es una cepa viva atenuada de la patógena Mycobacterium bovis, utilizada por primera vez como vacuna hace más de 100 años. Esta es la única vacuna contra la tuberculosis y es la vacuna autorizada más antigua en el mundo que aún se utiliza 2,3. Actualmente, hay 12 vacunas en diferentes fases de ensayos clínicos4, y decenas de vacunas están en desarrollo preclínico 5,6. La evaluación preclínica de las vacunas contra la TB incluye la evaluación de la seguridad e inmunogenicidad7, que se puede obtener en diversos modelos animales como pez cebra, ratones, cobayas, conejos, bovinos y primates no humanos 8,9,10. Además, la evaluación de la capacidad de una vacuna para inducir protección contra la infección y/o transmisión por M.tb, es decir, la eficacia de la vacuna, requiere un desafío con M.tb in vivo 5,11. Curiosamente, la vacunación con BCG induce efectos inespecíficos que afectan la supervivencia de otros patógenos bacterianos y virales12,13 a través del mecanismo de inmunidad entrenada14. Para cuantificar la carga bacteriana viable en un animal infectado, el método de elección es la enumeración de colonias bacterianas a través del ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC) 5,15. La UFC es una unidad que estima el número de microorganismos (bacterias u hongos) que forman colonias en condiciones específicas de crecimiento. Las UFC se originan a partir de microorganismos viables y replicativos, y el número absoluto de microorganismos vivos dentro de cada colonia es difícil de estimar. No se sabe con certeza si una colonia se ha originado a partir de uno o más microorganismos. La unidad UFC refleja esta incertidumbre, por lo que se puede observar una gran variabilidad en las réplicas de una misma muestra. Este ensayo, que requiere mucho tiempo, requiere técnicos especializados capacitados para trabajar en una instalación de nivel de bioseguridad 3 (BSL3), un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tarda de 4 a 6 semanas en concluir y es propenso a la contaminación.

En este estudio, describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), y ofrecemos una solución simple y rápida para analizar los resultados 15,16,17,18,19,20. El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Proponemos que este método se adopte universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis. Finalmente, este método optimizado de enumeración de UFC se ha utilizado para cuantificar no solo micobacterias sino también otras bacterias, como Escherichia coli y Ralstonia solanacearum21.

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Protocol

NOTA: El protocolo descrito aquí es para BCG, pero se puede aplicar a cualquier micobacteria. La BCG puede utilizarse como bacteria sustituta para experimentos de tuberculosis cuando no se dispone de instalaciones BSL322. Los siguientes procedimientos con BCG deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) y seguir las directrices de bioseguridad y las buenas prácticas de laboratorio adecuadas para la manipulación de microorganismos del grupo de riesgo 2.

1. Preparación de los medios de cultivo

  1. Prepare el caldo Middlebrook 7H9 suplementado con enriquecimiento de ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa (OADC) al 10% (v/v), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Complementar el caldo con 0,05% (v/v) de tyloxapol.
    NOTA: Tyloxapol es un polímero líquido no iónico que se ha utilizado como tensioactivo para prevenir la formación de grumos bacterianos16.
  2. Prepare el medio sólido Middlebrook 7H10 suplementado con un enriquecimiento de OADC al 10% (v/v) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
  3. Distribuya 40 ml de medio por placa de Petri cuadrada (120 mm x 120 mm). Deje que las placas se sequen para minimizar la condensación en la superficie del agar.
    NOTA: Este tamaño específico de placa de Petri es fundamental para permitir la transposición directa de al menos 96 gotas de una placa de 96 pocillos. El secado efectivo de las placas facilitará posteriormente el recubrimiento de pequeñas gotas de suspensión bacteriana y evitará que las gotas se propaguen.
  4. Prepare el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) o el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) para producir el medio de infección. En cualquier caso, complemente el medio con un 10% de suero fetal de ternera, un 1% de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. No agregue penicilina ni estreptomicina al medio.

2. Preparación de la muestra

  1. Obtenga muestras de una variedad de fuentes. Por lo general, para cuantificar las UFC y evaluar la eficacia de una vacuna contra la tuberculosis, se adquieren muestras de tejidos animales vacunados y no vacunados. Por ejemplo, pulmón y bazo de ratón11 o pulmón de macaco, ganglios linfáticos torácicos y periféricos, bazo, hígado, piel, sangre, médula ósea y lavado broncoalveolar23. Alternativamente, obtener muestras de cultivos in vitro de macrófagos/células dendríticas/neutrófilos infectados con BCG 18,19,20,24,25,26.

