Summary
Celle sfæroider har blitt ansett som en potensiell modell innen biologiske applikasjoner. Denne artikkelen beskriver protokoller for skalerbart generering av cellesfæroider ved hjelp av en 3D-akustisk monteringsenhet, som gir en effektiv metode for robust og rask fabrikasjon av ensartede cellesfæroider.
Abstract
Cellesfæroider er lovende tredimensjonale (3D) modeller som har fått brede anvendelser på mange biologiske felt. Denne protokollen presenterer en metode for produksjon av høykvalitets og høy gjennomstrømningscelle sfæroider ved hjelp av en 3D akustisk monteringsenhet gjennom manøvrerbare prosedyrer. Den akustiske monteringsanordningen består av tre blyzirkoniumtitanattransdusere (PZT), hver arrangert i X/Y/Z-planet i et kvadratisk polymetylmetakrylatkammer (PMMA). Denne konfigurasjonen gjør det mulig å generere et 3D-dot-array-mønster av leviterte akustiske noder (LAN) når tre signaler brukes. Som et resultat kan celler i gelatinmetakryloylløsningen (GelMA) drives til LAN og danne ensartede celleaggregater i tre dimensjoner. GelMA-løsningen blir deretter UV-fotoherdet og tverrbundet for å tjene som et stillas som støtter veksten av celleaggregater. Til slutt oppnås masser av modne sfæroider og hentes ved deretter å løse opp GelMA-stillasene under milde forhold. Den foreslåtte nye 3D akustiske cellemonteringsenheten vil muliggjøre oppskaleringsfabrikasjon av cellesfæroider, og til og med organoider, og tilbyr stor potensiell teknologi i det biologiske feltet.
Introduction
3D in vitro kulturmodeller, som gir mer in vivo-lignende strukturelle og morfologiske egenskaper sammenlignet med konvensjonelle 2D-kulturmodeller, har blitt anerkjent som lovende systemer i ulike biomedisinske applikasjoner som vevsteknikk, sykdomsmodellering og legemiddelscreening 1,2,3. Som en type 3D-kulturmodell refererer cellesfæroider vanligvis til celleaggregering, og skaper 3D-sfæroidale strukturer preget av forbedrede cellecelle- og cellematriseinteraksjoner 4,5,6. Derfor har fabrikasjon av cellesfæroider blitt et kraftig verktøy for å muliggjøre ulike biologiske studier.
Ulike teknikker, inkludert hengende dråpe7, ikke-klebende plater8 eller mikrobrønninnretninger9, er utviklet for å oppnå sfæroider. I prinsippet letter disse metodene vanligvis cellemontering ved å utnytte fysiske krefter som gravitasjonskraft samtidig som interaksjoner mellom celler og substratet minimeres. Imidlertid involverer de ofte arbeidsintensive prosesser, har lav produktivitet og utgjør utfordringer for å kontrollere sfæroidstørrelse10,11. Det er viktig at produksjonen av sfæroider med ønsket størrelse og ensartethet i tilstrekkelig mengde er av største betydning for å tilfredsstille spesifikke biologiske anvendelser. I motsetning til de ovennevnte metodene har akustiske bølger, som en type ekstern-kraftdrevet teknikk 12,13,14, vist potensial for masseproduksjon av cellesfæroider med høy kvalitet og gjennomstrømning, basert på prinsippet om å øke celleaggregering gjennom eksterne krefter 15,16,17,18. I motsetning til elektromagnetiske eller magnetiske krefter er akustisk-baserte cellemanipulasjonsteknikker ikke-invasive og etikettfrie, noe som muliggjør sfæroiddannelse med utmerket biokompatibilitet19,20.
