Summary
Cellsfäroider har ansetts vara en potentiell modell inom biologiska tillämpningar. Den här artikeln beskriver protokoll för skalbar generering av cellsfäroider med hjälp av en akustisk 3D-monteringsenhet, vilket ger en effektiv metod för robust och snabb tillverkning av enhetliga cellsfäroider.
Abstract
Cellsfäroider är lovande tredimensionella (3D) modeller som har fått breda tillämpningar inom många biologiska områden. Detta protokoll presenterar en metod för tillverkning av högkvalitativa och höggenomförda cellsfäroider med hjälp av en 3D-akustisk monteringsanordning genom manövrerbara procedurer. Den akustiska monteringsanordningen består av tre blyzirkonattitanatgivare (PZT), var och en anordnad i X/Y/Z-planet i en fyrkantig kammare av polymetylmetakrylat (PMMA). Denna konfiguration möjliggör generering av ett 3D-punktmatrismönster av leviterade akustiska noder (LAN) när tre signaler appliceras. Som ett resultat kan celler i gelatinmetakryloyllösningen (GelMA) drivas till LAN och bilda enhetliga cellaggregat i tre dimensioner. GelMA-lösningen UV-fotohärdas sedan och tvärbinds för att fungera som en byggnadsställning som stöder tillväxten av cellaggregat. Slutligen erhålls massor av mogna sfäroider och hämtas genom att därefter lösa upp GelMA-ställningarna under milda förhållanden. Den föreslagna nya 3D-enheten för akustisk cellmontering kommer att möjliggöra uppskalning av tillverkning av cellsfäroider och till och med organoider, vilket erbjuder stor potential för teknik inom det biologiska området.
Introduction
3D in vitro-odlingsmodeller, som ger mer in vivo-liknande strukturella och morfologiska egenskaper jämfört med konventionella 2D-odlingsmodeller, har erkänts som lovande system i olika biomedicinska tillämpningar såsom vävnadsteknik, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening 1,2,3. Som en typ av 3D-odlingsmodell hänvisar cellsfäroider vanligtvis till cellaggregering, vilket skapar 3D-sfäroidala strukturer som kännetecknas av förbättrade cell-cell- och cell-matrisinteraktioner 4,5,6. Därför har tillverkning av cellsfäroider blivit ett kraftfullt verktyg för att möjliggöra olika biologiska studier.
Olika tekniker, inklusive hängande droppe7, icke-vidhäftande plattor8 eller mikrobrunnsanordningar9, har utvecklats för att erhålla sfäroider. I princip underlättar dessa metoder vanligtvis cellmontering genom att utnyttja fysiska krafter som gravitationskraft samtidigt som interaktioner mellan celler och substratet minimeras. De involverar dock ofta arbetsintensiva processer, har låg produktivitet och utgör utmaningar för att kontrollera sfäroidstorlek10,11. Det är viktigt att produktionen av sfäroider med önskad storlek och enhetlighet i tillräcklig mängd är av yttersta vikt för att tillgodose specifika biologiska tillämpningar. Till skillnad från de ovan nämnda metoderna har akustiska vågor, som en typ av extern kraftdriven teknik 12,13,14, visat potential för masstillverkning av cellsfäroider med hög kvalitet och genomströmning, baserat på principen att förbättra cellaggregering genom yttre krafter 15,16,17,18. Till skillnad från elektromagnetiska eller magnetiska krafter är akustiskt baserade cellmanipulationstekniker icke-invasiva och märkningsfria, vilket möjliggör sfäroidbildning med utmärkt biokompatibilitet19,20.
