Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Abstract

Bulaşıcı bir ajan tarafından dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olan tüberküloz (TB), 2022'de 1,6 milyon insanı öldürdü, ancak 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı. Hastalığa Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisi neden olur. Tek tüberküloz aşısı olan Mycobacterium bovis suşu Bacillus Calmette-Guérin (BCG), halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır. Şu anda klinik deneylerde 12 aşı ve klinik öncesi geliştirilmekte olan düzinelerce aşı var. Klinik öncesi çalışmalarda TB aşılarının etkinliğini değerlendirmek için kullanılan tercih edilen yöntem, bakteri kolonilerinin koloni oluşturan birimler (CFU) testi ile sayımıdır. Bu zaman alıcı tahlilin sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer, önemli laboratuvar ve inkübatör alanı gerektirir, yüksek reaktif maliyetlerine sahiptir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, M.tb aşısının etkinlik sonuçlarını analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunan, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU'yu (mCFU) açıklıyoruz. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Ayrıca, bir TB aşısının etkinliğini değerlendirmek için, Mikobakteriler ile enfekte olmuş aşılanmış hayvanlardan alınan dokular da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan örnekler alınabilir. Ayrıca, enfeksiyon çalışmaları için tek hücreli, tek tip ve yüksek kaliteli bir mikobakteri kültürü üretmek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Son olarak, bu yöntemlerin aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB'ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz.

Introduction

Tüberküloz (TB), tek bir enfeksiyöz ajan olan Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisinin dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve diğer tüm patojenlerden daha fazla insanı öldürür. 2021'de tüberküloz 1,6 milyon ölümden sorumluydu ve 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı1. Ayrıca, Dünya Sağlık Örgütü'nün 2022 küresel TB raporuna göre, COVID-19 salgını yeni TB vakalarındaki artıştan sorumluydu. DSÖ ayrıca bu dönemde TB teşhisi konan kişi sayısında büyük düşüşler olduğunu ve bunun TB vakalarının sayısını daha da artırabileceğini bildirmektedir1.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG), 100 yıldan daha uzun bir süre önce ilk kez aşı olarak kullanılan patojenik Mycobacterium bovis'in canlı zayıflatılmış bir türüdür. Bu, tüberküloza karşı tek aşıdır ve halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır 2,3. Şu anda, klinik deneylerin farklı aşamalarında12 aşı bulunmaktadır 4 ve düzinelerce aşı klinik öncesi geliştirme aşamasındadır 5,6. Tüberküloza karşı aşıların klinik öncesi değerlendirmesi, zebra balığı, fareler, kobaylar, tavşanlar, sığırlar ve insan olmayan primatlar gibi çeşitli hayvan modellerinde elde edilebilen güvenlik ve immünojenisitenin7 değerlendirilmesini içerir 8,9,10. Ek olarak, bir aşının M.tb enfeksiyonuna ve/veya bulaşmasına karşı koruma sağlama kapasitesinin, yani aşı etkinliğinin değerlendirilmesi, in vivo 5,11. İlginç bir şekilde, BCG aşısı, eğitilmiş bağışıklık mekanizması12,13 yoluyla diğer bakteriyel ve viral patojenlerin14 hayatta kalmasını etkileyen spesifik olmayan etkilere neden olur. Enfekte bir hayvandaki canlı bakteri yükünü ölçmek için tercih edilen yöntem, koloni oluşturan birimler (CFU)testi 5,15 yoluyla bakteri kolonilerinin sayımıdır. CFU, belirli büyüme koşulları altında koloniler oluşturan mikroorganizmaların (bakteri veya mantar) sayısını tahmin eden bir birimdir. CFU'lar canlı ve replikatif mikroorganizmalardan kaynaklanır ve her kolonideki canlı mikroorganizmaların mutlak sayısını tahmin etmek zordur. Bir koloninin bir veya daha fazla mikroorganizmadan kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirsizdir. CFU birimi bu belirsizliği yansıtır, bu nedenle aynı numunenin kopyalarında büyük bir değişkenlik gözlemlenebilir. Bu zaman alıcı tahlil, bir biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL3) tesisinde, önemli laboratuvar ve inkübatör alanında çalışmak üzere eğitilmiş uzman teknisyenler gerektirir, sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer ve kontaminasyona eğilimlidir.