3. Producción de cultivo de BCG

NOTA: En el caso de los estudios in vivo de vacunas contra la tuberculosis, el objetivo es mejorar la eficacia de la BCG. Por lo tanto, los grupos vacunados con BCG suelen utilizarse como control. Las cepas de BCG utilizadas para la vacunación humana son ideales para realizar pruebas en modelos animales. En este caso, se debe reconstituir un cultivo de BCG de acuerdo con las instrucciones del proveedor27. Sin embargo, también se puede producir internamente un cultivo de BCG para estudios in vivo 11. La producción de cultivos unicelulares, uniformes y de alta calidad de BCG para protocolos de infección in vitro se ha producido con mucho éxito en varios estudios 11,16,18,19,20,26,28,29, utilizando el siguiente protocolo, que también puede ser utilizado para estudios de desafío con animales.

  1. Cultivo 50 mL de BCG en caldo 7H9, a 37 °C, con agitación a 200 rpm. Varía el volumen según las necesidades del experimento.
  2. Todos los días, durante 8-10 días, recoja 100 μL del cultivo y dilúyalo agregando 900 μL de PBS en una cubeta de 1 mL. A continuación, proceda a medir la densidad óptica de las bacterias (OD a λ=600 nm; OD600) en un espectrofotómetro. Dibuje una curva de crecimiento a partir de esos valores. Identifique la fase logarítmica media del cultivo (cuando el DO se duplica constantemente por unidad de tiempo).
  3. Preparar un cultivo posterior e incubar hasta llegar a la fase media/tardía de crecimiento de los troncos como en los pasos 3.1 y 3.2. Utilice los valores obtenidos en el paso anterior como guía. Asegúrese de que el cultivo no llegue a la fase de crecimiento estacionario (cuando la OD comienza a estabilizarse) para mantener un cultivo de bacterias viables de buena calidad.
  4. Recoja el cultivo en la fase de crecimiento del tronco medio/tardío. Centrifugar a 3000 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante.
  5. Agregue 10 ml de PBS para lavar las bacterias. Centrifugar a 3000 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante.
  6. Vuelva a suspender las bacterias con 5 ml de medio infeccioso. Coloque el tubo en un baño de ultrasonido durante 15 minutos, a máxima potencia a 80 Hz.
  7. Centrifugar a 1000 x g durante 10 min. Recoja el sobrenadante evitando el gránulo ya que es rico en grumos bacterianos que deben evitarse en un cultivo de BCG de alta calidad y deséchelo.
  8. Mida el diámetro exterior del sobrenadante. Aquí, los cultivos en la fase de crecimiento exponencial, con un DO600 de 0,1, equivalen a 1 x 107 UFC/mL.
    NOTA: Cada laboratorio debe producir sus propias curvas de crecimiento de BCG antes de comenzar los experimentos para establecer una regresión lineal entre OD600 y UFC utilizando el espectrofotómetro. Tenga en cuenta que los espectrofotómetros tienen diferentes distancias de trayectoria de luz, lo que puede variar las lecturas obtenidas para la misma muestra.
  9. Realice cálculos sencillos para establecer el número de bacterias que se añadirán a cada cultivo de células huésped. El número de bacterias por célula huésped es la Multiplicidad de Infección (MOI). Utilice un MOI de 10 bacterias por célula huésped, que es el MOI más común utilizado para los experimentos de infección por BCG.

4. Ensayo de la unidad formadora de microcolonias

NOTA: Después de completar un experimento de infección in vivo o in vitro , la enumeración de bacterias se puede realizar mediante mCFU. Para los estudios in vivo , las muestras deben homogeneizarse primero en un batidor de perlas u otro homogeneizador de tejidos. Para cultivos in vitro de macrófagos/células dendríticas/neutrófilos infectados con BCG, las muestras deben lisarse utilizando un detergente no iónico (por ejemplo, una solución al 0,05% de detergente no iónico y no desnaturalizante).