Vanligtvis har akustiska vågor på stående yta (SAW) och akustiska bulkvågor (BAW) -baserade enheter utvecklats för att generera sfäroider, med hjälp av de akustiska noderna (AN) som produceras av motsvarande stående akustiska fält 21,22,23. Speciellt akustiska monteringsanordningar baserade på BAWs, med fördelarna med bekväm tillverkning, enkel användning och utmärkt skalbarhet, har fått uppmärksamhet för tillverkning av cellsfäroider24,25. Vi har nyligen utvecklat en enkel BAWs-baserad akustisk monteringsenhet med förmågan att generera sfäroider med hög genomströmning26. Den föreslagna anordningen består av en fyrkantig polymetylmetakrylatkammare (PMMA) med tre blyzirkonattitanatgivare (PZT) anordnade i X/Y/Z-planet. Detta arrangemang gör det möjligt att skapa ett 3D-punktmatrismönster av leviterade akustiska noder (LAN) för att driva cellmontering. Jämfört med tidigare rapporterade BAWs- eller SAWs-baserade enheter, som bara kan skapa en 1D- eller 2D-array av ANs 27,28,29, möjliggör den nuvarande enheten en 3D-punktmatris av LAN för snabb cellaggregatbildning i gelatinmetakryloyllösningen (GelMA). Därefter mognade cellaggregaten till sfäroider med hög livskraft i de fotohärdade GelMA-ställningarna efter tre dagars odling. Slutligen var det lätt att få ett stort antal sfäroider med enhetlig storlek från GelMA-ställningarna för nedströmsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av den akustiska 3D-monteringsanordningen
- Börja med att förbereda fyra 1 mm tjocka PMMA-ark genom laserskärning30 och fortsätt sedan med att limma ihop dem för att bilda en fyrkantig kammare med en inre bredd på 21 mm och en höjd på 10 mm.
- Fäst sedan ytterligare ett 1 mm tjockt PMMA-ark i botten av kammaren för att fungera som hållare för biobläcket.
- Fäst försiktigt tre givare av blyzirkonattitanat (PZT) (var och en mäter 20 mm i längd, 10 mm i bredd, 0.7 mm i tjocklek och med en primär resonansfrekvens på 3 MHz, se materialtabell) på utsidan av kammarens tre ortogonala väggar. Se till att den nedre PZT-givaren är centrerad under kammaren.
- Löd ledningarna till de två ledande områdena på varje PZT-givare.
- Fäst slutligen enheten på en ihålig bas för att förhindra att den nedre PZT kommer i kontakt med andra bänkskivor.
2. Inställning av det akustiska monteringssystemet
- Börja med att montera den akustiska enheten på ett mikroskop stage, vilket möjliggör observation av kammarens inre.
- Placera ett digitalt mikroskop på den sida av enheten som är fri från PZT-givare, vilket möjliggör sidoobservation av kammarens inre.
- Anslut kablarna oberoende från de tre PZT-givarna i serie till tre effektförstärkare och tre utgångskanaler för funktionsgeneratorer (se materialförteckning).
- Programmera inställningarna på funktionsgeneratorerna för varje PZT-givare och ange parametrar som sinusformad vågform, frekvens och amplitud.
- För att säkerställa sterilisering, fyll akustikanordningens kammare med 75 % alkohol i 5 minuter, följt av en grundlig rengöring med steril PBS-lösning. Bestråla sedan kammaren med UV-ljus i en ren bänk i minst 1 timme.
3. Cellodling och skördeförfarande
- Börja med att odla C3A-celler, en human hepatocellulär karcinomcellinje, i en T25-cellodlingskolv med hjälp av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin (se materialförteckning).
- När C3A-cellerna når cirka 80 % sammanflöde, utför cellpassage enligt följande: tvätta först botten av odlingskolven två gånger med PBS. Tillsätt sedan 2 ml 0,05 % trypsin-EDTA till cellodlingskolven och inkubera vid 37 °C för att underlätta cellavlossningen. Stoppa trypsiniseringsprocessen genom att tillsätta 2 ml komplett odlingsmedium.
- Överför celllösningen till ett 15 ml rör och centrifugera den vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur för att erhålla en cellpellet.
4. Beredning av biobläcket
- Bered en 6 % (w/v) GelMA-lösning innehållande 0,5 % (w/v) litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) genom att lösa 0,3 g GelMA och 0,025 g LAP (se materialtabell) i 5 ml fosfatbuffertlösning (PBS). Låt blandningen stå i ett 47 °C vattenbad i 1 timme.
