Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/66078
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

Summary

ספרואידים של תאים נחשבו למודל פוטנציאלי אחד בתחום היישומים הביולוגיים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מדרגי של ספרואידים של תאים באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית, המספק שיטה יעילה לייצור חזק ומהיר של ספרואידים אחידים של תאים.

Abstract

ספרואידים של תאים הם מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבטיחים שזכו ליישומים נרחבים בתחומים ביולוגיים רבים. פרוטוקול זה מציג שיטה לייצור ספרואידים תאים באיכות גבוהה ובתפוקה גבוהה באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית באמצעות הליכים הניתנים לתמרון. התקן ההרכבה האקוסטית מורכב משלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT), שכל אחד מהם מסודר במישור X/Y/Z של תא פולימתיל מתקרילט מרובע (PMMA). תצורה זו מאפשרת יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מרחפים (LAN) בעת החלת שלושה אותות. כתוצאה מכך, תאים בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA) יכולים להיות מונעים ל- LANs, ויוצרים צברי תאים אחידים בשלושה ממדים. לאחר מכן, תמיסת GelMA עוברת פוטוקורפינג UV ומקושרת כדי לשמש כפיגום התומך בצמיחה של אגרגטים של תאים. לבסוף, המוני ספרואידים בשלים מתקבלים ונשלפים על ידי המסה לאחר מכן של פיגומי GelMA בתנאים קלים. המכשיר החדש המוצע להרכבת תאים אקוסטיים בתלת ממד יאפשר ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים תאיים, ואפילו אורגנואידים, ויציע טכנולוגיה פוטנציאלית גדולה בתחום הביולוגי.

Introduction

מודלים תלת-ממדיים של תרביות חוץ גופיות, המספקים יותר מאפיינים מבניים ומורפולוגיים דמויי vivo בהשוואה למודלים קונבנציונליים של תרביות דו-ממדיות, הוכרו כמערכות מבטיחות ביישומים ביו-רפואיים שונים כגון הנדסת רקמות, מידול מחלות וסינון תרופות 1,2,3. כסוג אחד של מודל תרבית תלת-ממדי, ספרואידים של תאים מתייחסים בדרך כלל לצבירת תאים, ויוצרים מבנים ספרואידים תלת-ממדיים המאופיינים באינטראקציות משופרות בין תא לתא ולמטריצה התאית 4,5,6. לכן, ייצור ספרואידים של תאים הפך לכלי רב עוצמה המאפשר מחקרים ביולוגיים מגוונים.

טכניקות שונות, כולל טיפה תלויה7, לוחות לא דביקים8, או מכשירי מיקרווול9, פותחו כדי להשיג ספרואידים. באופן עקרוני, שיטות אלה בדרך כלל מקלות על הרכבת תאים על ידי ניצול כוחות פיזיקליים כגון כוח כבידה תוך מזעור אינטראקציות בין התאים למצע. עם זאת, לעתים קרובות הם כרוכים בתהליכים עתירי עבודה, בעלי פרודוקטיביות נמוכה, ומציבים אתגרים לשליטה בגודלהספרואיד 10,11. חשוב לציין, ייצור ספרואידים בגודל ובאחידות הרצויים בכמות מספקת הוא בעל חשיבות עליונה כדי לספק יישומים ביולוגיים ספציפיים. בניגוד לשיטות שהוזכרו לעיל, גלים אקוסטיים, כסוג אחד של טכניקה מונעת כוח חיצוני 12,13,14, הראו פוטנציאל לייצור המוני של ספרואידים תאים באיכות ובתפוקה גבוהות, בהתבסס על העיקרון של שיפור צבירת תאים באמצעות כוחות חיצוניים 15,16,17,18. שלא כמו כוחות אלקטרומגנטיים או מגנטיים, טכניקות מניפולציה של תאים מבוססות אקוסטיקה אינן פולשניות ונטולות תוויות, ומאפשרות היווצרות ספרואידים עם תאימות ביולוגית מצוינת19,20.