  1. Diluciones seriadas utilizando una placa de 96 pocillos: realizar diluciones seriadas de 10 veces de los lisados, en una placa estéril de 96 pocillos de acuerdo con el esquema de la Figura 1A. Distribuya los lisados en las filas A y E. Para cada placa, el número máximo de muestras y/o réplicas es de 24.
  2. Agregue 180 μL de dH2O a los pocillos restantes para realizar la dilución en serie.
  3. Con una pipeta de 12 canales, vuelva a suspender los lisados en la fila A y transfiera 20 μL a la fila B (20 μL lisado + 180 μL dH2O). Homogeneizar bien. Repita secuencialmente este paso para las filas B y C hasta llegar a la última dilución en la fila D.
    NOTA: Solemos realizar tres diluciones (100, 101, 102, 103), utilizando así 4 filas de la placa (A-D o E-H) para cada conjunto de 12 muestras y/o réplicas.
  4. Micro recubrimiento de gotas: utilice una pipeta multicanal de 0,5-10 μL (se prefieren puntas finas) para transferir 5 μL de cada fila de la placa de 96 pocillos a la placa cuadrada mediana sólida, de acuerdo con la Figura 1B.
  5. Mientras pipetea lentamente las gotas de 5 μL, deje que toquen ligeramente el agar. Esto ayudará a despegar la gota de la punta hacia el agar y reducirá la posibilidad de retención del líquido dentro de la punta.
  6. Deje que las gotas se sequen, cierre la placa de agar e incube a 37 °C mientras controla el crecimiento bacteriano. Opcionalmente, incube las placas de agar en una bolsa de plástico sellada para evitar que las placas se sequen.
  7. Recuento de microcolonias: después de aproximadamente 6-10 días de incubación, comprobar si hay colonias individuales, visibles a simple vista (Figura 2).
  8. Cuente las colonias utilizando el objetivo de aumento más bajo (4x o menos) de un microscopio óptico invertido o una lupa. Los recuentos deben realizarse en las diluciones donde el número de colonias sea inferior a 300 y superior a 30. Alternativamente, use una cámara para tomar una foto de la gota para contar manualmente las colonias en la computadora o use un software como ImageJ para automatizar el conteo de colonias.
  9. Para expresar el número de celdas en UFC/ml, utilice la siguiente ecuación:
    Equation 1
    Donde C = número de colonias contadas, V = volumen sembrado en μL y Dil = dilución donde se contaron las colonias (100, 101, 102, 103). Por ejemplo, si se contaron 30 colonias en una gota de 5 μL en la dilución 102, entonces:
    Equation 2

Figure 1
Figura 1. Representación esquemática del protocolo mCFU. (A) Diluciones seriadas de 10 veces de los lisados que contienen BCG en una placa de 96 pocillos. (B) Placa de Petri cuadrada que contiene medio de cultivo sólido y recubierta por 96 gotas de 5 μL cada una. Las gotas se pipetean directamente desde la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Unidades formadoras de microcolonias de BCG después de 10 días de incubación. A la izquierda, una foto de una placa de Petri cuadrada superpuesta por 96 gotas de 5 μL cada una, como se representó anteriormente en la Figura 1B. A la derecha, fotos individuales de 3 gotas corresponden a un lisado original (100) y dos diluciones (101, 102). Las fotos se tomaron con una cámara DSRL equipada con una lente de zoom de 18-55 mm (placa) o una lente macro de 105 mm (gotas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Recuento de unidades formadoras de microcolonias en Fiji (ImagenJ)

NOTA: El método mCFU permite la cuantificación de UFC de grandes conjuntos de muestras. Se pueden registrar imágenes de las gotitas para su posterior análisis y facilitar el recuento de colonias. Varios dispositivos fotográficos pueden producir imágenes con la calidad suficiente para este propósito. Estos incluyen cámaras digitales, cámaras web, microscopios y lupas conectados a la cámara y teléfonos celulares. El software gratuito de análisis de imágenes, como ImageJ, ofrece la posibilidad de realizar un recuento manual o automatizado de colonias en esas imágenes. Para demostrar ambos métodos, se utilizará Fiji, que es una distribución de ImageJ que empaqueta varias herramientas para el análisis científico de imágenes30. Fiji se puede descargar desde https://fiji.sc/.