- Innan blandning med celler, passera GelMA-lösningen genom ett 0.22 μm filter (se materialtabell) för sterilisering.
- Återsuspendera cellpelleten som nämns ovan (steg 3.3) i cellodlingsmediet. Färga en liten volym celler med en 0,4 % trypanblå lösning och använd sedan en ren hemocytometer för cellräkning.
- Blanda en lämplig mängd C3A-celler, beräknad på grundval av den celltäthet som erhållits ovan, med den steriliserade GelMA-lösningen för att bereda biobläcket med en celltäthet på 2 × 106 celler/ml.
- För visualisering av de sammansatta cellsfäroiderna, förfärga C3A-cellerna genom att inkubera dem med 2 μM cellspårare (DiO-färgämne, se materialtabell) vid 37 °C i 20 minuter. Tvätta sedan de märkta cellerna med färskt cellodlingsmedium tre gånger före användning.
5. Montering av cellsfäroiderna med hjälp av den akustiska anordningen
- Pipettera mer än 1 ml av biobläcket i den steriliserade kammaren. Se till att avståndet ansikte mot ansikte mellan vätskeytan och kammarens botten är en heltalsmultipel av halva den akustiska våglängden.
OBS: Man kan kontrollera detta avstånd genom att justera volymen biobläck som tillsätts. Den akustiska våglängden (λ) kan uppskattas med formeln λ = c/f, där c representerar ljudets hastighet i mediet och f är frekvensen för PZT-givaren. - Slå på funktionsgeneratorn och effektförstärkaren för att initiera aktiveringen av varje PZT-givare.
OBS: Det rekommenderas att aktivera varje PZT-givare individuellt först för att uppnå det optimala cellulära mönstret med parallelllinje. Detta kan uppnås genom att utföra ett frekvenssvep med en stegstorlek på 0,001 MHz nära den primära resonansfrekvensen för varje PZT-givare. Applicera sedan dessa optimala signaler samtidigt på alla tre PZT-givarna för att få det förväntade cellulära mönstret med 3D-punkter. Innan du applicerar varje insignal, se till att cellerna är jämnt fördelade i biobläcket genom att försiktigt röra om. - Tvärbinda biobläcket med blått ljus (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) för att skapa en 3D-hydrogelställning som kapslar in cellaggregaten som monteras akustiskt. Stäng sedan av funktionsgeneratorn och effektförstärkaren.
- Överför försiktigt 3D-hydrogelställningen från kammaren till en petriskål och skär den i små bitar (t.ex. 2 mm × 2 mm × 2 mm) med en ren rakhyvel.
- Tillsätt cellodlingsmedium för odling.
OBS: Kom ihåg att byta odlingsmedium varje dag.
6. Hämtning av cellsfäroider
- Börja med att observera sfäroidbildning vid olika lager av ställningarna med hjälp av ett inverterat mikroskop.
- Efter 3 dagars odling, ta bort odlingsmediet och tvätta hydrogelställningarna noggrant två gånger med PBS.
- Inkubera ställningarna med mer än 2 ml GelMA-lysbuffert i en spädning på 1:200 med cellodlingsmedium i 30 minuter i en cellinkubator. Detta steg syftar till att lösa upp hydrogelställningarna.
- Överför lösningen från föregående steg till ett rör och centrifugera den sedan vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur för att erhålla cellsfäroidpelleten.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i ett färskt odlingsmedium för nedströmsanvändning.
7. Analys av sfäroidernas livskraft
- Bedöm livskraften hos cellsfäroider antingen i hydrogelställningarna eller i de hämtade sfäroiderna med hjälp av ett levande/dött färgningskit (se materialförteckning).
- Inkubera proverna vid olika odlingstidpunkter med 1 ml PBS-lösning innehållande 1 μl kalcein-AM och 2 μl propidiumjodid (PI) i 15 minuter vid 37 °C.
- För prover inom hydrogelställningarna, tvätta dem direkt med PBS två gånger. För uppsamlade sfäroider, centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur för att erhålla en sfäroidpellet och tvätta den två gånger före observation.