Vanligvis har stående overflateakustiske bølger (SAW) og bulk akustiske bølger (BAWs) -baserte enheter blitt utviklet for å generere sfæroider, ved hjelp av akustiske noder (AN) produsert av tilsvarende stående akustiske felt 21,22,23. Spesielt akustiske monteringsenheter basert på BAW-er, med fordelene ved praktisk produksjon, enkel betjening og utmerket skalerbarhet, har fått oppmerksomhet for å fremstille cellesfæroider 24,25. Vi har nylig utviklet en facile BAWs-basert akustisk monteringsenhet med muligheten til å generere sfæroider med høy gjennomstrømning26. Den foreslåtte anordningen består av et kvadratisk polymetylmetakrylatkammer (PMMA) med tre blyzirkonattitanattransdusere (PZT) arrangert henholdsvis i X/Y/Z-planet. Dette arrangementet gjør det mulig å opprette et 3D-dot-array-mønster av leviterte akustiske noder (LAN) for å drive cellesamling. Sammenlignet med tidligere rapporterte BAWs- eller SAWs-baserte enheter, som bare kan lage et 1D- eller 2D-array av ANs 27,28,29, muliggjør den nåværende enheten en 3D-dot-array av LAN for rask celleaggregatdannelse i gelatinmetakryloylløsningen (GelMA). Deretter modnet celleaggregater til sfæroider med høy levedyktighet i de fotoherdede GelMA-stillasene etter tre dager med dyrking. Endelig ble et stort antall sfæroider med ensartet størrelse lett oppnådd fra GelMA-stillasene for nedstrøms applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av 3D akustisk monteringsenhet
- Begynn med å forberede fire 1 mm tykke PMMA-ark gjennom laserskjæring30, og fortsett deretter med å lim dem sammen for å danne et firkantet kammer med en indre bredde på 21 mm og en høyde på 10 mm.
- Fest deretter et annet 1 mm tykt PMMA-ark til bunnen av kammeret for å tjene som holder for bioblekket.
- Fest forsiktig tre blyzirkoniumtitanattransdusere (PZT) (hver på 20 mm i lengde, 10 mm i bredde, 0,7 mm i tykkelse og med en primær resonansfrekvens på 3 MHz, se materialfortegnelse) på utsiden av henholdsvis de tre ortogonale veggene i kammeret. Forsikre deg om at den nederste PZT-svingeren er sentrert under kammeret.
- Loddetråder til de to ledende områdene på hver PZT-svinger.
- Til slutt, fest enheten på en hul base for å forhindre at bunn-PZT kommer i kontakt med andre benkeplater.
2. Sette opp det akustiske monteringssystemet
- Begynn med å montere den akustiske enheten på et mikroskoptrinn, noe som muliggjør toppvisning av kammerets indre.
- Plasser et digitalt mikroskop på siden av enheten som er fri for PZT-svingere, slik at du kan observere kammerets indre på siden.
- Koble ledningene fra de tre PZT-svingerne i serie til tre effektforsterkere og tre utgangskanaler for funksjonsgeneratorer (se Materialfortegnelse).
- Programmer innstillingene på funksjonsgeneratorene for hver PZT-svinger, og spesifiser parametere som sinusformet bølgeform, frekvens og amplitude.
- For å sikre sterilisering, fyll kammeret til den akustiske enheten med 75% alkohol i 5 minutter, etterfulgt av en grundig rengjøring med steril PBS-løsning. Deretter bestråles kammeret med UV-lys i en ren benk i minst 1 time.
3. Cellekultur og høstprosedyre
- Begynn med å dyrke C3A-celler, en human hepatocellulær karsinomcellelinje, i en T25-cellekulturkolbe ved bruk av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (se materialtabell).
- Når C3A-cellene når ca. 80% sammenløp, utfør cellepassasje som følger: vask først bunnen av kulturkolben to ganger med PBS. Deretter tilsettes 2 ml 0,05% trypsin-EDTA til cellekulturkolben og inkuberer ved 37 °C for å lette celleløsningen. Stopp trypsiniseringsprosessen ved å legge til 2 ml komplett kulturmedium.
- Overfør celleoppløsningen til et 15 ml rør, og sentrifuger den ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur for å oppnå en cellepellet.
4. Tilberedning av bioblekket
- Klargjør en 6 % (w/v) GelMA-oppløsning inneholdende 0,5 % (w/v) litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfat (LAP) ved å oppløse 0,3 g GelMA og 0,025 g LAP (se materialtabell) i 5 ml fosfatbufferløsning (PBS). La blandingen sitte i et vannbad på 47 °C i 1 time.