  1. Método de conteo manual
    1. Abra la imagen que contiene la mCFU en Fiji. Seleccione Plugins > analizar > contador de celdas.
    2. En el menú Contador de celdas, seleccione Inicializar y, a continuación, seleccione un contador (por ejemplo, Tipo 1).
    3. Proceda haciendo clic en cada colonia. Cada clic se mostrará en la imagen y actualizará el contador (Figura 3). Para deshacer clics accidentales, seleccione Eliminar.
    4. Registre el valor que se muestra en el contador. Haga clic en el botón Restablecer para restablecer el recuento y abrir una nueva imagen para contar muestras adicionales.
      NOTA: Puede encontrar más instrucciones sobre este complemento en https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Método de conteo automatizado
    1. Abra la imagen que contiene la mCFU en Fiji. Seleccione Imagen > Escriba > 8 bits. Esto convertirá la imagen en una imagen en escala de grises de 8 bits.
    2. Seleccione la herramienta Óvalo en la barra de herramientas y dibuje un óvalo alrededor del área con las colonias (Figura 4A). El óvalo se puede ajustar después de ser dibujado.
    3. Seleccione Editar > Borrar exterior para eliminar cualquier interferencia del área exterior (Figura 4B). Seleccione Imagen > ajuste > umbral.
    4. Mueva los controles deslizantes en el menú de umbral hasta que las colonias aparezcan en rojo y se minimice el ruido de fondo (Figura 4C).
    5. Seleccione Aplicar y salga de la ventana de umbral. Se genera una imagen en blanco y negro (Figura 4D).
    6. Seleccione Analizar > Analizar partículas. En la ventana analizar partículas, especifique el rango del área de colonia (entre 1 e infinito, medido en píxeles al cuadrado) y la circularidad (entre 0 y 1, donde 1 es un círculo perfecto; Figura 4E).
    7. Seleccione Contornos en el menú emergente Mostrar. Marque Mostrar resultados para obtener mediciones detalladas de cada colonia en la ventana de resultados. Marque Borrar resultados para borrar cualquier medición anterior. Marque la casilla Resumir para mostrar los resultados resumidos de las mediciones (Figura 4E).
    8. Inicie el analizador seleccionando Aceptar. Aparece una nueva ventana que muestra todas las colonias delineadas que se detectaron y contaron. La ventana de resultados muestra los detalles de cada colonia y la ventana de resultados resumidos muestra el total de colonias contadas (Figura 4F).
      NOTA: Los ajustes de tamaño y circularidad variarán según la resolución y el aumento de la imagen y el tamaño y la forma de las colonias. Repita el proceso varias veces hasta que se encuentren los mejores ajustes que detecten todas las colonias. Puede encontrar más instrucciones sobre el complemento de análisis de partículas en https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figure 3
Figura 3. Un método manual para contar mCFU utilizando el complemento de contador de celdas en el software Fiji. Los puntos azules indican colonias en las que el usuario ya ha hecho clic. El menú de la derecha muestra el número de colonias contadas hasta el momento (el recuento es 41). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Un método automatizado para contar mCFU utilizando el software Fiji. (A, B) La región de interés con las colonias se selecciona con la herramienta de selección ovalada y el área exterior se elimina con el comando borrar exterior. (C, D) Se genera una imagen en blanco y negro de las colonias utilizando la herramienta de umbral. (E, F) El número de colonias se cuantifica con la herramienta analizar partículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

El ensayo mCFU descrito aquí aumenta la cantidad de información que se puede recuperar de una sola placa de Petri a al menos 96 veces. En la figura 5 se muestra una comparación de dos métodos de administración de fármacos para el uso reutilizado de saquinavir (SQV)31,32 como fármaco dirigido al huésped para tratar la tuberculosis. En este ensayo, se utilizaron cuatro cepas diferentes de Mycobacterium tuberculosis para infectar macrófagos humanos primarios. M. tuberculosis Cepa de laboratorio H37Rv y tres cepas clínicas aisladas de pacientes con tuberculosis activa por el Dr. Ricardo Jorge (INSA) del Instituto Nacional de Salud de Portugal: una cepa sensible a los medicamentos (código INSA 33427), una cepa multirresistente (MDR) (código INSA 34192) y una cepa extremadamente resistente a los medicamentos (XDR) (código INSA 163761). Cada infección por cada cepa se multiplicó en ocho condiciones de tratamiento diferentes, comparando tres concentraciones diferentes de fármaco libre o cargado de liposomas con los respectivos controles no tratados. Finalmente, cada condición se analizó en cuatro momentos diferentes después de la infección. Para cuantificar el crecimiento bacteriano intracelular, la cantidad total de lisados extraídos de cada punto de tiempo fue de 32. A esto le siguieron tres diluciones seriadas en cada lisado, aumentando el número a 128 muestras. Multiplicado por los cuatro puntos de tiempo analizados se obtienen 512 muestras. Dado que el experimento se repitió utilizando macrófagos de al menos tres donantes de sangre diferentes, el número total de muestras analizadas aumentó a 1536. Usando el método mCFU descrito aquí, este experimento representó solo 16 placas de Petri cuadradas frente a las 1536 que serían necesarias utilizando el protocolo estándar de CFU. Como se muestra en la Figura 5, los resultados obtenidos con este método pueden demostrar diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos.

Figure 5
Figura 5. El método mCFU puede producir grandes cantidades de datos a partir de un pequeño número de placas de agar. Este conjunto de experimentos probó la eficacia del fármaco saquinavir (SQV) para inducir la muerte intracelular de cepas clínicas y de laboratorio de M.tb en macrófagos humanos. El SQV se administró a los cultivos de macrófagos en su forma libre o cargado en liposomas (LipSQV). Los tratamientos se realizaron en tres concentraciones diferentes: 50, 20 y 10 μg/mL. Los macrófagos se infectaron con diferentes cepas de M.tb durante 3 h y luego se trataron con concentraciones seleccionadas de LipSQV y SQV libre. Se utilizaron liposomas sin el fármaco (LipUnloaded) y DMSO como controles. Para evaluar la supervivencia intracelular bacteriana, en puntos de tiempo discretos, se lisaron macrófagos y se sembraron diluciones seriadas de la suspensión bacteriana en placas de agar 7H10. Las unidades de mCFU se contaron después de 2-3 semanas. Las líneas representan el promedio de mCFU por muestra de al menos 3 experimentos independientes. Las barras representan el porcentaje medio de mCFU calculado en relación con los respectivos controles en el día 7 después de la infección. Los símbolos representan cada experimento con macrófagos de un donante diferente. Las barras de error representan el error estándar de la media. Se realizaron comparaciones de múltiples grupos utilizando ANOVA de un factor seguido de una prueba post-hoc de Holm-Sidak. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Esta cifra ha sido modificada de33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La tuberculosis es un importante problema de salud pública con una importancia creciente, especialmente en los países de ingresos bajos y medios. La interrupción de los entornos sanitarios para diagnosticar y tratar la tuberculosis durante la pandemia de COVID-19 tuvo un impacto negativo en la incidencia de nuevos casos1. Además, las cepas de M.tb multirresistentes y ampliamente resistentes, así como la coinfección de M.tb y VIH, deben abordarse con urgencia para controlar esta epidemia 1,34. Actualmente se encuentran en ensayos clínicos nuevas vacunas para sustituir o mejorar la BCG, y en los próximos años podrían llegar al mercado nuevas candidatas35. El desarrollo de nuevas vacunas candidatas contra la tuberculosis se basa en estudios preclínicos con diversos modelos animales. La determinación de la eficacia de la vacuna en modelos animales requiere la cuantificación de la carga bacteriana en los órganos infectados para demostrar el efecto protector de la vacuna 5,36. Actualmente, existen métodos directos e indirectos para cuantificar la carga bacteriana en ratones infectados y primates no humanos. Los métodos directos incluyen preparaciones histológicas y tinción bacteriana utilizando auramina-o fluorescente y Ziehl-Neelsen37, la cuantificación de la carga micobacteriana en muestras basadas en RT-qPCR38, entre otros.

El ensayo de inhibición del crecimiento micobacteriano (MGIA) es un ensayo in vitro basado en el sistema BACTEC MGIT y es un método sensible utilizado para cuantificar la carga de micobacterias vivas en animales vacunados y no vacunados. El sistema es un instrumento totalmente automatizado que puede analizar la presencia de micobacterias en tubos de ensayo específicamente diseñados. El vial contiene un indicador fluorescente que reacciona a la concentración de oxígeno en la muestra. La fluorescencia es proporcional a la cantidad de oxígeno consumido, dando una indicación del número de bacterias vivas presentes en la muestra, cada hora39. En el método MGIA, las PBMC y las muestras de suero autólogo se recogen de animales y se cocultivan con micobacterias durante 96 h. A continuación, los monocitos adheridos se lisan para liberar micobacterias intracelulares. El sistema cuantificará la carga bacteriana de forma indirecta midiendo el consumo de oxígeno40. Este método se utiliza normalmente para estudios de resistencia a los medicamentos, pero se ha aplicado recientemente a la evaluación de la eficacia de la vacuna contra la tuberculosis40.

