Summary
Celsferoïden worden beschouwd als een potentieel model op het gebied van biologische toepassingen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het schaalbaar genereren van celsferoïden met behulp van een 3D akoestisch assemblageapparaat, dat een efficiënte methode biedt voor de robuuste en snelle fabricage van uniforme celsferoïden.
Abstract
Celsferoïden zijn veelbelovende driedimensionale (3D) modellen die brede toepassingen hebben gekregen in veel biologische gebieden. Dit protocol presenteert een methode voor het vervaardigen van hoogwaardige celsferoïden met een hoge doorvoer met behulp van een 3D akoestisch assemblageapparaat door middel van manoeuvreerbare procedures. Het akoestische assemblageapparaat bestaat uit drie loodzirkonaattitanaat (PZT)-transducers, elk gerangschikt in het X/Y/Z-vlak van een vierkante polymethylmethacrylaatkamer (PMMA). Deze configuratie maakt het mogelijk om een 3D dot-array-patroon van zwevende akoestische knooppunten (LAN's) te genereren wanneer drie signalen worden toegepast. Als gevolg hiervan kunnen cellen in de gelatinemethacryloyl (GelMA)-oplossing naar de LAN's worden gedreven, waardoor uniforme celaggregaten in drie dimensies worden gevormd. De GelMA-oplossing wordt vervolgens UV-gefotocureerd en verknoopt om te dienen als een steiger die de groei van celaggregaten ondersteunt. Ten slotte worden massa's gerijpte sferoïden verkregen en opgehaald door de GelMA-steigers vervolgens onder milde omstandigheden op te lossen. Het voorgestelde nieuwe 3D-apparaat voor de assemblage van akoestische cellen zal de opschaling van de fabricage van celsferoïden en zelfs organoïden mogelijk maken, wat een groot potentieel biedt voor technologie op biologisch gebied.
Introduction
3D in vitro kweekmodellen, die meer in vivo-achtige structurele en morfologische kenmerken bieden in vergelijking met conventionele 2D-kweekmodellen, zijn erkend als veelbelovende systemen in verschillende biomedische toepassingen zoals weefselmanipulatie, ziektemodellering en screening van geneesmiddelen 1,2,3. Als een type 3D-kweekmodel verwijzen celsferoïden meestal naar celaggregatie, waardoor 3D-sferoïdale structuren ontstaan die worden gekenmerkt door verbeterde cel-cel- en cel-matrixinteracties 4,5,6. Daarom is het fabriceren van celsferoïden een krachtig hulpmiddel geworden om diverse biologische studies mogelijk te maken.
Er zijn verschillende technieken ontwikkeld, waaronder hangende druppel7, niet-klevende platen8 of microtiterapparaten9, om sferoïden te verkrijgen. In principe vergemakkelijken deze methoden gewoonlijk de celassemblage door gebruik te maken van fysieke krachten zoals zwaartekracht, terwijl interacties tussen cellen en het substraat worden geminimaliseerd. Ze hebben echter vaak betrekking op arbeidsintensieve processen, hebben een lage productiviteit en vormen een uitdaging voor het beheersen van de sferoïde grootte10,11. Belangrijk is dat de productie van sferoïden met de gewenste grootte en uniformiteit in voldoende hoeveelheid van het grootste belang is om aan specifieke biologische toepassingen te voldoen. In tegenstelling tot de bovengenoemde methoden hebben akoestische golven, als een type externe-kracht-aangedreven techniek 12,13,14, potentieel getoond voor massaproductie van celsferoïden met hoge kwaliteit en doorvoer, gebaseerd op het principe van het verbeteren van celaggregatie door externe krachten 15,16,17,18. In tegenstelling tot elektromagnetische of magnetische krachten zijn op akoestiek gebaseerde celmanipulatietechnieken niet-invasief en labelvrij, waardoor sferoïde vorming met uitstekende biocompatibiliteit mogelijk is19,20.