בדרך כלל, התקנים מבוססי גלים אקוסטיים של משטח עומד (SAWs) וגלים אקוסטיים בתפזורת (BAWs) פותחו כדי ליצור ספרואידים, תוך ניצול הצמתים האקוסטיים (ANs) המיוצרים על ידי שדות אקוסטיים עומדים תואמים 21,22,23. במיוחד, התקני הרכבה אקוסטית המבוססים על BAWs, עם היתרונות של ייצור נוח, הפעלה קלה ומדרגיות מעולה, זכו לתשומת לב לייצור ספרואידים תא24,25. לאחרונה פיתחנו מכשיר הרכבה אקוסטית מבוסס BAWs עם היכולת לייצר ספרואידים עם תפוקה גבוהה26. המכשיר המוצע מורכב מתא פולימתיל מתקרילט ריבועי (PMMA) עם שלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT) המסודרים בהתאמה במישור X/Y/Z. סידור זה מאפשר יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מורחפים (LANs) להנעת הרכבת תאים. בהשוואה להתקנים מבוססי BAW או SAWs שדווחו בעבר, אשר יכולים ליצור רק מערך 1D או 2D של ANs 27,28,29, המכשיר הנוכחי מאפשר מערך נקודות תלת-ממדי של רשתות LAN ליצירת צבירת תאים מהירה בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA). לאחר מכן, צברי תאים הבשילו לספרואידים עם כדאיות גבוהה בתוך פיגומי GelMA פוטוריפו לאחר שלושה ימים של גידול. לבסוף, מספר רב של ספרואידים בגודל אחיד הושגו בקלות מפיגומים GelMA עבור יישומים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית

  1. התחל על ידי הכנת ארבע יריעות PMMA בעובי 1 מ"מ באמצעות חיתוך לייזר30, ולאחר מכן להמשיך להדביק אותם יחד כדי ליצור תא מרובע עם רוחב פנימי של 21 מ"מ וגובה של 10 מ"מ.
  2. לאחר מכן, חברו יריעת PMMA נוספת בעובי 1 מ"מ לתחתית התא כדי לשמש כמחזיק לדיו הביולוגי.
  3. הצמידו בזהירות שלושה מתמרי עופרת זירקונט טיטנאט (PZT) (כל אחד באורך 20 מ"מ, רוחב 10 מ"מ, עובי 0.7 מ"מ ובתדר תהודה ראשוני של 3 מגה-הרץ, ראו טבלת חומרים) לחלק החיצוני של שלושת הקירות האורתוגונליים של החדר, בהתאמה. ודא שמתמר PZT התחתון ממורכז מתחת לתא.
  4. חוטי הלחמה לשני האזורים המוליכים של כל מתמר PZT.
  5. לבסוף, אבטחו את המכשיר על בסיס חלול כדי למנוע מה-PZT התחתון לבוא במגע עם משטחי עבודה אחרים.

2. הקמת מערכת הרכבה אקוסטית

  1. התחילו בהרכבת המכשיר האקוסטי על במת מיקרוסקופ, המאפשרת תצפית מלמעלה על פנים החדר.
  2. מקם מיקרוסקופ דיגיטלי בצד המכשיר ללא מתמרי PZT, המאפשר תצפית צידית על פנים התא.
  3. חבר באופן עצמאי את החוטים משלושת מתמרי PZT בסדרה לשלושה מגברי הספק ולשלושה ערוצי פלט של מחוללי פונקציות (ראה טבלת חומרים).
  4. תכנת את ההגדרות על מחוללי הפונקציות עבור כל מתמר PZT, תוך ציון פרמטרים כגון צורת גל סינוסואידית, תדר ומשרעת.
  5. כדי להבטיח עיקור, מלא את התא של המכשיר האקוסטי עם 75% אלכוהול במשך 5 דקות, ולאחר מכן ניקוי יסודי עם פתרון PBS סטרילי. לאחר מכן, להקרין את החדר עם אור UV בספסל נקי במשך מינימום של 1 שעות.