Bu çalışmada, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU'yu (mCFU) tanımladık vesonuçları analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunuyoruz 15,16,17,18,19,20. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Bu yöntemin, aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB'ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz. Son olarak, bu optimize edilmiş CFU sayım yöntemi, yalnızca Mikobakterileri değil, aynı zamanda Escherichia coli ve Ralstonia solanacearum21 gibi diğer bakterileri de ölçmek için kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Burada açıklanan protokol BCG içindir ancak herhangi bir Mikobakteriye uygulanabilir. BCG, BSL3 tesislerinin bulunmadığı durumlarda TB deneyleri için vekil bir bakteri olarak kullanılabilir22. BCG kullanan aşağıdaki prosedürler, bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) laboratuvarı altında gerçekleştirilmeli ve tehlike grubu 2 mikroorganizmalarının manipülasyonu için uygun biyogüvenlik yönergelerine ve iyi laboratuvar uygulamalarına uyulmalıdır.

1. Kültür ortamının hazırlanması

  1. Tedarikçinin talimatlarına göre %7 (h/h) oleik asit, albümin, dekstroz ve katalaz (OADC) zenginleştirmesi ile desteklenmiş Middlebrook 9H10 et suyunu hazırlayın. Et suyunu% 0.05 (h / h) tyloxapol ile destekleyin.
    NOT: Tyloxapol, bakteri küme oluşumunu önlemek için yüzey aktif madde olarak kullanılan iyonik olmayan sıvı bir polimerdir16.
  2. Tedarikçinin talimatlarına göre %7 (h/h) OADC zenginleştirmesi ile desteklenmiş Middlebrook 10H10 katı ortamını hazırlayın.
  3. Kare Petri kabı başına 40 mL ortam dağıtın (120 mm x 120 mm). Agarın yüzeyindeki yoğuşmayı en aza indirmek için plakaların kurumasını bekleyin.
    NOT: Bu özel petri kabı boyutu, 96 oyuklu bir plakadan en az 96 damlacığın doğrudan transpozaline izin vermek için esastır. Plakaların etkili bir şekilde kurutulması daha sonra küçük bakteri süspansiyon damlacıklarının kaplanmasını kolaylaştıracak ve damlacıkların yayılmasını önleyecektir.
  4. Enfeksiyon ortamını üretmek için Roswell Park Memorial Institute Medium'u (RPMI 1640) veya Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) hazırlayın. Her iki durumda da, ortamı %10 fetal buzağı serumu, %1 L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat ile destekleyin. Ortama penisilin ve streptomisin eklemeyin.

2. Numune hazırlama

  1. Çeşitli kaynaklardan örnekler alın. Tipik olarak, bir TB aşısının etkinliğini değerlendirmek için CFU'yu ölçmek için aşılanmış ve aşılanmamış hayvan dokularından örnekler alın. Örneğin, fare akciğeri ve dalağı11 veya makak akciğeri, torasik ve periferik lenf düğümleri, dalak, karaciğer, deri, kan, kemik iliği ve bronkoalveoler lavaj yıkama23. Alternatif olarak, BCG 18,19,20,24,25,26 ile enfekte makrofajların/dendritik hücrelerin/nötrofillerin in vitro kültürlerinden örnekler alın.

3. BCG kültürünün üretimi

NOT: Tüberküloz aşılarının in vivo çalışmalarında amaç, BCG'nin etkinliğini arttırmaktır. Bu nedenle BCG aşısı yapılan gruplar genellikle kontrol olarak kullanılır. İnsan aşılaması için kullanılan BCG suşları, hayvan modellerinde test etmek için idealdir. Bu durumda, tedarikçinin talimatlarına göre bir BCG kültürü yeniden oluşturulmalıdır27. Bununla birlikte, in vivo çalışmalar için bir BCG kültürü de kurum içinde üretilebilir11. İn vitro enfeksiyon protokolleri için tek hücreli, tek tip ve yüksek kaliteli BCG kültürünün üretimi, çeşitli çalışmalarda 11,16,18,19,20,26,28,29 çok başarılı bir şekilde üretilmiştir.