Gewoonlijk zijn op staande oppervlaktegolven (SAW's) en op bulk akoestische golven (BAW's) gebaseerde apparaten ontwikkeld om sferoïden te genereren, gebruikmakend van de akoestische knooppunten (AN's) die worden geproduceerd door overeenkomstige staande akoestische velden 21,22,23. Met name akoestische assemblageapparaten op basis van BAW's, met de verdiensten van gemakkelijke fabricage, eenvoudige bediening en uitstekende schaalbaarheid, hebben aandacht gekregen voor het vervaardigen van celsferoïden 24,25. We hebben onlangs een eenvoudig akoestisch assemblageapparaat op basis van BAW's ontwikkeld met de mogelijkheid om sferoïden te genereren met een hoge doorvoer26. Het voorgestelde apparaat bestaat uit een vierkante polymethylmethacrylaat (PMMA)-kamer met drie loodzirkonaattitanaat (PZT)-transducers die respectievelijk in het X/Y/Z-vlak zijn gerangschikt. Deze opstelling maakt het mogelijk om een 3D-dot-array-patroon van zwevende akoestische knooppunten (LAN's) te creëren voor het aansturen van celassemblage. Vergeleken met eerder gerapporteerde BAW's- of SAW's-gebaseerde apparaten, die alleen een 1D- of 2D-array van AN's 27,28,29 kunnen maken, maakt het huidige apparaat een 3D-dot-array van LAN's mogelijk voor snelle vorming van celaggregaat in de gelatinemethacryloyl (GelMA)-oplossing. Vervolgens rijpten celaggregaten na drie dagen cultivatie tot sferoïden met een hoge levensvatbaarheid in de gefotocureerde GelMA-steigers. Ten slotte kon een groot aantal sferoïden met uniforme grootte gemakkelijk worden verkregen uit de GelMA-steigers voor stroomafwaartse toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van het 3D akoestisch assemblageapparaat
- Begin met het voorbereiden van vier PMMA-platen van 1 mm dik door middel van lasersnijden30 en lijm ze vervolgens aan elkaar om een vierkante kamer te vormen met een binnenbreedte van 21 mm en een hoogte van 10 mm.
- Bevestig vervolgens nog een PMMA-vel van 1 mm dik op de bodem van de kamer om als houder voor de bioinkt te dienen.
- Bevestig voorzichtig drie loodzirkonaattitanaat (PZT)-transducers (elk met een lengte van 20 mm, een breedte van 10 mm, een dikte van 0,7 mm en een primaire resonantiefrequentie van 3 MHz, zie de materiaaltabel) aan de buitenkant van de drie orthogonale wanden van de kamer. Zorg ervoor dat de onderste PZT-transducer gecentreerd is onder de kamer.
- Soldeer draden aan de twee geleidende gebieden van elke PZT-transducer.
- Bevestig het apparaat ten slotte op een holle basis om te voorkomen dat de onderste PZT in contact komt met andere werkbladen.
2. Opzetten van het akoestisch montagesysteem
- Begin met het monteren van het akoestische apparaat op een microscooptafel, zodat het inwendige van de kamer van bovenaf kan worden waargenomen.
- Plaats een digitale microscoop aan de zijkant van het apparaat die vrij is van PZT-transducers, zodat het inwendige van de kamer van opzij kan worden waargenomen.
- Sluit de draden van de drie PZT-transducers onafhankelijk in serie aan op drie eindversterkers en drie uitgangskanalen van functiegeneratoren (zie Materiaaltabel).
- Programmeer de instellingen op de functiegeneratoren voor elke PZT-transducer en specificeer parameters zoals sinusvormige golfvorm, frequentie en amplitude.
- Om sterilisatie te garanderen, vult u de kamer van het akoestische apparaat gedurende 5 minuten met 75% alcohol, gevolgd door een grondige reiniging met een steriele PBS-oplossing. Bestraal de kamer vervolgens minimaal 1 uur met UV-licht op een schone bank.
3. Celkweek- en oogstprocedure
- Begin met het kweken van C3A-cellen, een menselijke hepatocellulaire carcinoomcellijn, in een T25-celkweekkolf met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine (zie materiaaltabel).
- Wanneer de C3A-cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, voert u de celpassage als volgt uit: was eerst de bodem van de kweekkolf twee keer met PBS. Voeg vervolgens 2 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan de celkweekkolf en incubeer bij 37 °C om de celloslating te vergemakkelijken. Stop het trypsinisatieproces door 2 ml volledig kweekmedium toe te voegen.
- Breng de celoplossing over in een buis van 15 ml en centrifugeer deze bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te verkrijgen.
4. Bereiding van de bio-inkt
- Bereid een 6% (m/v) GelMA-oplossing met 0,5% (m/v) lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) door 0,3 g GelMA en 0,025 g LAP (zie materiaaltabel) op te lossen in 5 ml fosfaatbufferoplossing (PBS). Laat het mengsel 1 uur in een waterbad van 47 °C staan.
- Voordat u met cellen mengt, moet de GelMA-oplossing door een filter van 0,22 μm (zie Materiaaltabel) worden geleid voor sterilisatie.