- Observera proverna med ett fluorescensmikroskop och ta fluorescensbilderna.
- Beräkna förhållandet mellan den yta som färgats med Calcein-AM och den totala ytan som färgats med både Calcein-AM och PI med hjälp av ImageJ för att bestämma sfäroidernas livskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie designade en 3D-akustisk monteringsanordning för masstillverkning av cellsfäroider. Den akustiska anordningen bestod av en fyrkantig kammare med två PZT-givare fästa vid X-planet och Y-planet på kammarens yttre yta och en PZT-givare på kammarens botten (figur 1A,B). Tre utgångskanaler från två funktionsgeneratorer anslöts till tre effektförstärkare för att generera tre sinusformade signaler för att aktivera PZT-givarna (figur 1C).
De optimala resonansfrekvenserna som användes för att aktivera de tre PZT-givarna som var anslutna till kammarens X/Y/Z-plan var 3,209 MHz, 3,283 MHz respektive 3,215 MHz. Den optimala amplituden för alla tre PZT-givarna var 10 topp-till-topp utspänning (Vpp), mätt med ett oscilloskop. Figur 2A illustrerar arbetsmekanismen för cellaggregat som genereras med hjälp av den akustiska 3D-monteringsanordningen. När signalen appliceras drivs cellerna till de akustiska noderna under påverkan av akustisk strålningskraft (ARF). För att visualisera cellsfäroider förfärgades cellerna med 2 μM DiO (grön fluorescens). Efter akustisk cellmontering användes ett konfokalmikroskop för att observera de akustiskt sammansatta 3D-cellaggregaten. Dessa cellaggregat observerades vara arrangerade i ett regelbundet 3D-punktsmönster med likformiga gröna fluorescerande signaler (figur 2B). Olika toppvyer av ljusfältsbilder visade också att de bildade aggregaten i varje lager var arrangerade i ett 2D-punktmatrismönster (figur 2C).
Tillväxten av cellaggregat i hydrogelen vid olika tidpunkter observerades. Resultaten visade att de sammansatta aggregaten gradvis integrerades och bildade täta sfäroider vid dag 3, åtföljt av en ökning av sfäroiddiametern (Figur 3A,B). En levande/död färgning utfördes för att utvärdera livskraften hos cellsfäroiderna. Goda cellviabiliteter (>90 %) uppnåddes före dag 3, medan viabiliteten minskade något efter en veckas odling (Figur 3C,D).
För hämtning av sfäroider användes en GelMA-lysbuffert för att dissociera hydrogelställningarna och frigöra de inkapslade cellsfäroiderna (Figur 4A). Följaktligen, efter tre dagars odling, behandlades de små bitarna av hydrogelställningar med GelMA lysbuffert vid 37 °C i 30 minuter. De frigjorda sfäroiderna bibehöll en god sfärisk morfologi med en smal storleksfördelning, tillsammans med uttrycket av albumin och önskvärd livskraft (Figur 4B-D).
Figur 1: Akustisk 3D-monteringsanordning. (A) Schematisk bild som visar ovansidan av den akustiska 3D-monteringsanordningen, bestående av en PMMA-kammare ansluten med tre PZT-givare. (B) Fotografi som visar den faktiska 3D-akustiska monteringsanordningen. (C) Fotografi som visar den akustiska 3D-monteringsanordningen ansluten till två funktionsgeneratorer och tre effektförstärkare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Akustiskt sammansatta cellaggregat. (A) Schematisk bild av arbetsmekanismen för cellaggregat som genereras av den akustiska 3D-monteringsanordningen, där celler drivs till de akustiska noderna av akustisk strålningskraft. (B) Konfokalbilder som visar de akustiskt sammansatta 3D-cellaggregaten från olika perspektiv. (C) Ljusfältsbilder som visar de bildade cellaggregaten i olika lager inom hydrogelställningen. Skalstapeln representerar 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tillväxt av cellaggregat till sfäroider inom GelMA-ställningen. (A) Ljusfältsbilder som visar bildandet av kompakta cellsfäroider efter en 3-dagars odlingsperiod. (B) Kvantifiering av sfäroidstorlekar. C) Levande/död färgning av sfäroider i hydrogelställningen efter en veckas odling. (D) Kvantifiering av cellsfäroidernas viabilitet. Skalstapeln representerar 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hämtning av akustiskt tillverkade cellsfäroider. (A) Illustration som visar stegen för att hämta akustiskt tillverkade cellsfäroider. (B) Ljusfältsbilder som visar de hämtade sfäroiderna i olika förstoringar. Skalstapeln representerar 250 μm. (C) Analys av viabilitet och funktionalitet hos de tillvaratagna sfäroiderna. Skalstapeln representerar 100 μm. (D) Sfäroidernas storleksfördelning efter uttag. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiv och stabil tillverkning av cellsfäroider med hög genomströmning med hjälp av teknik som 3D-akustisk monteringsenhet är mycket lovande för att främja biomedicinsk teknik och läkemedelsscreening 1,2,3. Detta tillvägagångssätt förenklar massproduktionen av cellsfäroider genom enkla procedurer.