  1. 7H9 et suyunda, 37 °C'de, 200 rpm'de çalkalama ile 50 mL BCG kültürü. Ses seviyesini deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirin.
  2. Her gün, 8-10 gün boyunca, 100 μL kültür toplayın ve 1 mL'lik bir küvete 900 μL PBS ekleyerek seyreltin. Daha sonra bakterilerin optik yoğunluğunu ölçerek devam edin (λ=600 nm'de OD; OD600) bir spektrofotometrede. Bu değerlerden bir büyüme eğrisi çizin. Kültürün orta log aşamasını tanımlayın (OD birim zamanda tutarlı bir şekilde iki katına çıktığında).
  3. Sonraki bir kültür hazırlayın ve adım 3.1 ve 3.2'de olduğu gibi orta/geç kütük büyüme aşamasına ulaşana kadar inkübe edin. Önceki adımda elde edilen değerleri kılavuz olarak kullanın. Kaliteli bir canlı bakteri kültürünü korumak için kültürün sabit büyüme aşamasına (OD stabilize olmaya başladığında) ulaşmadığından emin olun.
  4. Kültürü orta/geç kütük büyüme aşamasında toplayın. 3000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  5. Bakterileri yıkamak için 10 mL PBS ekleyin. 3000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  6. Bakterileri 5 mL enfeksiyon ortamı ile yeniden süspanse edin. Tüpü 15 dakika boyunca ultrason banyosuna yerleştirin, 80 Hz'de tam güçte.
  7. 1000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Yüksek kaliteli bir BCG kültüründe kaçınılması gereken bakteri kümeleri açısından zengin olduğu için peletten kaçınarak süpernatanı toplayın ve atın.
  8. Süpernatantın OD'sini ölçün. Burada, OD600'ü 0.1 olan üstel büyüme fazındaki kültürler, 1 x 107 CFU/mL'ye eşdeğerdir.
    NOT: Her laboratuvar, spektrofotometreyi kullanarak OD600 ve CFU arasında doğrusal bir regresyon oluşturmak için deneylere başlamadan önce kendi BCG büyüme eğrilerini üretmelidir. Spektrofotometrelerin, aynı numune için elde edilen okumaları değiştirebilen farklı ışık yolu mesafelerine sahip olduğunu lütfen unutmayın.
  9. Her konakçı hücre kültürüne eklenecek bakteri sayısını belirlemek için basit hesaplamalar yapın. Konak hücre başına düşen bakteri sayısı, Enfeksiyon Çokluğudur (MOI). BCG enfeksiyon deneyleri için kullanılan en yaygın MOI olan konakçı hücre başına 10 bakterilik bir MOI kullanın.

4. Mikro koloni oluşturan birim tahlili

NOT: Bir in vivo veya in vitro enfeksiyon deneyi tamamlandıktan sonra, bakterilerin sayımı mCFU ile gerçekleştirilebilir. İn vivo çalışmalar için, numuneler önce bir boncuk çırpıcı veya başka bir doku homojenizatöründe homojenize edilmelidir. BCG ile enfekte makrofajların/dendritik hücrelerin/nötrofillerin in vitro kültürleri için, numuneler iyonik olmayan bir deterjan (örneğin, iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjanın% 0.05 çözeltisi) kullanılarak parçalanmalıdır.