3. תרבית תאים והליך הקציר

  1. התחל בגידול תאי C3A, קו תאי קרצינומה הפטוצלולרי אנושי, בבקבוק תרבית תאי T25 באמצעות מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים).
  2. כאשר תאי C3A מגיעים למפגש של כ-80%, בצעו מעבר תאים באופן הבא: ראשית, שטפו את תחתית בקבוק התרבית פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק תרבית התאים ודגרו בטמפרטורה של 37°C כדי להקל על ניתוק התא. עצור את תהליך הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם.
  3. העבר את תמיסת התא לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה התא.

4. הכנת הביו-דיו

  1. הכינו תמיסת GelMA 6% (w/v) המכילה 0.5% (w/v) ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) על ידי המסת 0.3 גרם GelMA ו-0.025 גרם LAP (ראו טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של תמיסת חיץ פוספט (PBS). הניחו לתערובת לשבת באמבט מים בטמפרטורה של 47°C למשך שעה אחת.
  2. לפני ערבוב עם תאים, להעביר את תמיסת GelMA דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) לעיקור.
  3. השהה מחדש את גלולת התא שהוזכרה לעיל (שלב 3.3) בתווך תרבית התא. צבעו נפח קטן של תאים בתמיסת טריפאן כחולה של 0.4% ולאחר מכן השתמשו בהמוציטומטר נקי לספירת תאים.
  4. ערבבו כמות מתאימה של תאי C3A, המחושבת על בסיס צפיפות התאים שהתקבלה לעיל, עם תמיסת GelMA מעוקרת להכנת הביודיו עם צפיפות תאים של 2 × 106 תאים / מ"ל.
  5. להדמיה של כדורי התאים שהורכבו, הכתימו מראש את תאי C3A על ידי דגירה שלהם עם מעקב תאים של 2 מיקרומטר (צבע DiO, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים המסומנים בתרבית תאים טרייה שלוש פעמים לפני השימוש.

5. הרכבת כדורי התא באמצעות המכשיר האקוסטי

  1. פיפטה יותר מ 1 מ"ל של bioink לתוך החדר מעוקר. ודא שהמרחק פנים אל פנים בין פני השטח הנוזליים לתחתית התא הוא כפולה שלמה של מחצית מאורך הגל האקוסטי.
    הערה: ניתן לשלוט במרחק זה על-ידי התאמת נפח הדיו הביולוגי שנוסף. ניתן להעריך את אורך הגל האקוסטי (λ) באמצעות הנוסחה λ = c/f, כאשר c מייצג את מהירות הקול בתווך, ו- f הוא התדר של מתמר PZT.
  2. הפעל את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח כדי להתחיל את ההפעלה של כל מתמר PZT.
    הערה: מומלץ להפעיל תחילה בנפרד כל מתמר PZT כדי להשיג את התבנית התאית האופטימלית של קו מקבילי. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע טאטוא תדרים בגודל צעד של 0.001 מגה-הרץ ליד תדר התהודה העיקרי עבור כל מתמר PZT. לאחר מכן, יישמו בו זמנית את האותות האופטימליים האלה על כל שלושת מתמרי PZT כדי לקבל את התבנית התאית הצפויה של נקודות תלת-ממדיות. לפני החלת כל אות קלט, ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בדיו הביולוגי על ידי תסיסה עדינה.
  3. הצליבו את הדיו הביולוגי באמצעות אור כחול (405 ננומטר, 60 mW/cm2, 30 שניות) ליצירת פיגום הידרוג'ל תלת-ממדי העוטף את אגרגטי התאים שהורכבו אקוסטית. לאחר מכן, כבה את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח.
  4. העבירו בזהירות את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי מהחדר לצלחת פטרי וחתכו אותו לחתיכות קטנות (למשל, 2 מ"מ × 2 מ"מ × 2 מ"מ) באמצעות סכין גילוח נקי.
  5. הוסף מדיום תרבית תאים לטיפוח.
    הערה: זכור לשנות את מדיום התרבות מדי יום.