- Før du blander med celler, pass GelMA-oppløsningen gjennom et 0,22 μm filter (se materialfortegnelse) for sterilisering.
- Resuspender cellepelleten nevnt ovenfor (trinn 3.3) i cellekulturmedium. Flekk et lite volum celler med en 0,4% trypanblå løsning og bruk deretter et rent hemocytometer for celletelling.
- Bland en passende mengde C3A-celler, beregnet basert på celletettheten oppnådd ovenfor, med den steriliserte GelMA-løsningen for å fremstille bioblekket med en celletetthet på 2 × 106 celler / ml.
- For visualisering av de sammensatte cellesfæroidene, forhåndsflekk C3A-celler ved å inkubere dem med 2 μM cellesporing (DiO-fargestoff, se materialfortegnelse) ved 37 °C i 20 minutter. Deretter vaskes de merkede cellene med fersk cellekulturmedium tre ganger før bruk.
5. Montering av cellesfæroidene ved hjelp av den akustiske enheten
- Pipette mer enn 1 ml av bioblekket inn i det steriliserte kammeret. Sørg for at avstanden ansikt til ansikt mellom væskeoverflaten og kammerbunnen er et heltallsmultiplum på halvparten av den akustiske bølgelengden.
MERK: Man kan kontrollere denne avstanden ved å justere volumet av tilsatt bioblekk. Den akustiske bølgelengden (λ) kan estimeres ved hjelp av formelen λ = c/f, hvor c representerer lydhastigheten i mediet, og f er frekvensen til PZT-svingeren. - Slå på funksjonsgeneratoren og effektforsterkeren for å starte aktiveringen av hver PZT-svinger.
MERK: Det anbefales å aktivere hver PZT-svinger individuelt først for å oppnå det optimale parallelle cellemønsteret. Dette kan oppnås ved å gjennomføre et frekvenssveip med en trinnstørrelse på 0,001 MHz nær den primære resonansfrekvensen for hver PZT-svinger. Etterpå bruker du samtidig disse optimale signalene på alle tre PZT-transduserne for å oppnå det forventede 3D-punkts cellulære mønsteret. Før du bruker hvert inngangssignal, må du sørge for at cellene er jevnt fordelt i bioblekket ved forsiktig omrøring. - Kryssbind bioblekket ved hjelp av blått lys (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) for å lage et 3D-hydrogelstillas som innkapsler celleaggregatene montert akustisk. Etterpå slår du av funksjonsgeneratoren og effektforsterkeren.
- Overfør forsiktig 3D-hydrogelstillaset fra kammeret til en petriskål og kutt det i små biter (f.eks. 2 mm × 2 mm × 2 mm) ved hjelp av en ren barberhøvel.
- Legg til cellekulturmedium for dyrking.
MERK: Husk å bytte kulturmedium hver dag.
6. Henter celle sfæroider
- Begynn med å observere sfæroiddannelse på forskjellige lag av stillasene ved hjelp av et omvendt mikroskop.
- Etter 3 dager med kultur, fjern kulturmediet og vask hydrogelstillasene grundig to ganger med PBS.
- Inkuber stillasene med mer enn 2 ml GelMA lysisbuffer ved en 1: 200 fortynning med cellekulturmedium i 30 minutter i en celleinkubator. Dette trinnet tar sikte på å løse opp hydrogelstillasene.
- Overfør løsningen fra forrige trinn til et rør og sentrifuge den deretter ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur for å oppnå cellesfæroidpelleten.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i ferskt kulturmedium for nedstrøms applikasjoner.
7. Sfærisk levedyktighetsanalyse
- Vurder levedyktigheten til cellesfæroider enten i hydrogelstillasene eller i de hentede sfæroidene ved hjelp av et levende / dødt fargesett (se materialtabell).
- Inkuber prøvene ved forskjellige dyrkningstidspunkter med 1 ml PBS-oppløsning inneholdende 1 μl kalcein-AM og 2 mikrol propidiumjodid (PI) i 15 minutter ved 37 °C.
- For prøver i hydrogelstillasene, vask dem direkte med PBS to ganger. For hentet sfæroider, sentrifuge ved 200 × g i 5 min ved romtemperatur for å oppnå en sfæroid pellet, og vask den to ganger før observasjon.