- Resuspendeer de hierboven genoemde celpellet (stap 3.3) in het celkweekmedium. Kleur een klein aantal cellen met een 0,4% trypanblauwe oplossing en gebruik vervolgens een schone hemocytometer voor het tellen van cellen.
- Meng een geschikte hoeveelheid C3A-cellen, berekend op basis van de hierboven verkregen celdichtheid, met de gesteriliseerde GelMA-oplossing om de bioink te bereiden met een celdichtheid van 2 × 106 cellen/ml.
- Voor de visualisatie van de geassembleerde celsferoïden moet C3A-cellen vooraf worden gekleurd door ze gedurende 20 minuten te incuberen met een 2 μM-celtracker (DiO-kleurstof, zie materiaaltabel) bij 37 °C. Was vervolgens de gelabelde cellen voor gebruik drie keer met vers celkweekmedium.
5. Montage van de celsferoïden met behulp van het akoestische apparaat
- Pipetteer meer dan 1 ml van de bioinkt in de gesteriliseerde kamer. Zorg ervoor dat de face-to-face afstand tussen het vloeistofoppervlak en de kamerbodem een geheel veelvoud is van de helft van de akoestische golflengte.
OPMERKING: Men kan deze afstand regelen door het volume van de toegevoegde bioinkt aan te passen. De akoestische golflengte (λ) kan worden geschat met behulp van de formule λ = c/f, waarbij c staat voor de geluidssnelheid in het medium en f voor de frequentie van de PZT-transducer. - Schakel de functiegenerator en de eindversterker in om de activering van elke PZT-transducer te starten.
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om elke PZT-transducer eerst afzonderlijk te bedienen om het optimale parallelle celpatroon te bereiken. Dit kan worden bereikt door een frequentiesweep uit te voeren met een stapgrootte van 0,001 MHz in de buurt van de primaire resonantiefrequentie voor elke PZT-transducer. Pas daarna deze optimale signalen tegelijkertijd toe op alle drie de PZT-transducers om het verwachte cellulaire patroon met 3D-stippen te verkrijgen. Voordat u elk ingangssignaal toepast, moet u ervoor zorgen dat de cellen gelijkmatig in de bioink worden verspreid door zachtjes te roeren. - Verknoop de bioink met behulp van blauw licht (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) om een 3D-hydrogelsteiger te creëren die de akoestisch geassembleerde celaggregaten inkapselt. Schakel daarna de functiegenerator en de eindversterker uit.
- Breng de 3D-hydrogelsteiger voorzichtig over van de kamer naar een petrischaal en snijd deze in kleine stukjes (bijv. 2 mm × 2 mm × 2 mm) met een schoon scheermes.
- Voeg celkweekmedium toe voor de kweek.
OPMERKING: Vergeet niet om het kweekmedium elke dag te veranderen.
6. Celsferoïden ophalen
- Begin met het observeren van sferoïde vorming op verschillende lagen van de steigers met behulp van een omgekeerde microscoop.
- Verwijder na 3 dagen kweken het kweekmedium en was de hydrogelsteigers twee keer grondig met PBS.
- Incubeer de steigers met meer dan 2 ml GelMA-lysisbuffer in een verdunning van 1: 200 met celkweekmedium gedurende 30 minuten in een celincubator. Deze stap is bedoeld om de hydrogelsteigers op te lossen.
- Breng de oplossing van de vorige stap over in een buis en centrifugeer deze vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 × g om de celsferoïde pellet te verkrijgen.
- Gooi het supernatans weg en repsuspendeer de pellet opnieuw in vers kweekmedium voor stroomafwaartse toepassingen.
7. Analyse van de levensvatbaarheid van sferoïden
- Beoordeel de levensvatbaarheid van celsferoïden in de hydrogelsteigers of in de opgehaalde sferoïden met behulp van een levende/dode kleuringskit (zie Materiaaltabel).
- Incubeer de monsters op verschillende kweektijdstippen met 1 ml PBS-oplossing met 1 μl Calceïne-AM en 2 μL propidiumjodide (PI) gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Voor monsters in de hydrogelsteigers, was ze twee keer rechtstreeks met PBS. Voor teruggewonnen sferoïden, centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een sferoïde pellet te verkrijgen, en was deze twee keer voordat u het observeert.
- Observeer de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop en leg de fluorescentiebeelden vast.