  1. 96 oyuklu bir plaka kullanarak seri seyreltmeler: Şekil 1A'daki şemaya göre steril bir 96 oyuklu plakada lizatların seri 10 kat seyreltmelerini gerçekleştirin. Lizatları A ve E sıralarına dağıtın. Her plaka için maksimum numune ve/veya replikasyon sayısı 24'tür.
  2. Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek için kalan kuyucuklara 180 μL dH2O ekleyin.
  3. 12 kanallı bir pipet kullanarak, A sırasındaki lizatları yeniden süspanse edin ve 20 μL'yi B sırasına aktarın (20 μL lizat + 180 μL dH2O). İyice homojenize edin. D satırındaki son seyreltmeye ulaşana kadar B ve C satırları için bu adımı sırayla tekrarlayın.
    NOT: Genellikle üç seyreltme (100, 101, 102, 103) gerçekleştiririz, böylece her 12 numune ve/veya kopya seti için 4 sıra plaka (AD veya EH) kullanırız.
  4. Mikro damlacık kaplama: Şekil 0.5B'ye göre 10 oyuklu plakanın her sırasından 5 μL'yi katı orta kare plakaya aktarmak için 96-1 μL (ince uçlar tercih edilir) çok kanallı pipet kullanın.
  5. 5 μL'lik damlacıkları yavaşça pipetlerken, agarın üzerine hafifçe dokunmalarına izin verin. Bu, damlacığın uçtan agar'a doğru çıkarılmasına ve sıvının uç içinde tutulma olasılığının azaltılmasına yardımcı olacaktır.
  6. Damlacıkların kurumasını bekleyin, agar plakasını kapatın ve bakteri üremesini izlerken 37 °C'de inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, plakaların kurumasını önlemek için agar plakalarını kapalı bir plastik torba içinde inkübe edin.
  7. Mikro koloni sayımı: yaklaşık 6-10 günlük inkübasyonun ardından, çıplak gözle görülebilen tek tek kolonileri kontrol edin (Şekil 2).
  8. Ters çevrilmiş bir optik mikroskop veya büyüteç için en düşük büyütme objektifini (4x veya daha düşük) kullanarak kolonileri sayın. Koloni sayısının 300'den az ve 30'dan yüksek olduğu dilüsyonlarda sayım yapılmalıdır. Alternatif olarak, bilgisayardaki kolonileri manuel olarak saymak için damlacığın fotoğrafını çekmek için bir kamera kullanın veya koloni sayımını otomatikleştirmek için ImageJ gibi bir yazılım kullanın.
  9. Hücre numaralarını CFU/mL cinsinden ifade etmek için aşağıdaki denklemi kullanın:
    Equation 1
    Burada C = sayılan koloni sayısı, V = μL cinsinden kaplanmış hacim ve Dil = kolonilerin sayıldığı seyreltme (100, 101, 102, 103). Örneğin, 102 seyreltmesinde 5 μL'lik bir damlacıkta 30 koloni sayıldıysa, o zaman:
    Equation 2

Figure 1
Şekil 1. mCFU protokolünün şematik gösterimi. (A) 96 oyuklu bir plakada BCG içeren lizatların seri 10 kat seyreltilmesi. (B) Katı kültür ortamı içeren ve her biri 5 μL'lik 96 damlacık ile kaplanmış kare Petri kabı. Damlacıklar, çok kanallı bir pipet kullanılarak doğrudan 96 oyuklu plakadan pipetlenir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. 10 günlük inkübasyonun ardından BCG'nin mikro koloni oluşturan birimleri. Solda, daha önce Şekil 1B'de gösterildiği gibi, her biri 5 μL'lik 96 damlacık ile kaplanmış kare bir Petri kabının fotoğrafı. Sağda, 3 damlacığın tek tek fotoğrafları, orijinal bir lizata (100) ve iki seyreltmeye (101, 102) karşılık gelir. Fotoğraflar, 18-55 mm yakınlaştırma lensi (plaka) veya 105 mm makro lens (damlacıklar) ile donatılmış bir DSRL kamera kullanılarak çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Fiji'de mikro koloni oluşturan birim sayımı (ImageJ)

NOT: mCFU yöntemi, büyük numune setlerinin CFU miktar tayinine izin verir. Koloni sayımını kolaylaştırmak için damlacıkların resimleri posterior analiz için kaydedilebilir. Birkaç fotoğraf cihazı bu amaç için yeterli kalitede görüntüler üretebilir. Bunlara dijital kameralar, web kameraları, kameraya bağlı mikroskoplar ve büyüteçler ve cep telefonları dahildir. ImageJ gibi ücretsiz görüntü analiz yazılımları, bu görüntülerde manuel veya otomatik koloni sayımı imkanı sunar. Her iki yöntemi de göstermek için, bilimsel görüntü analizi için çeşitli araçları paketleyen bir ImageJ dağılımı olan Fiji kullanılacaktır30. Fiji, https://fiji.sc/'dan indirilebilir.

