Tredimensjonal akustisk monteringsanordning for masseproduksjon av cellesfæroider
Summary
Celle sfæroider har blitt ansett som en potensiell modell innen biologiske applikasjoner. Denne artikkelen beskriver protokoller for skalerbart generering av cellesfæroider ved hjelp av en 3D-akustisk monteringsenhet, som gir en effektiv metode for robust og rask fabrikasjon av ensartede cellesfæroider.
Abstract
Cellesfæroider er lovende tredimensjonale (3D) modeller som har fått brede anvendelser på mange biologiske felt. Denne protokollen presenterer en metode for produksjon av høykvalitets og høy gjennomstrømningscelle sfæroider ved hjelp av en 3D akustisk monteringsenhet gjennom manøvrerbare prosedyrer. Den akustiske monteringsanordningen består av tre blyzirkoniumtitanattransdusere (PZT), hver arrangert i X/Y/Z-planet i et kvadratisk polymetylmetakrylatkammer (PMMA). Denne konfigurasjonen gjør det mulig å generere et 3D-dot-array-mønster av leviterte akustiske noder (LAN) når tre signaler brukes. Som et resultat kan celler i gelatinmetakryloylløsningen (GelMA) drives til LAN og danne ensartede celleaggregater i tre dimensjoner. GelMA-løsningen blir deretter UV-fotoherdet og tverrbundet for å tjene som et stillas som støtter veksten av celleaggregater. Til slutt oppnås masser av modne sfæroider og hentes ved deretter å løse opp GelMA-stillasene under milde forhold. Den foreslåtte nye 3D akustiske cellemonteringsenheten vil muliggjøre oppskaleringsfabrikasjon av cellesfæroider, og til og med organoider, og tilbyr stor potensiell teknologi i det biologiske feltet.
Introduction
3D in vitro kulturmodeller, som gir mer in vivo-lignende strukturelle og morfologiske egenskaper sammenlignet med konvensjonelle 2D-kulturmodeller, har blitt anerkjent som lovende systemer i ulike biomedisinske applikasjoner som vevsteknikk, sykdomsmodellering og legemiddelscreening 1,2,3. Som en type 3D-kulturmodell refererer cellesfæroider vanligvis til celleaggregering, og skaper 3D-sfæroidale strukturer preget av forbedrede cellecelle- og cellematriseinteraksjoner 4,5,6. Derfor har fabrikasjon av cellesfæroider blitt et kraftig verktøy for å muliggjøre ulike biologiske studier.
Ulike teknikker, inkludert hengende dråpe7, ikke-klebende plater8 eller mikrobrønninnretninger9, er utviklet for å oppnå sfæroider. I prinsippet letter disse metodene vanligvis cellemontering ved å utnytte fysiske krefter som gravitasjonskraft samtidig som interaksjoner mellom celler og substratet minimeres. Imidlertid involverer de ofte arbeidsintensive prosesser, har lav produktivitet og utgjør utfordringer for å kontrollere sfæroidstørrelse10,11. Det er viktig at produksjonen av sfæroider med ønsket størrelse og ensartethet i tilstrekkelig mengde er av største betydning for å tilfredsstille spesifikke biologiske anvendelser. I motsetning til de ovennevnte metodene har akustiske bølger, som en type ekstern-kraftdrevet teknikk 12,13,14, vist potensial for masseproduksjon av cellesfæroider med høy kvalitet og gjennomstrømning, basert på prinsippet om å øke celleaggregering gjennom eksterne krefter 15,16,17,18. I motsetning til elektromagnetiske eller magnetiske krefter er akustisk-baserte cellemanipulasjonsteknikker ikke-invasive og etikettfrie, noe som muliggjør sfæroiddannelse med utmerket biokompatibilitet19,20.
Vanligvis har stående overflateakustiske bølger (SAW) og bulk akustiske bølger (BAWs) -baserte enheter blitt utviklet for å generere sfæroider, ved hjelp av akustiske noder (AN) produsert av tilsvarende stående akustiske felt 21,22,23. Spesielt akustiske monteringsenheter basert på BAW-er, med fordelene ved praktisk produksjon, enkel betjening og utmerket skalerbarhet, har fått oppmerksomhet for å fremstille cellesfæroider 24,25. Vi har nylig utviklet en facile BAWs-basert akustisk monteringsenhet med muligheten til å generere sfæroider med høy gjennomstrømning26. Den foreslåtte anordningen består av et kvadratisk polymetylmetakrylatkammer (PMMA) med tre blyzirkonattitanattransdusere (PZT) arrangert henholdsvis i X/Y/Z-planet. Dette arrangementet gjør det mulig å opprette et 3D-dot-array-mønster av leviterte akustiske noder (LAN) for å drive cellesamling. Sammenlignet med tidligere rapporterte BAWs- eller SAWs-baserte enheter, som bare kan lage et 1D- eller 2D-array av ANs 27,28,29, muliggjør den nåværende enheten en 3D-dot-array av LAN for rask celleaggregatdannelse i gelatinmetakryloylløsningen (GelMA). Deretter modnet celleaggregater til sfæroider med høy levedyktighet i de fotoherdede GelMA-stillasene etter tre dager med dyrking. Endelig ble et stort antall sfæroider med ensartet størrelse lett oppnådd fra GelMA-stillasene for nedstrøms applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiv og stabil fabrikasjon av celle sfæroider med høy gjennomstrømning ved hjelp av teknologier som 3D akustisk monteringsenhet holder stort løfte om å fremme biomedisinsk ingeniørfag og narkotika screening 1,2,3. Denne tilnærmingen forenkler masseproduksjonen av cellesfæroider gjennom enkle prosedyrer.
Det er imidlertid kritiske faktorer å vurdere når du bruker denne akustiske enheten. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600), og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