- Observer prøvene ved hjelp av et fluorescensmikroskop og ta fluorescensbildene.
- Beregn forholdet mellom området farget med Calcein-AM til det totale arealet farget med både Calcein-AM og PI ved hjelp av ImageJ for å bestemme sfæroid levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien utviklet en 3D akustisk monteringsenhet for masseproduksjon av cellesfæroider. Den akustiske innretningen besto av et kvadratisk kammer med to PZT-transdusere festet til X-planet og Y-planet på kammerets ytre overflate og en PZT-svinger på kammerets bunn (figur 1A,B). Tre utgangskanaler fra to funksjonsgeneratorer ble koblet til tre effektforsterkere for å generere tre uavhengige sinusformede signaler for å aktivere PZT-transduserne (figur 1C).
De optimale resonansfrekvensene som ble brukt til å aktivere de tre PZT-transduserne festet til X/Y/Z-planene i kammeret var henholdsvis 3,209 MHz, 3,283 MHz og 3,215 MHz. Den optimale amplituden for alle tre PZT-transduserne var 10 peak-to-peak utgangsspenning (Vpp), målt med et oscilloskop. Figur 2A illustrerer arbeidsmekanismen til celleaggregater generert ved hjelp av den akustiske 3D-monteringsenheten. Når signalet påføres, blir cellene drevet til de akustiske noder under påvirkning av akustisk strålingskraft (ARF). For å visualisere cellesfæroider ble cellene forhåndsfarget med 2 μM DiO (grønn fluorescens). Etter akustisk cellemontering ble et konfokalmikroskop brukt til å observere de 3D-akustisk sammensatte celleaggregatene. Disse celleaggregatene ble observert å være arrangert i et vanlig 3D-punkts array-mønster med ensartede grønne fluorescerende signaler (figur 2B). Ulike toppvisninger av lysfeltbilder viste også at de dannede aggregatene i hvert lag var arrangert i et 2D-punkts matrisemønster (figur 2C).
Veksten av celleaggregater i hydrogelen på forskjellige tidspunkter ble observert. Resultatene viste at de samlede aggregatene gradvis integrerte seg og dannet tette sfæroider ved dag 3, ledsaget av en økning i sfæroiddiameter (figur 3A,B). En levende / død farging ble utført for å evaluere levedyktigheten til cellesfæroidene. Gode cellelevedyktigheter (>90 %) ble oppnådd før dag 3, mens levedyktigheten ble noe redusert etter en uke med dyrkning (figur 3C,D).
For uthenting av sfæroider ble en GelMA-lysisbuffer brukt til å dissosiere hydrogelstillasene, og frigjøre de innkapslede cellesfæroidene (figur 4A). Etter tre dagers dyrkning ble derfor de små hydrogelstillasbitene behandlet med GelMA-lysisbuffer ved 37 °C i 30 minutter. De frigjorte sfæroidene opprettholdt en god sfærisk morfologi med en smal størrelsesfordeling, sammen med uttrykket av albumin og ønskelig levedyktighet (figur 4B-D).