- Bereken de verhouding tussen het gebied dat is gekleurd met Calcein-AM en het totale gebied dat is gekleurd met zowel Calcein-AM als PI met behulp van ImageJ om de levensvatbaarheid van sferoïde te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie ontwierp een 3D akoestisch assemblageapparaat voor massaproductie van celsferoïden. Het akoestische apparaat bestond uit een vierkante kamer met twee PZT-transducers die aan het X-vlak en het Y-vlak aan de buitenkant van de kamer waren bevestigd en één PZT-transducer aan de onderkant van de kamer (figuur 1A,B). Drie uitgangskanalen van twee functiegeneratoren werden aangesloten op drie eindversterkers om drie onafhankelijk sinusvormige signalen te genereren om de PZT-transducers te bedienen (Figuur 1C).
De optimale resonantiefrequenties die werden gebruikt om de drie PZT-transducers te activeren die aan de X/Y/Z-vlakken van de kamer waren bevestigd, waren respectievelijk 3.209 MHz, 3.283 MHz en 3.215 MHz. De optimale amplitude voor alle drie de PZT-transducers was 10 piek-tot-piek uitgangsspanning (Vpp), gemeten door een oscilloscoop. Figuur 2A illustreert het werkingsmechanisme van celaggregaten die worden gegenereerd met behulp van het 3D-akoestische assemblageapparaat. Wanneer het signaal wordt toegepast, worden cellen onder invloed van akoestische stralingskracht (ARF) naar de akoestische knooppunten gedreven. Om celsferoïden te visualiseren, werden cellen vooraf gekleurd met 2 μM DiO (groene fluorescentie). Na de akoestische assemblage van de cellen werd een confocale microscoop gebruikt om de 3D akoestisch geassembleerde celaggregaten te observeren. Er werd waargenomen dat deze celaggregaten waren gerangschikt in een regelmatig 3D-dot array-patroon met uniforme groene fluorescerende signalen (Figuur 2B). Verschillende bovenaanzichten van helderveldbeelden toonden ook aan dat de gevormde aggregaten in elke laag waren gerangschikt in een 2D-dot array-patroon (Figuur 2C).
De groei van celaggregaten in de hydrogel op verschillende tijdstippen werd waargenomen. De resultaten toonden aan dat de geassembleerde aggregaten geleidelijk integreerden en tegen dag 3 strakke sferoïden vormden, vergezeld van een toename van de sferoïde diameter (Figuur 3A,B). Er werd een levende/dode kleuring uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de celsferoïden te evalueren. Goede cellevensvatbaarheid (>90%) werd bereikt vóór dag 3, terwijl de levensvatbaarheid licht afnam na een week kweek (figuur 3C,D).
Voor het ophalen van sferoïden werd een GelMA-lysisbuffer gebruikt om de hydrogelsteigers te dissociëren, waardoor de ingekapselde celsferoïden vrijkwamen (Figuur 4A). Na drie dagen telen werden de kleine stukjes hydrogelsteigers vervolgens gedurende 30 minuten behandeld met GelMA-lysisbuffer bij 37 °C. De vrijgekomen sferoïden behielden een goede bolvormige morfologie met een smalle grootteverdeling, samen met de expressie van albumine en de gewenste levensvatbaarheid (Figuur 4B-D).
Figuur 1: 3D akoestisch montageapparaat. (A) Schematisch diagram van het bovenaanzicht van het 3D akoestisch montageapparaat, bestaande uit een PMMA-kamer die is bevestigd met drie PZT-transducers. (B) Foto waarop het werkelijke 3D-akoestische montageapparaat te zien is. (C) Foto van het 3D-akoestische montageapparaat dat is aangesloten op twee functiegeneratoren en drie eindversterkers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Akoestisch geassembleerde celaggregaten. (A) Schema ter illustratie van het werkingsmechanisme van celaggregaten die worden gegenereerd door het 3D-akoestische assemblageapparaat, waarbij cellen door akoestische stralingskracht naar de akoestische knooppunten worden gedreven. (B) Confocale beelden die de 3D akoestisch geassembleerde celaggregaten vanuit verschillende perspectieven laten zien. (C) Helderveldbeelden die de gevormde celaggregaten op verschillende lagen in de hydrogelsteiger weergeven. De schaalbalk staat voor 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Groei van celaggregaten tot sferoïden in de GelMA-steiger. (A) Helderveldbeelden die de vorming van compacte celsferoïden tonen na een kweekperiode van 3 dagen. (B) Kwantificering van sferoïde afmetingen. (C) Levende/dode kleuring van sferoïden in de hydrogelsteiger na een week kweek. (D) Kwantificering van de levensvatbaarheid van de sferoïde cellen. De schaalbalk staat voor 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ophalen van akoestisch vervaardigde celsferoïden. (A) Illustratie van de stappen voor het ophalen van akoestisch vervaardigde celsferoïden. (B) Helderveldbeelden die de opgehaalde sferoïden bij verschillende vergrotingen weergeven. De schaalbalk vertegenwoordigt 250 μm. (C) Analyse van de levensvatbaarheid en functionaliteit van de opgehaalde sferoïden. De schaalbalk staat voor 100 μm. (D) Grootteverdeling van de sferoïden na het ophalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efficiënte en stabiele fabricage van celsferoïden met een hoge doorvoer met behulp van technologieën zoals het 3D akoestische assemblageapparaat is veelbelovend voor het bevorderen van biomedische technologie en het screenen van geneesmiddelen 1,2,3. Deze aanpak vereenvoudigt de massaproductie van celsferoïden door middel van eenvoudige procedures.