6. אחזור ספרואידים של תאים

  1. התחילו בהתבוננות בהיווצרות ספרואידים בשכבות שונות של הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
  2. לאחר 3 ימי תרבית, הסירו את מדיום התרבית ושטפו היטב את פיגומי ההידרוג'ל פעמיים עם PBS.
  3. לדגור על הפיגומים עם יותר מ 2 מ"ל של חיץ ליזה GelMA בדילול 1: 200 עם מדיום תרבית תאים במשך 30 דקות באינקובטור התא. צעד זה נועד להמיס את פיגומי ההידרוג'ל.
  4. להעביר את התמיסה מן השלב הקודם לתוך צינור ולאחר מכן צנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את גלולת הספרואיד התא.
  5. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיום תרבית טרי ליישומים במורד הזרם.

7. ניתוח כדאיות ספרואידית

  1. הערך את הכדאיות של כדורי תאים בתוך פיגומי ההידרוג'ל או בתוך הספרואידים שאוחזרו באמצעות ערכת צביעה חיה/מתה (ראה טבלת חומרים).
  2. לדגור על הדגימות בנקודות זמן תרבית שונות עם 1 מ"ל של תמיסת PBS המכילה 1 μL של Calcein-AM ו 2 μL של Propidium יודיד (PI) במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  3. עבור דגימות בתוך פיגומים הידרוג'ל, לשטוף אותם ישירות עם PBS פעמיים. עבור ספרואידים שהוחזרו, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה ספרואידית, ולשטוף אותו פעמיים לפני התצפית.
  4. התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכוד את התמונות הפלואורסצנטיות.
  5. חשב את היחס בין האזור המוכתם ב- Calcein-AM לשטח הכולל המוכתם הן ב- Calcein-AM והן ב- PI באמצעות ImageJ כדי לקבוע את הכדאיות הספרואידית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה תכנן התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית לייצור המוני של ספרואידים תאיים. המכשיר האקוסטי כלל תא מרובע עם שני מתמרי PZT המחוברים למישור X ולמישור Y על פני השטח החיצוניים של התא ומתמר PZT אחד בתחתית התא (איור 1A,B). שלושה ערוצי פלט משני מחוללי פונקציות חוברו לשלושה מגברי כוח כדי ליצור שלושה אותות סינוסואידים עצמאיים להפעלת מתמרי PZT (איור 1C).

תדרי התהודה האופטימליים ששימשו להפעלת שלושת מתמרי PZT המחוברים למישורי X/Y/Z של התא היו 3.209 MHz, 3.283 MHz ו-3.215 MHz, בהתאמה. המשרעת האופטימלית עבור כל שלושת מתמרי PZT הייתה 10 מתח יציאה משיא לשיא (Vpp), שנמדד על ידי אוסצילוסקופ. איור 2A מדגים את מנגנון העבודה של צברי תאים שנוצרו באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית. כאשר האות מוחל, תאים מונעים לצמתים האקוסטיים תחת השפעת כוח קרינה אקוסטית (ARF). כדי להמחיש ספרואידים של תאים, התאים הוכתמו מראש עם 2 μM DiO (פלואורסצנטיות ירוקה). לאחר הרכבת תאים אקוסטיים, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצפות בצברי התאים התלת-ממדיים שהורכבו אקוסטית. צברי התאים האלה נצפו מסודרים בתבנית רגילה של מערך נקודות תלת-ממדיות עם אותות פלואורסצנטיים ירוקים אחידים (איור 2B). תצוגות עליונות שונות של תמונות עם שדות בהירים הראו גם שהאגרגטים שנוצרו בכל שכבה היו מסודרים בתבנית מערך של נקודות דו-ממדיות (איור 2C).

נצפתה צמיחה של אגרגטים של תאים בתוך ההידרוג'ל בנקודות זמן שונות. התוצאות הראו שהאגרגטים שהורכבו השתלבו בהדרגה ויצרו ספרואידים הדוקים עד היום השלישי, מלווה בעלייה בקוטר הספרואיד (איור 3A,B). צביעה חיה/מתה בוצעה כדי להעריך את הכדאיות של כדורי התא. כדאיות תאים טובה (>90%) הושגה לפני היום השלישי, בעוד שהכדאיות ירדה מעט לאחר שבוע של תרבית (איור 3C,D).

