Summary
Cellesfæroider er blevet betragtet som en potentiel model inden for biologiske anvendelser. Denne artikel beskriver protokoller til skalerbar generering af cellesfæroider ved hjælp af en 3D-akustisk samlingsenhed, som giver en effektiv metode til robust og hurtig fremstilling af ensartede cellesfæroider.
Abstract
Cellesfæroider er lovende tredimensionelle (3D) modeller, der har fået bred anvendelse på mange biologiske områder. Denne protokol præsenterer en metode til fremstilling af højkvalitets og højkapacitetscellesfæroider ved hjælp af en 3D-akustisk monteringsenhed gennem manøvrerbare procedurer. Den akustiske monteringsanordning består af tre blyzirkonattitanattransducere (PZT), der hver er anbragt i X/Y/Z-planet i et kvadratisk polymethylmethacrylatkammer (PMMA). Denne konfiguration gør det muligt at generere et 3D-dot-array-mønster af leviterede akustiske noder (LAN'er), når der anvendes tre signaler. Som et resultat kan celler i gelatinemethacryloyl (GelMA) -opløsningen drives til LAN'erne og danne ensartede celleaggregater i tre dimensioner. GelMA-løsningen UV-fotohærdes og tværbindes derefter for at fungere som et stillads, der understøtter væksten af celleaggregater. Endelig opnås masser af modne sfæroider og hentes ved efterfølgende at opløse GelMA-stilladserne under milde forhold. Den foreslåede nye 3D-enhed til samling af akustiske celler vil muliggøre opskalering af fremstilling af cellesfæroider og endda organoider, hvilket giver stor potentiel teknologi på det biologiske område.
Introduction
3D in vitro kulturmodeller, som giver mere in vivo-lignende strukturelle og morfologiske egenskaber sammenlignet med konventionelle 2D-kulturmodeller, er blevet anerkendt som lovende systemer i forskellige biomedicinske applikationer såsom vævsteknik, sygdomsmodellering og lægemiddelscreening 1,2,3. Som en type 3D-kulturmodel henviser cellesfæroider typisk til celleaggregering, hvilket skaber 3D-sfæroidale strukturer kendetegnet ved forbedrede celle-celle- og cellematrixinteraktioner 4,5,6. Derfor er fremstilling af cellesfæroider blevet et kraftfuldt værktøj til at muliggøre forskellige biologiske undersøgelser.
Forskellige teknikker, herunder hængende dråbe7, ikke-klæbende plader8 eller mikrobrøndsenheder9, er blevet udviklet til opnåelse af sfæroider. I princippet letter disse metoder almindeligvis cellesamling ved at udnytte fysiske kræfter såsom tyngdekraft, samtidig med at interaktioner mellem celler og substratet minimeres. De involverer dog ofte arbejdskrævende processer, har lav produktivitet og udgør udfordringer for styring af sfærisk størrelse10,11. Det er vigtigt, at produktionen af sfæroider med den ønskede størrelse og ensartethed i tilstrækkelig mængde er af største betydning for at tilfredsstille specifikke biologiske anvendelser. I modsætning til de ovennævnte metoder har akustiske bølger, som en type ekstern kraftdrevet teknik 12,13,14, vist potentiale for massefremstilling af cellesfæroider med høj kvalitet og gennemstrømning baseret på princippet om at forbedre celleaggregering gennem eksterne kræfter 15,16,17,18 . I modsætning til elektromagnetiske eller magnetiske kræfter er akustisk baserede cellemanipulationsteknikker ikke-invasive og etiketfrie, hvilket muliggør sfærisk dannelse med fremragende biokompatibilitet19,20.