Er zijn echter kritische factoren waarmee u rekening moet houden bij het gebruik van dit akoestische apparaat. Het creëren van staande golven is essentieel voor het construeren van een 3D-dot array akoestisch veld. In dit apparaat is in elke dimensie slechts één PZT-transducer aanwezig, die als geluidsexcitatiebron dient. Daarom is het voor elke dimensie van cruciaal belang dat de face-to-face afstand tussen de tegenoverliggende wanden van de PMMA-kamer of het PMMA-wateroppervlak een geheel veelvoud is van de helft van de golflengte. De primaire frequentie van de PZT-transducers die we hebben gebruikt is 1 MHz, wat resulteert in een golflengte in het water of bioink van ongeveer 500 μm. Bijgevolg werd voor de horizontale dimensie de face-to-face afstand tussen de twee tegenover elkaar liggende wanden van de PMMA-kamer in het akoestische apparaat vastgesteld op 21 mm, rekening houdend met de grootte van de PZT-transducers. Voor de verticale dimensie kan de face-to-face afstand tussen de onderste PMMA-wand en het wateroppervlak worden aangepast door het bioinkvolume te variëren om te voldoen aan de voorwaarden voor staande golfvorming. Tijdens experimenteel gebruik kunnen kleine frequentieaanpassingen nodig zijn om afstandsafwijkingen te compenseren. Bovendien is het belangrijk om de ingangsspanning op een gematigd niveau te houden om oververhitting van de PZT-transducer te voorkomen, wat de bioink zou kunnen opwarmen en mogelijk de cellen zou kunnen beschadigen. In de experimenten werd een piek-tot-piekspanning van 10 Vpp gebruikt, waardoor de assemblage van het celaggregaat binnen 30 s werd voltooid terwijl de bioinktemperatuur onder de 30 °C werd gehouden.
Een beperking van deze benadering is de afhankelijkheid van de GelMA-steiger26, die een cruciale rol speelt bij het handhaven van de structurele integriteit van de akoestisch geassembleerde celaggregaten wanneer ze uitgroeien tot celsferoïden wanneer het akoestische veld wordt verwijderd. De stap waarbij de hydrogelsteigers worden opgelost voor het ophalen van sferoïden, kan echter leiden tot verminderde cellevensvatbaarheid en mogelijk verlies van sferoïden. Bovendien moet het volume van de GelMA-steiger binnen het bereik van enkele millimeters liggen om de penetratie en uitwisseling van voedingsstoffen voor de ingekapselde cellen mogelijk te maken. De beperkte steigergrootte in het millimeterbereik kan de productieopbrengst van celsferoïden beperken, zelfs als in eerste instantie grotere steigers worden geproduceerd en vervolgens in kleinere stukken worden gesneden. Toekomstige inspanningen kunnen gericht zijn op het in situ houden van akoestisch geassembleerde celaggregaten, gesuspendeerd in het kweekmedium, zodat ze kunnen uitgroeien tot sferoïden zonder dat er een externe steiger nodig is.
Samenvattend kan het akoestische montageapparaat dat in dit protocol wordt beschreven, eenvoudig worden geassembleerd en bediend met relatief eenvoudige stappen, wat het voordeel biedt dat celsferoïden efficiënt worden vervaardigd. Bovendien is dit akoestische assemblageapparaat compatibel met verschillende celtypen, waaronder de fabricage van organoïden, wat het aanzienlijke potentieel voor een breed scala aan biomedische toepassingen aantoont.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) en de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