Estos métodos se pueden complementar con la UFC estándar para determinar el número total de micobacterias viables. Por ejemplo, la evaluación de vacunas candidatas en un experimento de provocación con M.tb en aerosol murino se logra enumerando colonias obtenidas de tejidos por UFC11.

El método mCFU descrito aquí puede ser una mejora sustancial con respecto al método clásico de CFU, ya que es más rápido de realizar y económico en términos de reactivos utilizados y en términos de espacio de laboratorio requerido. Este método permite la comparación simultánea de un gran conjunto de muestras en un solo experimento, disminuyendo así los efectos de las variaciones de ensayo a ensayo. Por ejemplo, como se muestra en el experimento descrito en la Figura 5, la UFC se determinó para 1536 muestras utilizando el método mCFU en 16 placas de Petri cuadradas, lo que representa una reducción de 96 veces en el número de placas utilizadas. Esto es más relevante para los experimentos que utilizan muestras biológicas y clínicas primarias, donde la disponibilidad puede ser un problema. La forma compacta en la que se muestran las colonias en una placa de agar permite convenientemente el uso de equipos de grabación de imágenes especializados o comunes. Esto, en combinación con métodos automatizados de conteo de colonias como el que se describe aquí utilizando el software Fiji, ayuda a reducir la dependencia de la capacidad del usuario para identificar y cuantificar la UFC. Aun así, al igual que la técnica estándar de las UFC, este método adolece de la incapacidad de distinguir las colonias fusionadas, lo que conduce a una posible infrarrepresentación de las UFC. Sin embargo, esto se puede minimizar seleccionando una dilución más alta para realizar la cuantificación o contando las colonias bajo el microscopio antes de que su crecimiento excesivo resulte en la fusión de colonias. Esto es más relevante si la muestra produce colonias con tasas de crecimiento heterogéneas. En esos casos, los investigadores deben validar la implementación de mCFU para sus condiciones experimentales específicas.

Los pasos críticos dentro del protocolo son los siguientes puntos: las diluciones en serie realizadas deben realizarse utilizando una placa de 96 pocillos, y las diluciones deben mezclarse bien; el recubrimiento de microgotas debe realizarse con una pipeta multicanal de 0,5-10 μL para transferir 5 μL de cada fila de la placa de 96 pocillos a la placa cuadrada mediana sólida, sin tocar ni dañar el medio; El recuento de microcolonias debe realizarse entre los 6-10 días de incubación. Sin embargo, en el momento del conteo, se debe tener cuidado para asegurarse de que las colonias no sean excesivamente grandes o demasiado pequeñas.

Las modificaciones y la solución de problemas de la técnica incluyen la utilización de diferentes cepas bacterianas. Por lo tanto, para cada cepa, se debe utilizar el medio de cultivo óptimo. Las limitaciones de la técnica son idénticas a las limitaciones del método convencional de UFC, que incluyen la dificultad de enumerar las bacterias en diluciones bajas. Además, las limitaciones específicas de este método incluyen la necesidad de usar un microscopio para enumerar las colonias.

Por último, este método puede utilizarse para cuantificar la carga bacteriana en los estudios de vacunación contra la tuberculosis y para los estudios de resistencia/susceptibilidad a los medicamentos y los estudios de interacción huésped-patógeno. Por ejemplo, la Figura 5 muestra la aplicación de mCFU para la determinación de la muerte intracelular de cepas de M.tb , incluidas las cepas clínicas, las cepas multirresistentes y las cepas extensivamente resistentes a los fármacos tratadas con diferentes formulaciones de fármacos, en macrófagos humanos. Es importante destacar que este método también se puede aplicar a cualquier microorganismo, siempre que se cumplan las condiciones de cultivo para cada organismo.

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Disclosures

DP y PJGB declaran que el estudio se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de financiación interna de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica Portuguesa y de la Fundación para la Ciencia y Tecnología (FCT), en el marco de las subvenciones UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 y EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

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