  1. Manuel sayma yöntemi
    1. Fiji'de mCFU'yu içeren görüntüyü açın. Hücre sayacını analiz > > Eklentiler'i seçin.
    2. Hücre Sayacı menüsünde Başlat'ı seçin ve ardından bir sayaç seçin (örneğin, Tür 1).
    3. Her koloniye tıklayarak devam edin. Her tıklama resimde gösterilecek ve sayacı güncelleyecektir (Şekil 3). Yanlışlıkla yapılan tıklamaları geri almak için Sil'i seçin.
    4. Sayaçta görüntülenen değeri kaydedin. Sayımı sıfırlamak ve ek örnekleri saymak için yeni bir görüntü açmak için Sıfırla düğmesine tıklayın.
      NOT: Bu eklenti hakkında daha fazla talimat https://imagej.net/plugins/cell-counter'de bulunabilir.
  2. Otomatik sayma yöntemi
    1. Fiji'de mCFU'yu içeren görüntüyü açın. Görüntü > Türü > 8 bit'i seçin. Bu, görüntüyü 8 bit gri tonlamalı bir görüntüye dönüştürecektir.
    2. Araç çubuğunda Oval aracını seçin ve kolonilerin bulunduğu alanın çevresine bir oval çizin (Şekil 4A). Oval çizildikten sonra ayarlanabilir.
    3. Dış alandaki parazitleri kaldırmak için Düzenle > Dışını Temizle'yi seçin (Şekil 4B). Görüntü > Eşiği Ayarla>yı seçin.
    4. Eşik menüsündeki kaydırıcıları, koloniler kırmızı görünene ve arka plan gürültüsü en aza indirilene kadar hareket ettirin (Şekil 4C).
    5. Uygula'yı seçin ve eşik penceresinden çıkın. Siyah beyaz bir görüntü oluşturulur (Şekil 4D).
    6. Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'i seçin. Parçacıkları analiz et penceresinde, koloni alanı (1 ile sonsuz arasında, kare piksel cinsinden ölçülür) ve dairesellik (0 ile 1 arasında, burada 1 mükemmel bir dairedir; Şekil 4E).
    7. Göster açılır menüsünde Anahatlar'ı seçin. Sonuçlar penceresinde her koloni için ayrıntılı ölçümler için Sonuçları Görüntüle'yi işaretleyin. Önceki ölçümleri silmek için Sonuçları Temizle'yi işaretleyin. Ölçümlerin özetlenmiş sonuçlarını görüntülemek için Özetle kutusunu işaretleyin (Şekil 4E).
    8. Tamam'ı seçerek çözümleyiciyi başlatın. Algılanan ve sayılan tüm ana hatlarıyla belirtilen kolonileri görüntüleyen yeni bir pencere açılır. Sonuçlar penceresi her koloni için ayrıntıları görüntüler ve özetlenmiş sonuçlar penceresi sayılan toplam kolonileri gösterir (Şekil 4F).
      NOT: Boyut ve dairesellik ayarları, görüntünün çözünürlüğüne ve büyütmesine ve kolonilerin boyutuna ve şekline göre değişir. Tüm kolonileri algılayan en iyi ayarlar bulunana kadar işlemi birkaç kez tekrarlayın. Analiz parçacıkları eklentisi hakkında daha fazla talimat https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap'da bulunabilir.