לצורך שליפת ספרואידים, נעשה שימוש במאגר GelMA lysis כדי לנתק את פיגומי ההידרוג'ל, ולשחרר את ספרואידים של תאים עטופים (איור 4A). כתוצאה מכך, לאחר שלושה ימי גידול, החתיכות הקטנות של פיגומי הידרוג'ל טופלו בחיץ GelMA lysis בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הספרואידים ששוחררו שמרו על מורפולוגיה כדורית טובה עם התפלגות גודל צרה, יחד עם ביטוי אלבומין ויכולת קיום רצויה (איור 4B-D).

Figure 1
איור 1: התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית. (A) תרשים סכמטי המתאר את התצוגה העליונה של התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית, המורכב מתא PMMA המחובר לשלושה מתמרי PZT. (B) תצלום המציג את התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית בפועל. (C) תצלום המראה את התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית המחובר לשני גנרטורים פונקציונליים ולשלושה מגברי הספק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אגרגטים של תאים שהורכבו באופן אקוסטי . (A) סכמטי המדגים את מנגנון העבודה של צברי תאים הנוצרים על-ידי התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדי, שבו תאים מונעים לצמתים האקוסטיים על-ידי כוח קרינה אקוסטית. (B) תמונות קונפוקליות המציגות את צברי התאים המורכבים אקוסטית בתלת-ממד מנקודות מבט שונות. (C) תמונות שדה בהיר המציגות את צברי התאים שנוצרו בשכבות שונות בתוך פיגום ההידרוג'ל. סרגל קנה המידה מייצג 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: גדילה של צברי תאים לספרואידים בתוך פיגום GelMA. (A) תמונות שדה בהיר המראות היווצרות של כדורי תאים קומפקטיים לאחר תקופת תרבית של 3 ימים. (B) כימות של גדלי הספרואידים. (C) כתמים חיים/מתים של ספרואידים בתוך פיגום ההידרוג'ל לאחר שבוע של תרבית. (D) כימות הכדאיות של כדורי התא. סרגל קנה המידה מייצג 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אחזור של ספרואידים של תאים מיוצרים אקוסטית. (A) איור המתאר את השלבים לאחזור ספרואידים של תאים שנוצרו באופן אקוסטי. (B) תמונות עם שדה בהיר המציגות את הספרואידים שאוחזרו בהגדלות שונות. סרגל קנה המידה מייצג 250 מיקרומטר. (C) ניתוח הכדאיות והפונקציונליות של הספרואידים שאוחזרו. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (D) התפלגות הגודל של הספרואידים לאחר השליפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ייצור יעיל ויציב של ספרואידים של תאים עם תפוקה גבוהה באמצעות טכנולוגיות כמו התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית טומן בחובו הבטחה גדולה לקידום הנדסה ביו-רפואית וסינון תרופות 1,2,3. גישה זו מפשטת את הייצור ההמוני של ספרואידים תאים באמצעות הליכים פשוטים.

עם זאת, ישנם גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במכשיר אקוסטי זה. יצירת גלים עומדים חיונית לבניית שדה אקוסטי של מערך נקודות תלת-ממדי. במכשיר זה, רק מתמר PZT אחד נמצא בכל ממד, המשמש כמקור עירור קול. לכן, עבור כל ממד, חיוני שהמרחק פנים אל פנים בין הדפנות הנגדיות של תא PMMA או משטח PMMA-מים יהיה כפולה שלמה של מחצית אורך הגל. התדר העיקרי של מתמרי PZT שבהם השתמשנו הוא 1 MHz, מה שמביא לאורך גל במים או ביו-דיו של כ-500 מיקרומטר. כתוצאה מכך, עבור הממד האופקי, המרחק פנים אל פנים בין שני הדפנות הנגדיות של תא PMMA במכשיר האקוסטי נקבע ל -21 מ"מ, תוך התחשבות בגודל מתמרי PZT. עבור הממד האנכי, ניתן לכוונן את המרחק פנים אל פנים בין קיר PMMA התחתון לבין פני המים על ידי שינוי נפח הדיו הביולוגי כדי לעמוד בתנאים להיווצרות גלים עומדים. במהלך פעולת הניסוי, ייתכן שיהיה צורך בהתאמות תדר קלות כדי לפצות על סטיות מרחק. בנוסף, חשוב לשמור על מתח הכניסה ברמה מתונה כדי למנוע התחממות יתר של מתמר PZT, שעלול לחמם את הדיו הביולוגי ועלול לפגוע בתאים. בניסויים נעשה שימוש במתח שיא עד שיא של 10 Vpp, המשלים את הרכבת צברי התאים תוך 30 שניות תוך שמירה על טמפרטורת הביו-דיו מתחת ל-30 מעלות צלזיוס.