Figur 1: 3D akustisk monteringsenhet. (A) Skjematisk diagram som viser toppvisningen av den akustiske 3D-monteringsenheten, bestående av et PMMA-kammer festet med tre PZT-svingere. (B) Fotografi som viser den faktiske akustiske 3D-monteringsenheten. (C) Fotografi som viser den akustiske 3D-monteringsenheten koblet til to funksjonsgeneratorer og tre effektforsterkere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Akustisk sammensatte celleaggregater. (A) Skjematisk illustrerer arbeidsmekanismen til celleaggregater generert av den akustiske 3D-monteringsenheten, hvor celler drives til de akustiske nodene av akustisk strålingskraft. (B) Konfokale bilder som viser 3D akustisk sammensatte celleaggregater fra forskjellige perspektiver. (C) Lysfeltbilder som viser de dannede celleaggregatene i forskjellige lag i hydrogelstillaset. Skalastangen representerer 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vekst av celleaggregater til sfæroider i GelMA-stillaset. (A) Lysfeltbilder som viser dannelsen av kompaktcellesfæroider etter en 3-dagers kulturperiode. (B) Kvantifisering av sfæroidstørrelser. (C) Levende/død farging av sfæroider i hydrogelstillaset etter en ukes dyrkning. (D) Kvantifisering av cellesfæroid levedyktighet. Skalastangen representerer 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Henting av akustisk fremstilte cellesfæroider. (A) Illustrasjon som viser trinnene for å hente akustisk fremstilte cellesfæroider. (B) Bilder i lysfelt som viser de hentede sfæroidene ved forskjellige forstørrelser. Skalastangen representerer 250 μm. (C) Analyse av levedyktighet og funksjonalitet av de hentede sfæroidene. Skalastangen representerer 100 μm. (D) Størrelsesfordeling av sfæroidene etter gjenfinning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv og stabil fabrikasjon av celle sfæroider med høy gjennomstrømning ved hjelp av teknologier som 3D akustisk monteringsenhet holder stort løfte om å fremme biomedisinsk ingeniørfag og narkotika screening 1,2,3. Denne tilnærmingen forenkler masseproduksjonen av cellesfæroider gjennom enkle prosedyrer.
Det er imidlertid kritiske faktorer å vurdere når du bruker denne akustiske enheten. Opprettelsen av stående bølger er avgjørende for å konstruere et akustisk felt med 3D-punkter. I denne enheten er bare en PZT-svinger tilstede i hver dimensjon, som fungerer som en lydeksitasjonskilde. For hver dimensjon er det derfor avgjørende at avstanden ansikt til ansikt mellom de motsatte veggene i PMMA-kammeret eller PMMA-vannoverflaten er et heltallsmultiplum av halvparten av bølgelengden. Den primære frekvensen til PZT-transduserne vi brukte er 1 MHz, noe som resulterer i en bølgelengde i vannet eller bioblekket på ca. 500 μm. For den horisontale dimensjonen ble følgelig avstanden mellom de to motsatte veggene i PMMA-kammeret i den akustiske enheten satt til 21 mm, noe som tar hensyn til størrelsen på PZT-transduserne. For den vertikale dimensjonen kan avstanden ansikt til ansikt mellom den nederste PMMA-veggen og vannoverflaten justeres ved å variere bioblekkvolumet for å oppfylle betingelsene for dannelse av stående bølger. Under eksperimentell drift kan det være nødvendig med små frekvensjusteringer for å kompensere for avstandsavvik. I tillegg er det viktig å holde inngangsspenningen på et moderat nivå for å forhindre overoppheting av PZT-transduseren, noe som kan varme opp bioblekket og potensielt skade cellene. I forsøkene ble det brukt en topp-til-toppspenning på 10 Vpp, som fullførte celleaggregatmontering innen 30 s mens bioblekktemperaturen ble opprettholdt under 30 ° C.
En begrensning av denne tilnærmingen er avhengigheten av GelMA-stillaset26, som spiller en avgjørende rolle i å opprettholde den strukturelle integriteten til de akustisk monterte celleaggregatene når de modnes til cellesfæroider når det akustiske feltet fjernes. Imidlertid kan trinnet som involverer oppløsning av hydrogelstillasene for sfæroiduthenting føre til redusert cellelevedyktighet og potensielt sfæroidtap. I tillegg må volumet av GelMA-stillaset være innenfor området på flere millimeter for å tillate næringsinntrengning og utveksling for de innkapslede cellene. Den begrensede stillasstørrelsen i millimeterområdet kan begrense produksjonsutbyttet av cellesfæroider, selv om større stillaser først produseres og deretter kuttes i mindre biter. Fremtidig innsats kan fokusere på å opprettholde akustisk monterte celleaggregater in situ, suspendert i kulturmediet, slik at de kan vokse til sfæroider uten behov for et eksternt stillas.
Oppsummert kan den akustiske monteringsanordningen beskrevet i denne protokollen enkelt monteres og betjenes med relativt enkle trinn, noe som gir fordelen av effektivt å fremstille cellesfæroider. Dessuten er denne akustiske monteringsenheten kompatibel med forskjellige celletyper, inkludert fremstilling av organoider, og viser sitt betydelige potensial for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600), og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