Almindeligvis er stående overflade akustiske bølger (SAW'er) og bulk akustiske bølger (BAWs) -baserede enheder blevet udviklet til at generere sfæroider ved hjælp af de akustiske noder (AN'er) produceret af tilsvarende stående akustiske felter 21,22,23. Især akustiske monteringsenheder baseret på BAW'er, med fordelene ved praktisk fremstilling, nem betjening og fremragende skalerbarhed, har fået opmærksomhed til fremstilling af cellesfæroider24,25. Vi har for nylig udviklet en let BAWs-baseret akustisk monteringsenhed med evnen til at generere sfæroider med høj gennemstrømning26. Den foreslåede anordning består af et firkantet polymethylmethacrylatkammer (PMMA) med tre blyzirkonattitanattransducere anbragt henholdsvis i X/Y/Z-planet. Dette arrangement gør det muligt at oprette et 3D-dot-array-mønster af leviterede akustiske noder (LAN'er) til samling af køreceller. Sammenlignet med tidligere rapporterede BAWs- eller SAWs-baserede enheder, som kun kan oprette et 1D- eller 2D-array af AN'er 27,28,29, muliggør den nuværende enhed en 3D-dot-array af LAN'er til hurtig dannelse af celleaggregater i gelatinemethacryloyl (GelMA) opløsningen. Derefter modnes celleaggregater til sfæroider med høj levedygtighed inden for de fotohærdede GelMA-stilladser efter tre dages dyrkning. Endelig blev et stort antal sfæroider med ensartet størrelse let opnået fra GelMA-stilladserne til downstream-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af 3D akustisk monteringsenhed
- Begynd med at forberede fire 1 mm tykke PMMA-ark gennem laserskæring30, og fortsæt derefter med at lime dem sammen for at danne et firkantet kammer med en indvendig bredde på 21 mm og en højde på 10 mm.
- Fastgør derefter et andet 1 mm tykt PMMA-ark til bunden af kammeret for at tjene som holder til bioblækket.
- Tre blyzirkonattitanattransducere (PZT) (hver måler 20 mm i længden, 10 mm i bredden, 0,7 mm i tykkelse og med en primær resonansfrekvens på 3 MHz, se materialetabellen) fastgøres forsigtigt på ydersiden af kammerets tre ortogonale vægge. Sørg for, at den nederste PZT-transducer er centreret under kammeret.
- Loddetråd til de to ledende områder i hver PZT-transducer.
- Til sidst skal du fastgøre enheden på en hul base for at forhindre, at den nederste PZT kommer i kontakt med andre bordplader.
2. Opsætning af det akustiske monteringssystem
- Begynd med at montere den akustiske enhed på et mikroskoptrin, hvilket giver mulighed for top-view observation af kammerets indre.
- Placer et digitalt mikroskop på den side af enheden, der er fri for PZT-transducere, hvilket muliggør sideobservation af kammerets indre.
- Tilslut uafhængigt ledningerne fra de tre PZT-transducere i serie til tre effektforstærkere og tre udgangskanaler af funktionsgeneratorer (se materialetabel).
- Programmér indstillingerne på funktionsgeneratorerne for hver PZT-transducer, og angiv parametre som sinusformet bølgeform, frekvens og amplitude.
- For at sikre sterilisering fyldes kammeret på den akustiske enhed med 75% alkohol i 5 minutter efterfulgt af en grundig rengøring med steril PBS-opløsning. Derefter bestråles kammeret med UV-lys i en ren bænk i mindst 1 time.
3. Cellekultur og høstprocedure
- Begynd med at dyrke C3A-celler, en human hepatocellulær carcinomcellelinje, i en T25-cellekulturkolbe ved hjælp af Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (se materialetabel).
- Når C3A-cellerne når ca. 80% sammenløb, udføres cellepassage som følger: Først vaskes bunden af kulturkolben to gange med PBS. Derefter tilsættes 2 ml 0,05% trypsin-EDTA til cellekulturkolben og inkuberes ved 37 °C for at lette cellefrigørelsen. Stop trypsiniseringsprocessen ved at tilføje 2 ml komplet kulturmedium.
- Overfør celleopløsningen til et 15 ml rør, og centrifuger det ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur for at opnå en cellepille.
4. Klargøring af bioblækket
- Der fremstilles en 6 % (w/v) GelMA-opløsning indeholdende 0,5 % (w/v) lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) ved at opløse 0,3 g GelMA og 0,025 g LAP (se materialetabellen) i 5 ml fosfatbufferopløsning (PBS). Blandingen henstår i et 47 °C vandbad i 1 time.
- Før blanding med celler føres GelMA-opløsningen gennem et 0,22 μm filter (se materialetabel) til sterilisering.
- Resuspender cellepelleten nævnt ovenfor (trin 3.3) i cellekulturmedium. Plet et lille volumen celler med en 0,4% trypanblå opløsning, og brug derefter et rent hæmocytometer til celletælling.
- Bland en passende mængde C3A-celler, beregnet ud fra den ovenfor opnåede celletæthed, med den steriliserede GelMA-opløsning for at forberede bioblækket med en celletæthed på 2 × 106 celler/ml.
- Til visualisering af de samlede cellesfæroider forplettes C3A-celler ved at inkubere dem med 2 μM celletracker (DiO-farvestof, se materialetabel) ved 37 °C i 20 minutter. Derefter vaskes de mærkede celler med frisk cellekulturmedium tre gange før brug.
5. Montering af cellesfæroiderne ved hjælp af den akustiske enhed
- Der pipetteres mere end 1 ml bioblæk ind i det steriliserede kammer. Sørg for, at afstanden ansigt til ansigt mellem væskeoverfladen og kammerbunden er et heltalsmultiplum af halvdelen af den akustiske bølgelængde.
BEMÆRK: Man kan styre denne afstand ved at justere mængden af tilsat bioblæk. Den akustiske bølgelængde (λ) kan estimeres ved hjælp af formlen λ = c / f, hvor c repræsenterer lydens hastighed i mediet, og f er frekvensen af PZT-transduceren. - Tænd funktionsgeneratoren og effektforstærkeren for at starte aktiveringen af hver PZT-transducer.
BEMÆRK: Det anbefales at aktivere hver PZT-transducer individuelt først for at opnå det optimale parallellinje-cellulære mønster. Dette kan opnås ved at udføre en frekvensfejning med en trinstørrelse på 0,001 MHz nær den primære resonansfrekvens for hver PZT-transducer. Derefter skal du samtidig anvende disse optimale signaler på alle tre PZT-transducere for at opnå det forventede 3D-punkts cellulære mønster. Før du anvender hvert indgangssignal, skal du sikre dig, at cellerne er jævnt fordelt i bioblækket ved forsigtigt at omrøre. - Krydslink bioblækket ved hjælp af blåt lys (405 nm, 60 mW / cm2, 30 s) for at skabe et 3D-hydrogelstillads, der indkapsler celleaggregaterne samlet akustisk. Sluk derefter funktionsgeneratoren og effektforstærkeren.
- Overfør forsigtigt 3D-hydrogelstilladset fra kammeret til en petriskål og skær det i små stykker (f.eks. 2 mm × 2 mm × 2 mm) ved hjælp af en ren barbermaskine.
- Tilsæt cellekulturmedium til dyrkning.
OBS: Husk at skifte kulturmedie hver dag.
6. Hentning af cellesfæroider
- Begynd med at observere sfærisk dannelse på forskellige lag af stilladserne ved hjælp af et omvendt mikroskop.
- Efter 3 dages kultur fjernes kulturmediet og hydrogelstilladserne vaskes grundigt to gange med PBS.
- Inkuber stilladserne med mere end 2 ml GelMA lysisbuffer ved en 1: 200 fortynding med cellekulturmedium i 30 minutter i en celleinkubator. Dette trin sigter mod at opløse hydrogelstilladserne.
- Overfør opløsningen fra det foregående trin til et rør, og centrifuger den derefter ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur for at opnå cellekuglen.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i frisk dyrkningsmedium til downstream-udbringning.
7. Analyse af sfærisk levedygtighed
- Vurder levedygtigheden af cellesfæroider enten inden for hydrogelstilladserne eller i de hentede sfæroider ved hjælp af et levende / dødt farvningssæt (se materialetabel).
- Prøverne inkuberes på forskellige dyrkningstidspunkter med 1 ml PBS-opløsning indeholdende 1 μL Calcein-AM og 2 μL propidiumiodid (PI) i 15 minutter ved 37 °C.
- For prøver inden for hydrogelstilladserne, vask dem direkte med PBS to gange. For hentede sfæroider centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur for at opnå en sfærisk pellet, og den vaskes to gange før observation.
- Overhold prøverne ved hjælp af et fluorescensmikroskop og tag fluorescensbillederne.
- Beregn forholdet mellem det areal, der er farvet med Calcein-AM, og det samlede areal, der er farvet med både Calcein-AM og PI, ved hjælp af ImageJ til at bestemme sfærisk levedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse designet en 3D akustisk samling enhed til massefremstilling af celle sfæroider. Den akustiske anordning bestod af et firkantet kammer med to PZT-transducere fastgjort til X-planet og Y-planet på kammerets ydre overflade og en PZT-transducer på kammerets bund (figur 1A, B). Tre udgangskanaler fra to funktionsgeneratorer blev forbundet til tre effektforstærkere for at generere tre uafhængigt sinusformede signaler for at aktivere PZT-transducere (figur 1C).
De optimale resonansfrekvenser, der blev brugt til at aktivere de tre PZT-transducere, der var fastgjort til kammerets X / Y / Z-planer, var henholdsvis 3,209 MHz, 3,283 MHz og 3,215 MHz. Den optimale amplitude for alle tre PZT-transducere var 10 peak-to-peak udgangsspænding (Vpp) målt med et oscilloskop. Figur 2A illustrerer arbejdsmekanismen for celleaggregater, der genereres ved hjælp af den akustiske 3D-samlingsenhed. Når signalet påføres, drives celler til de akustiske knudepunkter under påvirkning af akustisk strålingskraft (ARF). For at visualisere cellesfæroider blev celler forfarvet med 2 μM DiO (grøn fluorescens). Efter akustisk cellesamling blev et konfokalmikroskop brugt til at observere de 3D akustisk monterede celleaggregater. Disse celleaggregater blev observeret at være arrangeret i et regelmæssigt 3D-dot array-mønster med ensartede grønne fluorescerende signaler (figur 2B). Forskellige topbilleder af lysfeltbilleder viste også, at de dannede aggregater i hvert lag var arrangeret i et 2D-punkts array-mønster (figur 2C).
Væksten af celleaggregater i hydrogelen på forskellige tidspunkter blev observeret. Resultaterne viste, at de samlede aggregater gradvist integrerede sig og dannede tætte sfæroider på dag 3, ledsaget af en stigning i sfærisk diameter (figur 3A, B). En levende / død farvning blev udført for at evaluere levedygtigheden af cellesfæroiderne. Gode cellelevedygtigheder (>90%) blev opnået før dag 3, mens levedygtigheden faldt lidt efter en uges dyrkning (figur 3C,D).
Til hentning af sfæroider blev en GelMA-lysisbuffer brugt til at adskille hydrogelstilladserne og frigive de indkapslede cellesfæroider (figur 4A). Efter tre dages dyrkning blev de små stykker hydrogelstilladser derfor behandlet med GelMA lysisbuffer ved 37 °C i 30 minutter. De frigivne sfæroider opretholdt en god sfærisk morfologi med en smal størrelsesfordeling sammen med ekspressionen af albumin og ønskelig levedygtighed (figur 4B-D).
Figur 1: 3D akustisk monteringsenhed. (A) Skematisk diagram, der viser den akustiske 3D-enhedsenhed set ovenfra, bestående af et PMMA-kammer fastgjort med tre PZT-transducere. (B) Fotografi, der viser den faktiske akustiske 3D-enhed. (C) Fotografi, der viser den akustiske 3D-enhed, der er forbundet med to funktionsgeneratorer og tre effektforstærkere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Akustisk samlede celleaggregater. (A) Skematisk illustration af arbejdsmekanismen for celleaggregater genereret af 3D-akustisk samlingsenhed, hvor celler drives til de akustiske knudepunkter af akustisk strålingskraft. (B) Konfokale billeder, der viser de akustisk samlede 3D-celleaggregater fra forskellige perspektiver. (C) Bright-field billeder, der viser de dannede celleaggregater på forskellige lag inden for hydrogelstilladset. Skalabjælken repræsenterer 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vækst af celleaggregater til sfæroider i GelMA-stilladset. (A) Bright-field billeder, der viser dannelsen af kompakte cellesfæroider efter en 3-dages dyrkningsperiode. (B) Kvantificering af sfæroidstørrelser. (C) Levende/død farvning af sfæroider i hydrogelstilladset efter en uges dyrkning. D) Kvantificering af cellesfæroidlevedygtighed. Skalabjælken repræsenterer 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Udtagning af akustisk fremstillede cellesfæroider. (A) Illustration, der viser trinene til hentning af akustisk fremstillede cellesfæroider. (B) Bright-field billeder, der viser de hentede sfæroider ved forskellige forstørrelser. Skalabjælken repræsenterer 250 μm. (C) Analyse af levedygtighed og funktionalitet af de hentede sfæroider. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. (D) Størrelsesfordeling af sfæroider efter hentning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv og stabil fremstilling af cellesfæroider med høj gennemstrømning ved hjælp af teknologier som 3D akustisk samlingsenhed har et stort løfte om at fremme biomedicinsk teknik og lægemiddelscreening 1,2,3. Denne tilgang forenkler masseproduktionen af cellesfæroider gennem enkle procedurer.
Der er dog kritiske faktorer, der skal overvejes, når du bruger denne akustiske enhed. Skabelsen af stående bølger er afgørende for at konstruere et akustisk felt med 3D-prikker. I denne enhed er der kun en PZT-transducer til stede i hver dimension, der tjener som en lydexcitationskilde. Derfor er det for hver dimension afgørende, at afstanden ansigt til ansigt mellem de modsatte vægge i PMMA-kammeret eller PMMA-vandoverfladen er et heltalsmultiplum af halvdelen af bølgelængden. Den primære frekvens af de PZT-transducere, vi brugte, er 1 MHz, hvilket resulterer i en bølgelængde i vandet eller bioblækket på ca. 500 μm. For den vandrette dimension blev afstanden ansigt til ansigt mellem PMMA-kammerets to modstående vægge i det akustiske apparat derfor fastsat til 21 mm, hvilket svarer til størrelsen af PZT-transducere. For den lodrette dimension kan afstanden ansigt til ansigt mellem den nederste PMMA-væg og vandoverfladen justeres ved at variere bioblækvolumenet for at opfylde betingelserne for stående bølgedannelse. Under eksperimentel drift kan det være nødvendigt med små frekvensjusteringer for at kompensere for afstandsafvigelser. Derudover er det vigtigt at holde indgangsspændingen på et moderat niveau for at forhindre overophedning af PZT-transduceren, hvilket kan opvarme bioblækket og potentielt beskadige cellerne. I forsøgene blev der anvendt en spids-til-spidsspænding på 10 Vpp, hvilket fuldendte celleaggregatsamling inden for 30 s, samtidig med at bioblæktemperaturen blev holdt under 30 °C.
En begrænsning ved denne tilgang er afhængigheden af GelMA-stilladset26, som spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af den strukturelle integritet af de akustisk samlede celleaggregater, når de modnes til cellesfæroider, når det akustiske felt fjernes. Imidlertid kan trinnet, der involverer opløsning af hydrogelstilladserne til sfærisk hentning, føre til reduceret cellelevedygtighed og potentielt sfærisk tab. Derudover skal volumenet af GelMA-stilladset være inden for området på flere millimeter for at muliggøre næringsstofindtrængning og udveksling af de indkapslede celler. Den begrænsede stilladsstørrelse i millimeterområdet kan begrænse produktionsudbyttet af cellesfæroider, selvom større stilladser oprindeligt produceres og derefter skæres i mindre stykker. Fremtidige bestræbelser kan fokusere på at opretholde akustisk samlede celleaggregater in situ, suspenderet i dyrkningsmediet, så de kan vokse til sfæroider uden behov for et eksternt stillads.
Sammenfattende kan den akustiske monteringsenhed, der er beskrevet i denne protokol, let samles og betjenes med relativt enkle trin, hvilket giver fordelen ved effektivt at fremstille cellesfæroider. Desuden er denne akustiske monteringsenhed kompatibel med forskellige celletyper, herunder fremstilling af organoider, hvilket viser dets betydelige potentiale for en bred vifte af biomedicinske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