Det finns dock kritiska faktorer att tänka på när du använder denna akustiska enhet. Skapandet av stående vågor är viktigt för att konstruera ett akustiskt fält med 3D-punkter. I den här enheten finns endast en PZT-givare i varje dimension, som fungerar som en ljudexcitationskälla. För varje dimension är det därför viktigt att avståndet ansikte mot ansikte mellan de motsatta väggarna i PMMA-kammaren eller PMMA-vattenytan är en heltalsmultipel av halva våglängden. Den primära frekvensen för de PZT-givare vi använde är 1 MHz, vilket resulterar i en våglängd i vattnet eller biobläcket på cirka 500 μm. Följaktligen, för den horisontella dimensionen, sattes avståndet ansikte mot ansikte mellan de två motsatta väggarna i PMMA-kammaren i den akustiska anordningen till 21 mm, vilket tar hänsyn till storleken på PZT-givarna. För den vertikala dimensionen kan det direkta avståndet mellan den nedre PMMA-väggen och vattenytan justeras genom att variera biobläckvolymen för att uppfylla villkoren för stående vågbildning. Under experimentell drift kan små frekvensjusteringar vara nödvändiga för att kompensera för avståndsavvikelser. Dessutom är det viktigt att hålla ingångsspänningen på en måttlig nivå för att förhindra överhettning av PZT-givaren, vilket kan värma upp biobläcket och potentiellt skada cellerna. I experimenten användes en topp-till-topp-spänning på 10 Vpp, vilket slutförde cellaggregatmonteringen inom 30 s samtidigt som biobläckets temperatur hölls under 30 °C.
En begränsning med detta tillvägagångssätt är beroendet av GelMA-ställningen26, som spelar en avgörande roll för att upprätthålla den strukturella integriteten hos de akustiskt sammansatta cellaggregaten när de mognar till cellsfäroider när det akustiska fältet avlägsnas. Steget som involverar upplösning av hydrogelställningarna för sfäroidhämtning kan dock leda till minskad cellviabilitet och potentiell sfäroidförlust. Dessutom måste volymen på GelMA-ställningen ligga inom intervallet flera millimeter för att möjliggöra näringspenetration och utbyte för de inkapslade cellerna. Den begränsade ställningsstorleken i millimeterområdet kan begränsa produktionsutbytet av cellsfäroider, även om större ställningar initialt produceras och sedan skärs i mindre bitar. Framtida insatser kan inriktas på att upprätthålla akustiskt sammansatta cellaggregat in situ, suspenderade i odlingsmediet, för att göra det möjligt för dem att växa till sfäroider utan behov av en extern ställning.
Sammanfattningsvis kan den akustiska monteringsanordningen som beskrivs i detta protokoll enkelt monteras och användas med relativt enkla steg, vilket ger fördelen att effektivt tillverka cellsfäroider. Dessutom är denna akustiska monteringsanordning kompatibel med olika celltyper, inklusive tillverkning av organoider, vilket visar dess betydande potential för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2022YFA1104600) och Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
