Summary
细胞球体被认为是生物应用领域的一种潜在模型。本文介绍了使用 3D 声学组装设备可扩展生成细胞球体的协议，它为稳定和快速地制造均匀细胞球体提供了一种有效的方法。
Abstract
细胞球体是有前途的三维（3D）模型，在许多生物领域获得了广泛的应用。该协议提出了一种通过机动程序使用 3D 声学组装装置制造高质量和高通量细胞球体的方法。声学组件装置由三个锆钛酸铅 （PZT） 换能器组成，每个换能器都布置在方形聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 腔室的 X/Y/Z 平面上。当施加三个信号时，这种配置可以生成悬浮声学节点 （LAN） 的 3D 点阵模式。因此，明胶甲基丙烯酰 （GelMA） 溶液中的细胞可以被驱动到 LAN，在三维空间中形成均匀的细胞聚集体。然后对 GelMA 溶液进行紫外光固化和交联，作为支持细胞聚集体生长的支架。最后，通过随后在温和条件下溶解 GelMA 支架来获得和回收大量成熟的球状体。拟议的新型3D声学细胞组装装置将能够放大细胞球体甚至类器官的制造，为生物领域提供巨大的潜力技术。
Introduction
与传统的 2D 培养模型相比，3D 体外培养模型提供了更多类似体内的结构和形态学特征，已被公认为各种生物医学应用（如组织工程、疾病建模和药物筛选）中的有前途的系统 1,2,3.作为 3D 培养模型的一种类型，细胞球体通常是指细胞聚集，创建以增强细胞-细胞和细胞-基质相互作用为特征的 3D 球状体结构 4,5,6。因此，制造细胞球体已成为实现各种生物学研究的有力工具。
已经开发了各种技术，包括悬挂液滴7、非粘性板8 或微孔装置9，以获得球状体。原则上，这些方法通常通过利用重力等物理力来促进细胞组装，同时最大限度地减少细胞与基材之间的相互作用。然而，它们通常涉及劳动密集型过程，生产率低，并且对控制球体大小10,11 提出了挑战。重要的是，生产具有所需尺寸和均匀性且数量足够的球状体对于满足特定的生物应用至关重要。与上述方法相比，声波作为一种外力驱动技术12,13,14，基于通过外力增强细胞聚集的原理，显示出大规模制造高质量和高通量细胞球体的潜力15,16,17,18.与电磁力或磁力不同，基于声学的细胞操作技术是非侵入性和无标记的，能够形成具有出色生物相容性的球状体19,20。
通常，已经开发了基于驻置表面声波 （SAW） 和体声波 （BAW） 的器件来利用相应的驻置声场产生的声学节点 （AN）21,22,23 来生成球体。特别是基于BAW的声学组装装置，具有制造方便、操作方便、可扩展性好等优点，在制造细胞球体方面备受关注24,25。我们最近开发了一种基于 BAW 的简单声学组装装置，能够生成具有高通量的球体26。所提出的装置由一个方形聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 腔室组成，三个锆酸铅钛酸酯 （PZT） 探头分别布置在 X/Y/Z 平面上。这种布置可以创建悬浮声学节点 （LAN） 的 3D 点阵图案，用于驱动单元组装。与先前报道的基于 BAW 或 SAW 的设备相比，这些设备只能创建 ANs27、28、29 的 1D 或 2D 阵列，本设备能够实现 LAN 的 3D 点阵列，用于在明胶甲基丙烯酰 （GelMA） 溶液中快速形成细胞聚集体。随后，经过三天的培养，细胞聚集体在光固化的 GelMA 支架内成熟为具有高活力的球状体。最后，从GelMA支架中可以很容易地获得大量大小均匀的球体，用于下游应用。
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Protocol
1. 3D声学装配装置的制造
- 首先通过激光切割准备四个1毫米厚的PMMA片材30，然后继续将它们粘合在一起，形成一个内宽为21毫米，高度为10毫米的方形腔室。
- 接下来，将另一张 1 毫米厚的 PMMA 片材贴在腔室底部，作为生物墨水的支架。
- 小心地将三个锆钛酸铅 （PZT） 探头（每个长 20 毫米、宽 10 毫米、厚 0.7 毫米，初级谐振频率为 3 MHz，参见 材料表）分别固定在腔室的三个正交壁的外部。确保底部 PZT 换能器位于腔室下方的中心。
- 将焊丝焊接到每个 PZT 传感器的两个导电区域。
- 最后，将设备固定在空心底座上，以防止底部 PZT 与其他台面接触。
2. 设置声学装配系统
- 首先将声学设备安装到显微镜载物台上，以便俯视观察腔室内部。
- 将数码显微镜放置在设备没有PZT探头的一侧，以便从侧面观察腔室内部。
- 将三个 PZT 传感器串联的导线独立连接到三个功率放大器和函数发生器的三个输出通道（参见 材料表）。
- 对每个 PZT 传感器的函数发生器设置进行编程，指定正弦波形、频率和幅度等参数。
- 为确保灭菌，用 75% 酒精填充声学设备的腔室 5 分钟，然后用无菌 PBS 溶液彻底清洁。随后，在洁净的工作台中用紫外线照射腔室至少1小时。
3. 细胞培养和收获程序
- 首先，使用补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 在 T25 细胞培养瓶中培养 C3A 细胞（一种人肝细胞癌细胞系）（参见 材料表）。
- 当C3A细胞达到约80%汇合时，按如下方式进行细胞传代：首先，用PBS洗涤培养瓶底部两次。然后，向细胞培养瓶中加入2mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育以促进细胞分离。通过加入 2 mL 完全培养基停止胰蛋白酶化过程。
- 将细胞溶液转移到 15 mL 管中，并在室温下以 200 × g 离心 5 分钟以获得细胞沉淀。
4. 生物墨水的制备
- 通过将 0.3 g GelMA 和 0.025 g LAP（参见 材料表）溶解在 5 mL 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中，制备含有 0.5% （w/v） 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂 （LAP） 的 6% （w/v） GelMA 溶液。让混合物在47°C水浴中静置1小时。
- 在与细胞混合之前，将 GelMA 溶液通过 0.22 μm 过滤器（参见 材料表）进行灭菌。
- 将上述细胞沉淀重悬于细胞培养基中（步骤3.3）。用0.4%台盼蓝溶液对少量细胞进行染色，然后使用干净的血细胞计数器进行细胞计数。
- 将根据上述获得的细胞密度计算的适量C3A细胞与灭菌的GelMA溶液混合，制备细胞密度为2×106 个细胞/mL的生物墨水。
- 为了观察组装的细胞球体，通过在37°C下用2μM细胞追踪剂（DiO染料，参见 材料表）孵育20分钟来预染色C3A细胞。随后，在使用前用新鲜细胞培养基洗涤标记的细胞三次。
5. 使用声学设备组装细胞球体
- 将超过 1 mL 的生物墨水移液到灭菌室中。确保液体表面与腔室底部之间的面对面距离是声波长一半的整数倍。
注意：可以通过调整添加的生物墨水的体积来控制这个距离。声波长 （λ） 可以使用公式 λ = c/f 来估计，其中 c 表示介质中的声速，f 是 PZT 换能器的频率。 - 打开函数发生器和功率放大器以启动每个 PZT 传感器的驱动。
注意： 建议先单独启动每个 PZT 探头，以实现最佳的平行线蜂窝模式。这可以通过对每个PZT换能器在初级谐振频率附近进行步长为0.001 MHz的频率扫描来实现。然后，将这些最佳信号同时应用于所有三个 PZT 传感器，以获得预期的 3D 点细胞模式。在施加每个输入信号之前，通过轻轻搅拌确保细胞均匀分散在生物墨水中。 - 使用蓝光（405 nm，60 mW/cm 2,30 s）交联生物墨水，以创建3D水凝胶支架，该支架封装以声学方式组装的细胞聚集体。之后，关闭函数发生器和功率放大器。
- 小心地将3D水凝胶支架从腔室转移到培养皿中，并使用干净的剃须刀将其切成小块（例如，2毫米×2毫米×2毫米）。
- 加入细胞培养基进行培养。
注意：请记住每天更换培养基。
6. 检索细胞球体
- 首先使用倒置显微镜观察支架不同层的球状体形成。
- 培养3天后，取出培养基，用PBS彻底清洗水凝胶支架两次。
- 在细胞培养箱中，用细胞培养基以 1：200 的稀释度将支架与超过 2 mL 的 GelMA 裂解缓冲液孵育 30 分钟。此步骤旨在溶解水凝胶支架。
- 将上一步的溶液转移到试管中，然后在室温下以200 ×g 离心5分钟以获得细胞球状体沉淀。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜培养基中，用于下游应用。
7. 球状体活力分析
- 使用活/死染色试剂盒评估水凝胶支架内或检索到的球状体中细胞球状体的活力（参见 材料表）。
- 在不同的培养时间点将样品与含有1μL钙黄绿素-AM和2μL碘化丙啶（PI）的1mLPBS溶液在37°C下孵育15分钟。
- 对于水凝胶支架内的样品，直接用PBS清洗两次。对于回收的球状体，在室温下以200 ×g 离心5分钟以获得球状体沉淀，并在观察前洗涤两次。
- 使用荧光显微镜观察样品并捕获荧光图像。
- 使用 ImageJ 计算用钙黄绿素-AM 染色的面积与用钙黄绿素-AM 和 PI 染色的总面积的比率，以确定球状体活力。
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Representative Results
本研究设计了一种用于细胞球体大规模生产的 3D 声学组装装置。声学装置包括一个方形腔室，两个PZT换能器连接到腔室外表面的X平面和Y平面上，一个PZT换能器连接到腔室底部（图1A，B）。来自两个函数发生器的三个输出通道连接到三个功率放大器，以产生三个独立的正弦信号来驱动PZT传感器（图1C）。
用于驱动连接到腔室X/Y/Z平面的三个PZT换能器的最佳谐振频率分别为3.209 MHz、3.283 MHz和3.215 MHz。所有三个PZT传感器的最佳振幅均为10峰峰值输出电压（Vpp），由示波器测量。 图2A 说明了使用3D声学组装装置生成的细胞聚集体的工作机制。当施加信号时，细胞在声辐射力 （ARF） 的影响下被驱动到声节点。为了观察细胞球状体，用 2 μM DiO（绿色荧光）预染色细胞。声学细胞组装后，使用共聚焦显微镜观察声学组装的3D声学组装细胞聚集体。观察到这些细胞聚集体排列成规则的 3D 点阵列图案，具有均匀的绿色荧光信号（图 2B）。明场图像的不同俯视图也表明，每层中形成的聚集体以2D点阵列模式排列（图2C）。
观察水凝胶内细胞聚集体在不同时间点的生长。结果显示，到第3天，组装的聚集体逐渐整合并形成紧密的球体，并伴有球体直径的增加（图3A，B）。进行活/死染色以评估细胞球体的活力。在第 3 天之前达到良好的细胞活力 （>90%），而培养一周后活力略有下降（图 3C，D）。
对于球状体的检索，使用GelMA裂解缓冲液解离水凝胶支架，释放封装的细胞球状体（图4A）。因此，在培养三天后，用GelMA裂解缓冲液在37°C下处理小块水凝胶支架30分钟。释放的球体保持良好的球形形态，尺寸分布窄，以及白蛋白的表达和理想的活力（图4B-D）。
图 1：3D 声学装配设备。 （A） 描绘 3D 声学装配装置俯视图的示意图，该装置由一个连接有三个 PZT 换能器的 PMMA 室组成。（B） 显示实际 3D 声学组装装置的照片。（C） 与两个函数发生器和三个功率放大器连接的 3D 声学组件装置的照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：声学组装的细胞聚集体。 （A）示意图说明了由3D声学组装装置产生的细胞聚集体的工作机理，其中细胞通过声辐射力被驱动到声学节点。（B） 共聚焦图像，从不同角度展示 3D 声学组装的细胞聚集体。（C）明场图像，显示水凝胶支架内各层形成的细胞聚集体。比例尺代表 250 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：细胞聚集体在 GelMA 支架内生长成球状体。 （A） 明场图像显示 3 天培养期后形成致密细胞球体。（B） 球状体尺寸的定量。（C） 培养一周后水凝胶支架内球体的活/死染色。（D） 细胞球状体活力的定量。比例尺代表 250 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：声学制造的细胞球体的检索。 （A） 描述声学制造的细胞球体检索步骤的插图。（B）以不同放大倍率显示检索到的球体的明场图像。比例尺代表 250 μm。 （C）分析检索到的球体的活力和功能。比例尺代表 100 μm。 （D） 取回后球体的尺寸分布。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
使用 3D 声学组装设备等技术高效稳定地制造具有高通量的细胞球体，为推进生物医学工程和药物筛选 1,2,3 带来了巨大的前景。这种方法通过简单的程序简化了细胞球体的大规模生产。
但是，使用此声学设备时需要考虑一些关键因素。驻波的产生对于构建3D点阵声场至关重要。在该设备中，每个维度中只有一个 PZT 换能器，用作声音激励源。因此，对于每个维度，PMMA腔室或PMMA水面相对壁之间的面对面距离必须是波长一半的整数倍，这一点至关重要。我们使用的PZT换能器的主频率为1 MHz，这导致水或生物墨水中的波长约为500 μm。因此，对于水平尺寸，声学设备中PMMA腔室的两个相对壁之间的面对面距离设置为21 mm，这考虑了PZT传感器的尺寸。对于垂直尺寸，可以通过改变生物墨水量来调节底部PMMA壁与水面之间的面对面距离，以满足驻波形成的条件。在实验操作期间，可能需要轻微的频率调整以补偿距离偏差。此外，重要的是要将输入电压保持在适度的水平，以防止PZT传感器过热，这可能会加热生物墨水并可能损坏细胞。在实验中，使用10 Vpp的峰峰值电压，在30 s内完成细胞聚集体组装，同时将生物墨水温度保持在30°C以下。
这种方法的一个局限性是对 GelMA 支架26 的依赖，它在保持声学组装的细胞聚集体的结构完整性方面起着至关重要的作用，因为当声场被移除时，它们会成熟为细胞球体。然而，涉及溶解水凝胶支架以进行球状体提取的步骤可能导致细胞活力降低和潜在的球状体损失。此外，GelMA支架的体积需要在几毫米的范围内，以允许营养渗透和交换封装的细胞。毫米范围内有限的支架尺寸会限制细胞球体的产量，即使最初生产较大的支架，然后切成更小的碎片。未来的工作可能集中在原 位保持声学组装的细胞聚集体，悬浮在培养基中，使它们能够在不需要外部支架的情况下生长成球状体。
总之，该协议中描述的声学组装装置可以通过相对简单的步骤轻松组装和操作，从而具有高效制造细胞球体的优势。此外，这种声学组装设备与各种细胞类型兼容，包括类器官的制造，展示了其在广泛的生物医学应用中的巨大潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFA1104600）和浙江省自然科学基金（LQ23H160011）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
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