Figure 3
Şekil 3. Fiji yazılımındaki hücre sayacı eklentisini kullanarak mCFU'yu saymak için manuel bir yöntem. Mavi noktalar, kullanıcı tarafından zaten tıklanmış kolonileri gösterir. Sağdaki menü, o ana kadar sayılan koloni sayısını gösterir (sayı 41'dir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Fiji yazılımını kullanarak mCFU'yu saymak için otomatik bir yöntem. (A, B) Kolonilerle ilgilenilen bölge, oval seçim aracı kullanılarak seçilir ve dış alan, dışını temizle komutu kullanılarak kaldırılır. (C, D) Eşik aracı kullanılarak kolonilerin siyah beyaz bir görüntüsü oluşturulur. (E, F) Koloni sayısı, parçacıkları analiz etme aracı kullanılarak ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan mCFU testi, tek bir Petri kabından alınabilecek bilgi miktarını en az 96 kata çıkarır. Şekil 5, tüberkülozu tedavi etmek için konakçıya yönelik bir ilaç olarak sakinavirin (SQV)31,32 yeniden amaçlı kullanımı için iki ilaç verme yönteminin karşılaştırmasını göstermektedir. Bu tahlilde, primer insan makrofajlarını enfekte etmek için dört farklı Mycobacterium tuberculosis suşu kullanıldı. M. tüberküloz Portekiz Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden Dr. Ricardo Jorge (INSA) tarafından aktif tüberkülozlu hastalardan izole edilen H37Rv laboratuvar suşu ve üç klinik suş: ilaca duyarlı bir suş (INSA kodu 33427), çoklu ilaca dirençli (MDR) bir suş (INSA kodu 34192) ve yaygın olarak ilaca dirençli (XDR) bir suş (INSA kodu 163761). Her bir suş tarafından her bir enfeksiyon, üç farklı serbest ilaç veya lipozom yüklü ilaç konsantrasyonunun ilgili tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırılması için sekiz farklı tedavi koşuluna çarpıldı. Son olarak, her durum enfeksiyon sonrası dört farklı zaman noktasında analiz edildi. Hücre içi bakteri üremesini ölçmek için, her bir zaman noktasından ekstrakte edilen toplam lizat miktarı 32 idi. Bunu, her bir lizata üç seri seyreltme izledi ve sayıyı 128 örneğe çıkardı. Analiz edilen dört zaman noktası ile çarpıldığında 512 örnekte sonuç verilir. Deney, en az üç farklı kan bağışçısından alınan makrofajlar kullanılarak tekrarlandığından, analiz edilen toplam örnek sayısı 1536'ya yükseldi. Burada açıklanan mCFU yöntemini kullanarak, bu deney, standart CFU protokolü kullanılarak gerekli olacak 1536'ya karşı yalnızca 16 kare Petri kabından sorumluydu. Şekil 5'te gösterildiği gibi, bu yöntemle elde edilen sonuçlar, tedaviler arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterebilir.