מגבלה אחת של גישה זו היא ההסתמכות על פיגום GelMA26, אשר ממלא תפקיד מכריע בשמירה על השלמות המבנית של צברי התאים המורכבים אקוסטית כאשר הם מבשילים לכדורי תאים כאשר השדה האקוסטי מוסר. עם זאת, השלב הכרוך בפירוק פיגומי ההידרוג'ל לשליפת ספרואידים עלול להוביל לירידה בכדאיות התאים ולאובדן ספרואידי פוטנציאלי. בנוסף, נפח פיגום GelMA צריך להיות בטווח של מספר מילימטרים כדי לאפשר חדירת חומרי מזון ותמורה לתאים העטופים. גודל הפיגום המוגבל בטווח המילימטרי יכול להגביל את תפוקת הייצור של ספרואידים תאיים, גם אם פיגומים גדולים יותר מיוצרים בתחילה ולאחר מכן נחתכים לחתיכות קטנות יותר. מאמצים עתידיים עשויים להתמקד בשמירה על אגרגטים של תאים שהורכבו אקוסטית באתרם, תלויים בתווך התרבית, כדי לאפשר להם לגדול לספרואידים ללא צורך בפיגום חיצוני.

לסיכום, ניתן להרכיב ולהפעיל בקלות את התקן ההרכבה האקוסטית המתואר בפרוטוקול זה בצעדים פשוטים יחסית, מה שמציע את היתרון של ייצור יעיל של ספרואידים תאיים. יתר על כן, התקן הרכבה אקוסטית זה תואם לסוגי תאים שונים, כולל ייצור אורגנואידים, ומציג את הפוטנציאל המשמעותי שלו למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודת TIS נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFA1104600), והקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג של סין (LQ23H160011).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm filter Merck SLGSM33SS Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish Corning 430165 Used for culturing cells
Confocal microscope Nikon A1RHD25 Fluorescent cell observation
DiO dye Beyotime C1038 Dye used to stain cells
DMEM Gibco 12430054 Cell culture media
FBS Gibco 10099141C Cell culture media supplement
Function generator Rigol DG5352 For RF signal generation
GelMA Regenovo none Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer EFL EFL-GM-LS-001 Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope Nikon Ti-U Cell observation
LAP Sigma-Aldrich 900889 Used as photoinitiator
Live-Dead kit Beyotime C2015M Cell vability analysis
PBS Gibco 10010002 Used as buffer
Penicillin-streptomycin Gibco 15070063 Prevent cell culture contamination
Power amplifer Minicircuit LCY-22+ Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. PZT-41 Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask Corning 430639 Used for culturing cells
Trypan blue  Gibco 15250061 Cell counting
Trypsin-EDTA  Gibco 25200056 Cell dissociation enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
  4. Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
  5. Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
  6. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
  7. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
  8. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  9. Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
  10. Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
  11. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
  12. Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
  13. Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
  14. Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
  15. Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
  16. Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
  17. Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
  18. Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
  19. Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
  20. Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
  21. Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
  22. Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
  23. Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
  24. Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
  25. Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
  26. Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
  27. Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
  28. Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
  29. Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
  30. Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 200 ייצור המוני שדות ביולוגיים איכות גבוהה תפוקה גבוהה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת תא פולימתיל מתקרילט מרובע בלוטות אקוסטיות מרחפות תמיסת GelMA UV-photocured crosslinked פיגומים צמיחה של אגרגטים תאים ספרואידים בוגרים ייצור בקנה מידה אורגנואידים טכנולוגיה פוטנציאלית
התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M.… More

Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids. J. Vis. Exp. (200), e66078, doi:10.3791/66078 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter