Summary
Os esferoides celulares têm sido considerados um modelo potencial no campo das aplicações biológicas. Este artigo descreve protocolos para geração escalável de esferoides celulares usando um dispositivo de montagem acústica 3D, que fornece um método eficiente para a fabricação robusta e rápida de esferoides celulares uniformes.
Abstract
Os esferoides celulares são modelos tridimensionais (3D) promissores que têm ganhado amplas aplicações em muitos campos biológicos. Este protocolo apresenta um método para fabricação de esferoides celulares de alta qualidade e alto rendimento usando um dispositivo de montagem acústica 3D através de procedimentos manobráveis. O dispositivo de montagem acústica consiste de três transdutores de titanato de zirconato de chumbo (PZT), cada um disposto no plano X/Y/Z de uma câmara quadrada de polimetilmetacrilato (PMMA). Essa configuração permite a geração de um padrão 3D de nós acústicos levitados (LANs) quando três sinais são aplicados. Como resultado, as células da solução de gelatina metacriloíla (GelMA) podem ser conduzidas para as LANs, formando agregados celulares uniformes em três dimensões. A solução de GelMA é então fotocurada por UV e reticulada para servir como um andaime que suporta o crescimento de agregados celulares. Finalmente, massas de esferoides maturados são obtidas e recuperadas pela dissolução subsequente dos arcabouços de GelMA sob condições amenas. O novo dispositivo de montagem de células acústicas 3D proposto permitirá a fabricação em escala de esferoides celulares, e até mesmo organoides, oferecendo grande potencial tecnológico no campo biológico.
Introduction
Modelos de cultura 3D in vitro, que fornecem mais características estruturais e morfológicas in vivo em comparação com modelos convencionais de cultura 2D, têm sido reconhecidos como sistemas promissores em várias aplicações biomédicas, como engenharia de tecidos, modelagem de doenças e triagem de fármacos 1,2,3. Como um tipo de modelo de cultura 3D, os esferoides celulares tipicamente se referem à agregação celular, criando estruturas esferoidais 3D caracterizadas por interações célula-célula e célula-matrizaumentadas 4,5,6. Portanto, a fabricação de esferoides celulares tornou-se uma ferramenta poderosa para viabilizar diversos estudos biológicos.
Várias técnicas, incluindo gotas suspensas7, placas não adesivas8 ou dispositivos de micropoços9, têm sido desenvolvidas para a obtenção de esferoides. Em princípio, esses métodos geralmente facilitam a montagem celular utilizando forças físicas, como a força gravitacional, minimizando as interações entre as células e o substrato. No entanto, muitas vezes envolvem processos trabalhosos, têm baixa produtividade e representam desafios para o controle do tamanho dos esferoides10,11. É importante ressaltar que a produção de esferoides com o tamanho desejado e uniformidade em quantidade suficiente é de extrema importância para satisfazer aplicações biológicas específicas. Em contraste com os métodos supracitados, as ondas acústicas, como um tipo de técnica de força externa 12,13,14, têm mostrado potencial para a fabricação em massa de esferoides celulares com alta qualidade e rendimento, com base no princípio de aumentar a agregação celular através de forças externas 15,16,17,18. Diferentemente das forças eletromagnéticas ou magnéticas, as técnicas de manipulação celular baseadas em acústica são não invasivas e livres de marcação, possibilitando a formação de esferoides com excelente biocompatibilidade19,20.
Comumente, dispositivos baseados em ondas acústicas de superfície estacionária (WAS) e ondas acústicas em massa (BAWs) têm sido desenvolvidos para gerar esferoides, utilizando os nós acústicos (NAs) produzidos pelos campos acústicos estacionários correspondentes21,22,23. Particularmente, dispositivos de montagem acústica baseados em BAWs, com os méritos de fabricação conveniente, fácil operação e excelente escalabilidade, têm ganhado atenção para a fabricação de esferoides celulares 24,25. Recentemente, desenvolvemos um dispositivo de montagem acústica fácil baseado em BAWs com a capacidade de gerar esferoides com alto rendimento26. O dispositivo proposto consiste em uma câmara quadrada de polimetilmetacrilato (PMMA) com três transdutores de titanato de zirconato de chumbo (PZT) dispostos respectivamente no plano X/Y/Z. Esse arranjo permite a criação de um padrão 3D de nós acústicos levitados (LANs) para a montagem de células de condução. Em comparação com dispositivos baseados em BAWs ou SAWs relatados anteriormente, que só podem criar uma matriz 1D ou 2D de NAs 27,28,29, o presente dispositivo permite um arranjo de pontos 3D de LANs para a rápida formação de agregados celulares dentro da solução de gelatina metacriloíla (GelMA). Posteriormente, agregados celulares amadureceram em esferoides com alta viabilidade dentro dos arcabouços fotocuráveis de GelMA após três dias de cultivo. Finalmente, um grande número de esferoides com tamanho uniforme foi facilmente obtido dos scaffolds GelMA para aplicações a jusante.
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Protocol
1. Fabricação do dispositivo de montagem acústica 3D
- Comece preparando quatro folhas de PMMA de 1 mm de espessura através de corte a laser30 e, em seguida, prossiga para colá-las para formar uma câmara quadrada com uma largura interna de 21 mm e uma altura de 10 mm.
- Em seguida, fixe outra folha de PMMA de 1 mm de espessura no fundo da câmara para servir como suporte para a biotinta.
- Afixar cuidadosamente três transdutores de titanato de zirconato de chumbo (PZT) (cada um medindo 20 mm de comprimento, 10 mm de largura, 0,7 mm de espessura e com uma frequência de ressonância primária de 3 MHz, ver Tabela de Materiais) no exterior das três paredes ortogonais da câmara, respectivamente. Certifique-se de que o transdutor PZT inferior esteja centralizado sob a câmara.
- Solda fios para as duas áreas condutoras de cada transdutor PZT.
- Finalmente, prenda o dispositivo em uma base oca para evitar que o PZT inferior entre em contato com outras bancadas.
2. Configuração do sistema de montagem acústica
- Comece montando o dispositivo acústico em um palco de microscópio, permitindo a observação de cima do interior da câmara.
- Posicione um microscópio digital na lateral do aparelho livre de transdutores PZT, permitindo a observação lateral do interior da câmara.
- Conecte independentemente os fios dos três transdutores PZT em série a três amplificadores de potência e três canais de saída de geradores de função (consulte Tabela de Materiais).
- Programe as configurações nos geradores de função para cada transdutor PZT, especificando parâmetros como forma de onda senoidal, frequência e amplitude.
- Para garantir a esterilização, encha a câmara do dispositivo acústico com álcool a 75% por 5 minutos, seguido de uma limpeza completa com solução estéril de PBS. Em seguida, irradiar a câmara com luz UV em uma bancada limpa por um mínimo de 1 h.
3. Cultura celular e procedimento de colheita
- Comece cultivando células C3A, uma linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano, em um frasco de cultura de células T25 usando o meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
- Quando as células C3A atingirem aproximadamente 80% de confluência, realizar a passagem celular da seguinte forma: primeiramente, lavar o fundo do frasco de cultura duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ao frasco de cultura celular e incubar a 37 °C para facilitar o desprendimento celular. Interromper o processo de tripsinização adicionando 2 mL de meio de cultura completo.
- Transfira a solução celular para um tubo de 15 mL e centrifugue-a a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente para obter um pellet de célula.
4. Preparação da biotinta
- Preparar uma solução de GelMA a 6% (p/v) contendo 0,5% (p/v) de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) dissolvendo 0,3 g de GelMA e 0,025 g de LAP (ver Tabela de Materiais) em 5 ml de solução tampão fosfato (PBS). Deixe a mistura descansar em banho-maria a 47 °C durante 1 h.
- Antes de misturar com células, passe a solução de GelMA através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) para esterilização.
- Ressuspender o pellet celular mencionado acima (passo 3.3) em meio de cultura celular. Colorir um pequeno volume de células com uma solução de azul de tripano a 0,4% e, em seguida, usar um hemocitômetro limpo para contagem celular.
- Misturar uma quantidade adequada de células C3A, calculada com base na densidade celular obtida acima, com a solução esterilizada de GelMA para preparar a biotinta com uma densidade celular de 2 × 106 células/mL.
- Para visualização dos esferoides celulares montados, pré-corar as células C3A incubando-as com rastreador de células de 2 μM (corante DiO, ver Tabela de Materiais) a 37 °C por 20 min. Em seguida, lavar as células marcadas com meio de cultura de células fresco três vezes antes do uso.
5. Montagem dos esferoides celulares utilizando o dispositivo acústico
- Pipetar mais de 1 mL da biotinta para a câmara esterilizada. Certifique-se de que a distância face a face entre a superfície do líquido e o fundo da câmara seja um múltiplo inteiro de metade do comprimento de onda acústico.
NOTA: Pode-se controlar essa distância ajustando o volume de biotinta adicionada. O comprimento de onda acústico (λ) pode ser estimado usando a fórmula λ = c/f, onde c representa a velocidade do som no meio, e f é a frequência do transdutor PZT. - Ligue o gerador de função e o amplificador de potência para iniciar o acionamento de cada transdutor PZT.
NOTA: Recomenda-se acionar individualmente cada transdutor PZT primeiro para atingir o padrão celular de linha paralela ideal. Isso pode ser obtido através da realização de uma varredura de frequência com um tamanho de passo de 0,001 MHz próximo à frequência de ressonância primária para cada transdutor PZT. Depois, aplicar simultaneamente esses sinais ótimos a todos os três transdutores PZT para obter o padrão celular esperado de pontos 3D. Antes de aplicar cada sinal de entrada, certifique-se de que as células estão uniformemente dispersas na biotinta, agitando suavemente. - Crosslink da biotinta usando luz azul (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) para criar um arcabouço de hidrogel 3D que encapsula os agregados celulares montados acusticamente. Depois, desligue o gerador de função e o amplificador de potência.
- Transfira cuidadosamente o arcabouço de hidrogel 3D da câmara para uma placa de Petri e corte-o em pequenos pedaços (por exemplo, 2 mm × 2 mm × 2 mm) usando uma navalha limpa.
- Adicionar meio de cultura celular para cultivo.
OBS: Lembre-se de trocar o meio de cultura todos os dias.
6. Recuperando esferoides celulares
- Comece observando a formação de esferoides em diferentes camadas dos scaffolds usando um microscópio invertido.
- Após 3 dias de cultura, retirar o meio de cultura e lavar bem os arcabouços de hidrogel duas vezes com PBS.
- Incubar os scaffolds com mais de 2 mL de tampão de lise GelMA em uma diluição de 1: 200 com meio de cultura celular por 30 min em uma incubadora celular. Esta etapa tem como objetivo dissolver os arcabouços de hidrogel.
- Transfira a solução do passo anterior para um tubo e, em seguida, centrifugue-a a 200 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente para obter a pastilha esferoide celular.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio de cultura fresco para aplicações a jusante.
7. Análise de viabilidade esferoide
- Avaliar a viabilidade de esferoides celulares dentro dos suportes de hidrogel ou nos esferoides recuperados usando um kit de coloração vivo/morto (ver Tabela de Materiais).
- Incubar as amostras em diferentes momentos de cultura com 1 mL de solução de PBS contendo 1 μL de Calceína-AM e 2 μL de Iodeto de Propídio (PI) por 15 min a 37 °C.
- Para amostras dentro dos andaimes de hidrogel, lave-as diretamente com PBS duas vezes. Para os esferoides recuperados, centrifugar a 200 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente para obter um pellet esferoide e lavá-lo duas vezes antes da observação.
- Observe as amostras usando um microscópio de fluorescência e capture as imagens de fluorescência.
- Calcular a razão entre a área corada com Calcein-AM e a área total corada com Calcein-AM e PI usando ImageJ para determinar a viabilidade esferoide.
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Representative Results
Este estudo projetou um dispositivo de montagem acústica 3D para fabricação em massa de esferoides celulares. O dispositivo acústico foi composto por uma câmara quadrada com dois transdutores PZT fixados no plano X e plano Y na superfície externa da câmara e um transdutor PZT na parte inferior da câmara (Figura 1A,B). Três canais de saída de dois geradores de função foram conectados a três amplificadores de potência para gerar três sinais senoidais independentes para acionar os transdutores PZT (Figura 1C).
As frequências ressonantes ótimas utilizadas para acionar os três transdutores PZT acoplados aos planos X/Y/Z da câmara foram 3,209 MHz, 3,283 MHz e 3,215 MHz, respectivamente. A amplitude ótima para os três transdutores PZT foi de 10 tensões de saída pico-a-pico (Vpp), medidas por um osciloscópio. A Figura 2A ilustra o mecanismo de funcionamento dos agregados celulares gerados utilizando o dispositivo de montagem acústica 3D. Quando o sinal é aplicado, as células são conduzidas aos nós acústicos sob a influência da força de radiação acústica (ARF). Para visualização dos esferoides celulares, as células foram pré-coradas com 2 μM de DiO (fluorescência verde). Após a montagem acústica das células, um microscópio confocal foi utilizado para observar os agregados celulares montados acusticamente em 3D. Observou-se que esses agregados celulares estavam dispostos em um padrão regular de arranjo de pontos 3D com sinais fluorescentes verdes uniformes (Figura 2B). Diferentes visualizações superiores de imagens de campo claro também demonstraram que os agregados formados em cada camada foram dispostos em um padrão de arranjo de pontos 2D (Figura 2C).
Observou-se o crescimento de agregados celulares no interior do hidrogel em diferentes momentos. Os resultados mostraram que os agregados montados gradualmente se integraram e formaram esferoides apertados até o dia 3, acompanhados por um aumento no diâmetro esferoide (Figura 3A,B). Uma coloração viva/morta foi realizada para avaliar a viabilidade dos esferoides celulares. Boas viabilidades celulares (>90%) foram alcançadas antes do 3º dia, enquanto a viabilidade diminuiu ligeiramente após uma semana de cultura (Figura 3C,D).
Para a recuperação dos esferoides, um tampão de lise GelMA foi utilizado para dissociar os arcabouços de hidrogel, liberando os esferoides celulares encapsulados (Figura 4A). Consequentemente, após três dias de cultivo, os pequenos pedaços de arcabouços de hidrogel foram tratados com tampão de lise GelMA a 37 °C por 30 min. Os esferoides liberados mantiveram boa morfologia esférica com distribuição de tamanho estreita, expressão de albumina e viabilidade desejável (Figura 4B-D).
Figura 1: Dispositivo de montagem acústica 3D. (A) Diagrama esquemático representando a visão superior do dispositivo de montagem acústica 3D, consistindo de uma câmara de PMMA acoplada com três transdutores PZT. (B) Fotografia exibindo o dispositivo de montagem acústica 3D real. (C) Fotografia mostrando o dispositivo de montagem acústica 3D conectado com dois geradores de função e três amplificadores de potência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Agregados celulares montados acusticamente. (A) Esquema ilustrativo do mecanismo de funcionamento dos agregados celulares gerados pelo dispositivo de montagem acústica 3D, onde as células são conduzidas aos nós acústicos pela força de radiação acústica. (B) Imagens confocais mostrando os agregados celulares 3D acusticamente montados sob diferentes perspectivas. (C) Imagens de campo claro mostrando os agregados celulares formados em várias camadas dentro do arcabouço de hidrogel. A barra de escala representa 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento de agregados celulares em esferoides dentro do arcabouço GelMA. (A) Imagens de campo claro mostrando a formação de esferoides celulares compactos após um período de cultura de 3 dias. (B) Quantificação dos tamanhos esferoides. (C) Coloração viva/morta de esferoides dentro do arcabouço de hidrogel após uma semana de cultura. (D) Quantificação da viabilidade esferoide celular. A barra de escala representa 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Recuperação de esferoides celulares fabricados acusticamente. (A) Ilustração descrevendo os passos para a recuperação de esferoides celulares fabricados acusticamente. (B) Imagens de campo claro exibindo os esferoides recuperados em diferentes ampliações. A barra de escala representa 250 μm. (C) Análise da viabilidade e funcionalidade dos esferoides recuperados. A barra de escala representa 100 μm. (D) Distribuição de tamanho dos esferoides após a recuperação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A fabricação eficiente e estável de esferoides celulares com alto rendimento usando tecnologias como o dispositivo de montagem acústica 3D é uma grande promessa para o avanço da engenharia biomédica e triagem de drogas 1,2,3. Esta abordagem simplifica a produção em massa de esferoides celulares através de procedimentos simples.
No entanto, existem fatores críticos a serem considerados ao utilizar esse dispositivo acústico. A criação de ondas estacionárias é essencial para a construção de um campo acústico 3D-dot array. Neste dispositivo, apenas um transdutor PZT está presente em cada dimensão, servindo como fonte de excitação sonora. Portanto, para cada dimensão, é crucial que a distância face a face entre as paredes opostas da câmara de PMMA ou superfície de água de PMMA seja um múltiplo inteiro de metade do comprimento de onda. A frequência primária dos transdutores PZT que usamos é de 1 MHz, o que resulta em um comprimento de onda na água ou biotinta de cerca de 500 μm. Consequentemente, para a dimensão horizontal, a distância face a face entre as duas paredes opostas da câmara de PMMA no dispositivo acústico foi ajustada para 21 mm, considerando o tamanho dos transdutores PZT. Para a dimensão vertical, a distância face a face entre a parede inferior de PMMA e a superfície da água pode ser ajustada variando-se o volume de biotinta para atender às condições de formação de ondas estacionárias. Durante a operação experimental, pequenos ajustes de frequência podem ser necessários para compensar os desvios de distância. Além disso, é importante manter a tensão de entrada em um nível moderado para evitar o superaquecimento do transdutor PZT, que poderia aquecer a biotinta e potencialmente danificar as células. Nos experimentos, utilizou-se uma tensão pico-a-pico de 10 Vpp, completando a montagem do agregado celular em 30 s, mantendo a temperatura da biotinta abaixo de 30 °C.
Uma limitação dessa abordagem é a dependência do arcabouço GelMA26, que desempenha um papel crucial na manutenção da integridade estrutural dos agregados celulares montados acusticamente à medida que amadurecem em esferoides celulares quando o campo acústico é removido. No entanto, a etapa que envolve a dissolução dos arcabouços de hidrogel para recuperação esferoide pode levar à redução da viabilidade celular e potencial perda esferoide. Além disso, o volume do arcabouço GelMA precisa estar dentro da faixa de vários milímetros para permitir a penetração e troca de nutrientes para as células encapsuladas. O tamanho limitado do andaime na faixa milimétrica pode restringir o rendimento de produção de esferoides celulares, mesmo que andaimes maiores sejam inicialmente produzidos e depois cortados em pedaços menores. Esforços futuros podem se concentrar na manutenção de agregados celulares montados acusticamente in situ, suspensos no meio de cultura, para permitir que eles cresçam em esferoides sem a necessidade de um arcabouço externo.
Em resumo, o dispositivo de montagem acústica descrito neste protocolo pode ser facilmente montado e operado com passos relativamente simples, oferecendo a vantagem de fabricar eficientemente esferoides celulares. Além disso, este dispositivo de montagem acústica é compatível com vários tipos de células, incluindo a fabricação de organoides, mostrando seu potencial significativo para uma ampla gama de aplicações biomédicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1104600) e pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang da China (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
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