Figure 5
Şekil 5. mCFU yöntemi, az sayıda agar plakasından yüksek miktarda veri üretebilir. Bu deney seti, insan makrofajlarında M.tb laboratuvarı ve klinik suşlarının hücre içi öldürülmesini indüklemek için sakinavirin (SQV) ilacının etkinliğini test etti. SQV, makrofaj kültürlerine serbest formda veya lipozomlara (LipSQV) yüklenerek uygulandı. Tedaviler üç farklı konsantrasyonda gerçekleştirildi: 50, 20 ve 10 μg/mL. Makrofajlar 3 saat boyunca farklı M.tb suşları ile enfekte edildi ve daha sonra seçilen LipSQV ve serbest SQV konsantrasyonları ile tedavi edildi. Kontrol olarak ilaçsız lipozomlar (LipUnloaded) ve DMSO kullanıldı. Bakteri hücre içi sağkalımını değerlendirmek için, ayrı zaman noktalarında makrofajlar parçalandı ve bakteriyel süspansiyonun seri seyreltmeleri 7H10 agar plakaları üzerine kaplandı. mCFU birimleri 2-3 hafta sonra sayıldı. Çizgiler, en az 3 bağımsız deneyden numune başına ortalama mCFU'yu gösterir. Çubuklar, enfeksiyondan sonraki 7. günde ilgili kontrollere göre hesaplanan ortalama mCFU yüzdesini temsil eder. Semboller, farklı bir donörden alınan makrofajlarla yapılan her deneyi temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Çoklu grup karşılaştırmaları tek yönlü ANOVA ve ardından Holm-Sidak post-hoc testi kullanılarak yapıldı. * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001. Bu rakam33'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tüberküloz, özellikle düşük ve orta gelirli ülkelerde önemi giderek artan önemli bir halk sağlığı sorunudur. COVID-19 pandemisi sırasında tüberkülozu teşhis ve tedavi etmek için sağlık hizmeti ortamlarının bozulması, yeni vakaların görülme sıklığı üzerinde olumsuz bir etkiye neden olmuştur1. Ek olarak, bu salgını kontrol etmek için çoklu ilaç ve yaygın ilaca dirençli M.tb suşları ve M.tb ve HIV'in birlikte enfeksiyonu acilen ele alınmalıdır 1,34. BCG'nin yerini alacak veya iyileştirecek yeni aşılar şu anda klinik denemelerdedir ve önümüzdeki yıllarda yeni adaylar piyasaya çıkabilir35. Tüberküloza karşı yeni aşı adaylarının geliştirilmesi, çeşitli hayvan modelleri kullanılarak yapılan klinik öncesi çalışmalara dayanmaktadır. Hayvan modellerinde aşı etkinliğinin belirlenmesi, aşının koruyucu etkisini göstermek için enfekte organlarda bakteri yükü miktarının belirlenmesini gerektirir 5,36. Şu anda, enfekte farelerde ve insan olmayan primatlarda bakteri yükünü ölçmek için doğrudan ve dolaylı yöntemler vardır. Doğrudan yöntemler, floresan auramine-o ve Ziehl-Neelsen37 kullanılarak histolojik preparatlar ve bakteriyel boyama, RT-qPCR38'e dayalı numunelerde mikobakteriyel yükün miktar tayini ve diğerlerini içerir.

Mikobakteriyel büyüme inhibisyon testi (MGIA), BACTEC MGIT sistemine dayalı bir in vitro testtir ve aşılanmış ve aşılanmamış hayvanlarda canlı mikobakteri yükünü ölçmek için kullanılan hassas bir yöntemdir. Sistem, özel olarak tasarlanmış test tüplerinde Mikobakterilerin varlığını test edebilen tam otomatik bir cihazdır. Şişe, numunedeki oksijen konsantrasyonuna tepki veren bir floresan raportör içerir. Floresan, tüketilen oksijen miktarı ile orantılıdır ve her saat39 numunede bulunan canlı bakteri sayısının bir göstergesini verir. MGIA yönteminde, PBMC'ler ve otolog serum örnekleri hayvanlardan toplanır ve 96 saat boyunca mikobakterilerle birlikte kültürlenir. Daha sonra, hücre içi mikobakterileri serbest bırakmak için yapışık monositler parçalanır. Sistem, oksijen tüketimini40 ölçerek bakteri yükünü dolaylı olarak ölçecektir. Bu yöntem tipik olarak ilaç direnci çalışmaları için kullanılır, ancak son zamanlarda TB aşı etkinlik değerlendirmesine40 uygulanmıştır.

Bu yöntemler, toplam canlı mikobakteri sayısını belirlemek için standart CFU ile tamamlanabilir. Örneğin, bir murin aerosol M.tb meydan okuma deneyinde aşı adaylarının değerlendirilmesi, CFU11 ile dokulardan elde edilen kolonilerin numaralandırılmasıyla elde edilir.

Burada açıklanan mCFU yöntemi, kullanılan reaktifler ve gerekli laboratuvar alanı açısından daha hızlı ve ucuz olduğu için klasik CFU yöntemine göre önemli bir gelişme olabilir. Bu yöntem, tek bir deneyde büyük bir numune setinin aynı anda karşılaştırılmasına izin verir, böylece tahlilden tahlillere varyasyonların etkilerini azaltır. Örneğin, Şekil 5'te açıklanan deneyde gösterildiği gibi, 16 kare Petri kabında mCFU yöntemi kullanılarak 1536 numune için CFU belirlendi, bu da kullanılan plaka sayısında 96 kat azalmayı temsil ediyor. Bu, kullanılabilirliğin bir sorun olabileceği birincil biyolojik ve klinik numunelerin kullanıldığı deneyler için daha uygundur. Kolonilerin bir agar plakası üzerinde görüntülendiği kompakt form, özel veya yaygın görüntü kayıt ekipmanının kullanımına uygun şekilde izin verir. Bu, Fiji yazılımı kullanılarak burada açıklananlar gibi otomatik koloni sayım yöntemleriyle birlikte, kullanıcının CFU'yu tanımlama ve ölçme becerisine olan bağımlılığını azaltmaya yardımcı olur. Buna rağmen, standart CFU tekniği gibi, bu yöntem de CFU'nun potansiyel olarak yetersiz temsil edilmesine yol açan birleştirilmiş kolonileri ayırt edememekten muzdariptir. Bununla birlikte, bu, nicelemeyi gerçekleştirmek için daha yüksek bir seyreltme seçilerek veya aşırı büyümeleri koloni birleşmesiyle sonuçlanmadan önce kolonileri mikroskop altında sayarak en aza indirilebilir. Bu, numunenin heterojen büyüme oranlarına sahip koloniler üretmesi durumunda daha önemlidir. Araştırmacılar, bu durumlarda kendi özel deneysel koşulları için mCFU uygulamasını doğrulamalıdır.

Protokol içindeki kritik adımlar şu noktalardır: yapılan seri seyreltmeler 96 oyuklu bir plaka kullanılarak yapılmalı ve seyreltmeler iyice karıştırılmalıdır; mikro damlacık kaplaması, 96 oyuklu plakanın her sırasından 5 μL'yi ortama dokunmadan ve zarar vermeden katı orta kare plakaya aktarmak için 0,5-10 μL'lik çok kanallı bir pipetle gerçekleştirilmelidir; Mikro koloni sayımı 6-10 günlük inkübasyon süresi arasında yapılmalıdır. Bununla birlikte, sayım sırasında, kolonilerin aşırı büyük veya çok küçük olmamasına dikkat edilmelidir.

Tekniğin modifikasyonları ve sorun giderme, farklı bakteri suşlarının kullanımını içerir. Bu nedenle, her suş için en uygun büyüme ortamı kullanılmalıdır. Tekniğin sınırlamaları, düşük seyreltmelerde bakterileri saymanın zorluğunu içeren geleneksel CFU yönteminin sınırlamalarıyla aynıdır. Ek olarak, bu yöntemin belirli sınırlamaları, kolonileri numaralandırmak için bir mikroskop kullanma gerekliliğini içerir.

Son olarak, bu yöntem, TB aşılama çalışmalarında bakteri yükünü ölçmek ve ilaç direnci/duyarlılık çalışmalarını test etmek ve konak-patojen etkileşimi çalışmaları için kullanılabilir. Örneğin, Şekil 5 , insan makrofajlarında klinik suşlar, çoklu ilaca dirençli ve yaygın olarak ilaca dirençli suşlar dahil olmak üzere M.tb suşlarının hücre içi öldürülmesinin belirlenmesi için mCFU uygulamasını göstermektedir. Daha da önemlisi, bu yöntem, her organizma için kültür koşullarının karşılanması koşuluyla herhangi bir mikroorganizmaya da uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DP ve PJGB, çalışmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

Acknowledgments

Bu çalışma, Universidade Católica Portuguesa Tıp Fakültesi'nin iç finansmanı ve UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 ve EXPL/SAU-INF/0742/2021 hibeleri kapsamında Fundação para a Ciência e a Tecnologia'nın (FCT) dış finansmanı ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).

Tags

Tıp Sayı 197 Aşılar Tüberküloz Mycobacterium Tuberculosis Bacillus Calmette-Guérin TB Aşısı Klinik Araştırmalar Klinik Öncesi Geliştirme Bakteri Kolonilerinin Sayımı Koloni Oluşturan Birimler Testi MCFU Testi Reaktif Maliyetleri Kuluçka Süresi Laboratuvar Alanı Sağlık ve Güvenlik Riskleri
Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pires, D., Bettencourt, P. J. G.… More

Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter