Summary
Les sphéroïdes cellulaires ont été considérés comme un modèle potentiel dans le domaine des applications biologiques. Cet article décrit les protocoles permettant de générer de manière évolutive des sphéroïdes cellulaires à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D, qui fournit une méthode efficace pour la fabrication robuste et rapide de sphéroïdes cellulaires uniformes.
Abstract
Les sphéroïdes cellulaires sont des modèles tridimensionnels (3D) prometteurs qui ont de nombreuses applications dans de nombreux domaines biologiques. Ce protocole présente une méthode de fabrication de sphéroïdes cellulaires de haute qualité et à haut débit à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D par des procédures manœuvrables. Le dispositif d’assemblage acoustique se compose de trois transducteurs en titanate de zirconate de plomb (PZT), chacun disposé dans le plan X/Y/Z d’une chambre carrée en polyméthacrylate de méthyle (PMMA). Cette configuration permet la génération d’un réseau de points 3D de nœuds acoustiques en lévitation (LAN) lorsque trois signaux sont appliqués. En conséquence, les cellules de la solution de gélatine méthacryloyl (GelMA) peuvent être conduites vers les réseaux locaux, formant des agrégats cellulaires uniformes en trois dimensions. La solution GelMA est ensuite photopolymérisée par UV et réticulée pour servir d’échafaudage qui soutient la croissance des agrégats cellulaires. Enfin, des masses de sphéroïdes matures sont obtenues et récupérées en dissolvant ensuite les échafaudages GelMA dans des conditions douces. Le nouveau dispositif d’assemblage de cellules acoustiques 3D proposé permettra la fabrication à grande échelle de sphéroïdes cellulaires, et même d’organoïdes, offrant ainsi un grand potentiel technologique dans le domaine biologique.
Introduction
Les modèles de culture in vitro 3D, qui offrent des caractéristiques structurelles et morphologiques plus proches de celles de l’in vivo que les modèles de culture 2D conventionnels, ont été reconnus comme des systèmes prometteurs dans diverses applications biomédicales telles que l’ingénierie tissulaire, la modélisation des maladies et le criblage de médicaments 1,2,3. En tant que type de modèle de culture 3D, les sphéroïdes cellulaires font généralement référence à l’agrégation cellulaire, créant des structures sphéroïdales 3D caractérisées par des interactions cellule-cellule et cellule-matriceaméliorées 4,5,6. Par conséquent, la fabrication de sphéroïdes cellulaires est devenue un outil puissant pour permettre diverses études biologiques.
Diverses techniques, dont la goutte suspendue7, les plaques non adhésives8 ou les dispositifs à micropuits9, ont été développées pour obtenir des sphéroïdes. En principe, ces méthodes facilitent généralement l’assemblage des cellules en utilisant des forces physiques telles que la force gravitationnelle tout en minimisant les interactions entre les cellules et le substrat. Cependant, ils impliquent souvent des processus à forte intensité de main-d’œuvre, ont une faible productivité et posent des défis pour le contrôle de la taille des sphéroïdes10,11. Il est important de noter que la production de sphéroïdes de la taille et de l’uniformité souhaitées en quantité suffisante est de la plus haute importance pour satisfaire des applications biologiques spécifiques. Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, les ondes acoustiques, en tant que type de technique pilotée par des forces externes 12,13,14, ont montré un potentiel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires de haute qualité et de haut débit, sur la base du principe de l’amélioration de l’agrégation cellulaire par des forces externes 15,16,17,18. Contrairement aux forces électromagnétiques ou magnétiques, les techniques de manipulation cellulaire acoustiques sont non invasives et sans marquage, ce qui permet la formation de sphéroïdes avec une excellente biocompatibilité19,20.
Généralement, des dispositifs à base d’ondes acoustiques de surface stationnaires (SAW) et d’ondes acoustiques de masse (BAW) ont été développés pour générer des sphéroïdes, en utilisant les nœuds acoustiques (AN) produits par les champs acoustiques stationnaires correspondants 21,22,23. En particulier, les dispositifs d’assemblage acoustique à base de BAW, avec les mérites d’une fabrication pratique, d’une utilisation facile et d’une excellente évolutivité, ont attiré l’attention pour la fabrication de sphéroïdes cellulaires24,25. Nous avons récemment développé un dispositif d’assemblage acoustique simple à base de BAW avec la capacité de générer des sphéroïdes à haut débit26. Le dispositif proposé se compose d’une chambre carrée en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) avec trois transducteurs en titanate de zirconate de plomb (PZT) disposés respectivement dans le plan X/Y/Z. Cette disposition permet la création d’un réseau de points 3D de nœuds acoustiques en lévitation (LAN) pour l’assemblage de cellules de pilotage. Par rapport aux dispositifs à base de BAW ou de SAW précédemment signalés, qui ne peuvent créer qu’un réseau 1D ou 2D d’ANs 27,28,29, le dispositif actuel permet un réseau de points 3D de LAN pour la formation rapide d’agrégats cellulaires dans la solution de gélatine méthacryloyl (GelMA). Par la suite, les agrégats cellulaires ont mûri en sphéroïdes à haute viabilité dans les échafaudages photopolymérisés de GelMA après trois jours de culture. Enfin, un grand nombre de sphéroïdes de taille uniforme ont été facilement obtenus à partir des échafaudages GelMA pour des applications en aval.
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Protocol
1. Fabrication du dispositif d’assemblage acoustique 3D
- Commencez par préparer quatre feuilles de PMMA de 1 mm d’épaisseur par découpe laser30, puis collez-les ensemble pour former une chambre carrée d’une largeur intérieure de 21 mm et d’une hauteur de 10 mm.
- Ensuite, fixez une autre feuille de PMMA de 1 mm d’épaisseur au fond de la chambre pour servir de support à la bio-encre.
- Fixez soigneusement trois transducteurs en titanate de zirconate de plomb (PZT) (chacun mesurant 20 mm de longueur, 10 mm de largeur, 0,7 mm d’épaisseur et avec une fréquence de résonance primaire de 3 MHz, voir le tableau des matériaux) à l’extérieur des trois parois orthogonales de la chambre, respectivement. Assurez-vous que le transducteur PZT inférieur est centré sous la chambre.
- Soudez les fils aux deux zones conductrices de chaque transducteur PZT.
- Enfin, fixez l’appareil sur une base creuse pour éviter que le PZT inférieur n’entre en contact avec d’autres comptoirs.
2. Mise en place du système d’assemblage acoustique
- Commencez par monter l’appareil acoustique sur une platine de microscope, ce qui permet d’observer l’intérieur de la chambre en vue de dessus.
- Placez un microscope numérique sur le côté de l’appareil qui est exempt de transducteurs PZT, ce qui permet d’observer l’intérieur de la chambre en vue latérale.
- Connectez indépendamment les fils des trois transducteurs PZT en série à trois amplificateurs de puissance et à trois canaux de sortie des générateurs de fonctions (voir tableau des matériaux).
- Programmez les paramètres sur les générateurs de fonctions pour chaque transducteur PZT, en spécifiant des paramètres tels que la forme d’onde sinusoïdale, la fréquence et l’amplitude.
- Pour assurer la stérilisation, remplissez la chambre du dispositif acoustique avec de l’alcool à 75% pendant 5 min, suivi d’un nettoyage en profondeur avec une solution stérile de PBS. Par la suite, irradiez la chambre avec de la lumière UV dans un banc propre pendant au moins 1 h.
3. Procédure de culture cellulaire et de récolte
- Commencez par cultiver des cellules C3A, une lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain, dans un flacon de culture cellulaire T25 en utilisant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matériaux).
- Lorsque les cellules C3A atteignent environ 80 % de confluence, effectuez le passage cellulaire comme suit : tout d’abord, lavez le fond du flacon de culture deux fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le flacon de culture cellulaire et incuber à 37 °C pour faciliter le détachement cellulaire. Arrêtez le processus de trypsinisation en ajoutant 2 mL de milieu de culture complet.
- Transvaser la solution cellulaire dans un tube de 15 mL et la centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une pastille cellulaire.
4. Préparation de la bio-encre
- Préparer une solution de GelMA à 6 % (p/v) contenant 0,5 % (p/v) de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) en dissolvant 0,3 g de GelMA et 0,025 g de LAP (voir le tableau des matériaux) dans 5 mL de solution tampon de phosphate (PBS). Laisser reposer le mélange dans un bain-marie à 47 °C pendant 1 h.
- Avant de mélanger avec les cellules, passer la solution de GelMA à travers un filtre de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) pour la stérilisation.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire mentionnée ci-dessus (étape 3.3) dans un milieu de culture cellulaire. Colorez un petit volume de cellules avec une solution de bleu de trypan à 0,4 %, puis utilisez un hémocytomètre propre pour le comptage des cellules.
- Mélangez une quantité appropriée de cellules C3A, calculée sur la base de la densité cellulaire obtenue ci-dessus, avec la solution stérilisée de GelMA pour préparer la bio-encre avec une densité cellulaire de 2 × 106 cellules/mL.
- Pour visualiser les sphéroïdes cellulaires assemblés, pré-colorer les cellules C3A en les incubant avec un tracker cellulaire de 2 μM (colorant DiO, voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 20 min. Par la suite, lavez les cellules marquées avec un milieu de culture cellulaire frais trois fois avant utilisation.
5. Assemblage des sphéroïdes cellulaires à l’aide du dispositif acoustique
- Pipeter plus de 1 mL de bio-encre dans la chambre stérilisée. Assurez-vous que la distance face à face entre la surface du liquide et le fond de la chambre est un multiple entier de la moitié de la longueur d’onde acoustique.
REMARQUE : On peut contrôler cette distance en ajustant le volume de bioencre ajoutée. La longueur d’onde acoustique (λ) peut être estimée à l’aide de la formule λ = c/f, où c représente la vitesse du son dans le milieu et f est la fréquence du transducteur PZT. - Allumez le générateur de fonction et l’amplificateur de puissance pour lancer l’actionnement de chaque transducteur PZT.
REMARQUE : Il est recommandé d’actionner d’abord individuellement chaque transducteur PZT pour obtenir le modèle cellulaire de ligne parallèle optimal. Ceci peut être réalisé en effectuant un balayage de fréquence avec une taille de pas de 0,001 MHz près de la fréquence de résonance primaire pour chaque transducteur PZT. Ensuite, appliquez simultanément ces signaux optimaux aux trois transducteurs PZT pour obtenir le motif cellulaire 3D attendu. Avant d’appliquer chaque signal d’entrée, assurez-vous que les cellules sont uniformément dispersées dans la bio-encre en agitant doucement. - Réticulation de la bio-encre à l’aide de la lumière bleue (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) pour créer un échafaudage d’hydrogel 3D qui encapsule les agrégats cellulaires assemblés acoustiquement. Ensuite, éteignez le générateur de fonctions et l’amplificateur de puissance.
- Transférez soigneusement l’échafaudage en hydrogel 3D de la chambre dans une boîte de Pétri et coupez-le en petits morceaux (par exemple, 2 mm × 2 mm × 2 mm) à l’aide d’un rasoir propre.
- Ajouter un milieu de culture cellulaire pour la culture.
REMARQUE : N’oubliez pas de changer le milieu de culture tous les jours.
6. Récupération des sphéroïdes cellulaires
- Commencez par observer la formation de sphéroïdes à différentes couches des échafaudages à l’aide d’un microscope inversé.
- Après 3 jours de culture, retirez le milieu de culture et lavez soigneusement les échafaudages en hydrogel deux fois avec du PBS.
- Incuber les échafaudages avec plus de 2 mL de tampon de lyse GelMA à une dilution de 1 :200 avec un milieu de culture cellulaire pendant 30 min dans un incubateur cellulaire. Cette étape vise à dissoudre les échafaudages en hydrogel.
- Transvaser la solution de l’étape précédente dans un tube puis la centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir la pastille sphéroïde cellulaire.
- Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture frais pour les applications en aval.
7. Analyse de la viabilité des sphéroïdes
- Évaluer la viabilité des sphéroïdes cellulaires soit dans les échafaudages d’hydrogel, soit dans les sphéroïdes récupérés à l’aide d’une trousse de coloration vivante ou morte (voir le tableau des matériaux).
- Incuber les échantillons à différents moments de culture avec 1 mL de solution de PBS contenant 1 μL de calcéine-AM et 2 μL d’iodure de propidium (PI) pendant 15 min à 37 °C.
- Pour les échantillons à l’intérieur des échafaudages en hydrogel, lavez-les directement avec du PBS deux fois. Pour les sphéroïdes prélevés, centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une pastille sphéroïde, et la laver deux fois avant l’observation.
- Observez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence et capturez les images de fluorescence.
- Calculez le rapport entre la surface colorée avec Calcein-AM et la surface totale colorée avec Calcein-AM et PI à l’aide d’ImageJ pour déterminer la viabilité du sphéroïde.
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Representative Results
Cette étude a permis de concevoir un dispositif d’assemblage acoustique 3D pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires. Le dispositif acoustique se composait d’une chambre carrée avec deux transducteurs PZT fixés au plan X et au plan Y sur la surface extérieure de la chambre et un transducteur PZT au fond de la chambre (Figure 1A,B). Trois canaux de sortie de deux générateurs de fonctions ont été connectés à trois amplificateurs de puissance pour générer trois signaux sinusoïdaux indépendants afin d’actionner les transducteurs PZT (Figure 1C).
Les fréquences de résonance optimales utilisées pour actionner les trois transducteurs PZT fixés aux plans X/Y/Z de la chambre étaient respectivement de 3,209 MHz, 3,283 MHz et 3,215 MHz. L’amplitude optimale pour les trois transducteurs PZT était de 10 tension de sortie crête à crête (Vpp), mesurée par un oscilloscope. La figure 2A illustre le mécanisme de fonctionnement des agrégats de cellules générés à l’aide du dispositif d’assemblage acoustique 3D. Lorsque le signal est appliqué, les cellules sont dirigées vers les nœuds acoustiques sous l’influence de la force de rayonnement acoustique (ARF). Pour visualiser les sphéroïdes cellulaires, les cellules ont été pré-colorées avec 2 μM DiO (fluorescence verte). Après l’assemblage des cellules acoustiques, un microscope confocal a été utilisé pour observer les agrégats cellulaires assemblés acoustiquement en 3D. On a observé que ces agrégats de cellules étaient disposés selon un réseau de points 3D régulier avec des signaux fluorescents verts uniformes (Figure 2B). Différentes vues de dessus d’images en fond clair ont également démontré que les agrégats formés dans chaque couche étaient disposés selon un motif de réseau de points 2D (Figure 2C).
La croissance des agrégats cellulaires dans l’hydrogel à différents moments a été observée. Les résultats ont montré que les agrégats assemblés se sont progressivement intégrés et ont formé des sphéroïdes serrés au jour 3, accompagnés d’une augmentation du diamètre du sphéroïde (Figure 3A,B). Une coloration vivante/morte a été réalisée pour évaluer la viabilité des sphéroïdes cellulaires. De bonnes viabilités cellulaires (>90 %) ont été obtenues avant le jour 3, tandis que la viabilité a légèrement diminué après une semaine de culture (Figure 3C,D).
Pour la récupération des sphéroïdes, un tampon de lyse GelMA a été utilisé pour dissocier les échafaudages d’hydrogel, libérant ainsi les sphéroïdes cellulaires encapsulés (Figure 4A). Par conséquent, après trois jours de culture, les petits morceaux d’échafaudages en hydrogel ont été traités avec un tampon de lyse GelMA à 37 °C pendant 30 min. Les sphéroïdes libérés ont conservé une bonne morphologie sphérique avec une distribution granulométrique étroite, ainsi que l’expression de l’albumine et la viabilité souhaitable (Figure 4B-D).
Figure 1 : Dispositif d’assemblage acoustique 3D. (A) Schéma de principe représentant la vue de dessus du dispositif d’assemblage acoustique 3D, constitué d’une chambre en PMMA fixée à trois transducteurs PZT. (B) Photographie montrant le dispositif d’assemblage acoustique 3D réel. (C) Photographie montrant le dispositif d’assemblage acoustique 3D relié à deux générateurs de fonctions et à trois amplificateurs de puissance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Agrégats de cellules assemblés acoustiquement. (A) Schéma illustrant le mécanisme de fonctionnement des agrégats de cellules générés par le dispositif d’assemblage acoustique 3D, où les cellules sont entraînées vers les nœuds acoustiques par la force de rayonnement acoustique. (B) Images confocales montrant les agrégats de cellules acoustiquement assemblées en 3D sous différents angles. (C) Images en fond clair montrant les agrégats de cellules formées à différentes couches de l’échafaudage d’hydrogel. La barre d’échelle représente 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Croissance des agrégats cellulaires en sphéroïdes à l’intérieur de l’échafaudage GelMA. (A) Images en fond clair montrant la formation de sphéroïdes cellulaires compacts après une période de culture de 3 jours. (B) Quantification de la taille des sphéroïdes. (C) Coloration vivante/morte des sphéroïdes à l’intérieur de l’échafaudage d’hydrogel après une semaine de culture. (D) Quantification de la viabilité des sphéroïdes cellulaires. La barre d’échelle représente 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Récupération de sphéroïdes cellulaires fabriqués acoustiquement. (A) Illustration illustrant les étapes de récupération des sphéroïdes cellulaires fabriqués acoustiquement. (B) Images en fond clair montrant les sphéroïdes récupérés à différents grossissements. La barre d’échelle représente 250 μm. (C) Analyse de la viabilité et de la fonctionnalité des sphéroïdes récupérés. La barre d’échelle représente 100 μm. (D) Distribution granulométrique des sphéroïdes après récupération. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La fabrication efficace et stable de sphéroïdes cellulaires à haut débit à l’aide de technologies telles que le dispositif d’assemblage acoustique 3D est très prometteuse pour faire progresser l’ingénierie biomédicale et le criblage de médicaments 1,2,3. Cette approche simplifie la production de masse de sphéroïdes cellulaires grâce à des procédures simples.
Cependant, il y a des facteurs critiques à prendre en compte lors de l’utilisation de cet appareil acoustique. La création d’ondes stationnaires est essentielle à la construction d’un champ acoustique à réseau de points 3D. Dans cet appareil, un seul transducteur PZT est présent dans chaque dimension, servant de source d’excitation sonore. Par conséquent, pour chaque dimension, il est crucial que la distance face à face entre les parois opposées de la chambre en PMMA ou de la surface de l’eau en PMMA soit un multiple entier de la moitié de la longueur d’onde. La fréquence primaire des transducteurs PZT que nous avons utilisés est de 1 MHz, ce qui se traduit par une longueur d’onde dans l’eau ou la bio-encre d’environ 500 μm. Par conséquent, pour la dimension horizontale, la distance face à face entre les deux parois opposées de la chambre en PMMA dans le dispositif acoustique a été fixée à 21 mm, en tenant compte de la taille des transducteurs PZT. Pour la dimension verticale, la distance face à face entre la paroi inférieure en PMMA et la surface de l’eau peut être ajustée en faisant varier le volume de bio-encre pour répondre aux conditions de formation d’ondes stationnaires. Pendant le fonctionnement expérimental, de légers ajustements de fréquence peuvent être nécessaires pour compenser les écarts de distance. De plus, il est important de maintenir la tension d’entrée à un niveau modéré pour éviter la surchauffe du transducteur PZT, ce qui pourrait chauffer la bio-encre et potentiellement endommager les cellules. Dans les expériences, une tension crête-crête de 10 Vpp a été utilisée, complétant l’assemblage de l’agrégat de cellule en 30 s tout en maintenant la température de la bio-encre en dessous de 30 °C.
L’une des limites de cette approche est la dépendance à l’échafaudage GelMA26, qui joue un rôle crucial dans le maintien de l’intégrité structurelle des agrégats cellulaires assemblés acoustiquement lorsqu’ils mûrissent en sphéroïdes cellulaires lorsque le champ acoustique est supprimé. Cependant, l’étape impliquant la dissolution des échafaudages d’hydrogel pour la récupération des sphéroïdes peut entraîner une réduction de la viabilité cellulaire et une perte potentielle de sphéroïdes. De plus, le volume de l’échafaudage GelMA doit être de l’ordre de plusieurs millimètres pour permettre la pénétration et l’échange des nutriments pour les cellules encapsulées. La taille limitée de l’échafaudage de l’ordre du millimètre peut limiter le rendement de production des sphéroïdes cellulaires, même si des échafaudages plus grands sont initialement produits, puis coupés en morceaux plus petits. Les efforts futurs pourraient se concentrer sur le maintien d’agrégats cellulaires acoustiquement assemblés in situ, en suspension dans le milieu de culture, pour leur permettre de se développer en sphéroïdes sans avoir besoin d’un échafaudage externe.
En résumé, le dispositif d’assemblage acoustique décrit dans ce protocole peut être facilement assemblé et utilisé en quelques étapes relativement simples, offrant l’avantage de fabriquer efficacement des sphéroïdes cellulaires. De plus, ce dispositif d’assemblage acoustique est compatible avec divers types de cellules, y compris la fabrication d’organoïdes, démontrant son potentiel important pour un large éventail d’applications biomédicales.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le Programme national clé de recherche et de développement de la Chine (2022YFA1104600) et la Fondation provinciale des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
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