Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

सेल स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर विनिर्माण के लिए तीन आयामी ध्वनिक विधानसभा उपकरण

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/66078
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

Summary

सेल spheroids जैविक अनुप्रयोगों के क्षेत्र में एक संभावित मॉडल माना गया है. यह आलेख एक 3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस, जो वर्दी सेल spheroids के मजबूत और तेजी से निर्माण के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है का उपयोग सेल spheroids पैदा scalably के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Abstract

सेल spheroids तीन आयामी (3 डी) मॉडल है कि कई जैविक क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोगों प्राप्त की है वादा कर रहे हैं. यह प्रोटोकॉल पैंतरेबाज़ी प्रक्रियाओं के माध्यम से 3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस का उपयोग करके उच्च-गुणवत्ता और उच्च-थ्रूपुट सेल स्फेरॉइड के निर्माण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। ध्वनिक असेंबली डिवाइस में तीन लीड जिरकोनेट टाइटेनेट (पीजेडटी) ट्रांसड्यूसर होते हैं, जिनमें से प्रत्येक को एक वर्ग पॉलीमेथिल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) कक्ष के एक्स / वाई / जेड विमान में व्यवस्थित किया जाता है। यह कॉन्फ़िगरेशन लेविटेड ध्वनिक नोड्स (LANs) के 3D डॉट-सरणी पैटर्न की पीढ़ी को सक्षम बनाता है जब तीन सिग्नल लागू होते हैं। नतीजतन, जिलेटिन मेथैक्रिलॉयल (जेलएमए) समाधान में कोशिकाओं को लैन में संचालित किया जा सकता है, जिससे तीन आयामों में समान सेल समुच्चय बनते हैं। GelMA समाधान तो यूवी photocure और crosslinked एक मचान है कि सेल समुच्चय के विकास का समर्थन करता है के रूप में सेवा करने के लिए है. अंत में, परिपक्व spheroids के द्रव्यमान प्राप्त कर रहे हैं और बाद में हल्के शर्तों के तहत GelMA मचान भंग द्वारा पुनः प्राप्त. प्रस्तावित नया 3 डी ध्वनिक सेल असेंबली डिवाइस सेल स्फेरॉइड और यहां तक कि ऑर्गेनोइड के स्केल-अप निर्माण को सक्षम करेगा, जो जैविक क्षेत्र में महान संभावित तकनीक प्रदान करेगा।

Introduction

इन विट्रो संस्कृति मॉडल में 3 डी, जो पारंपरिक 2 डी संस्कृति मॉडल की तुलना में विवो जैसी संरचनात्मक और रूपात्मक विशेषताओं में अधिक प्रदान करते हैं, को ऊतक इंजीनियरिंग, रोग मॉडलिंग और ड्रग स्क्रीनिंग 1,2,3 जैसे विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में आशाजनक प्रणालियों के रूप में मान्यता दी गई है. 3 डी संस्कृति मॉडल के एक प्रकार के रूप में, सेल spheroids आम तौर पर बढ़ाया सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत 4,5,6 द्वारा विशेषता 3 डी गोलाकार संरचनाओं बनाने, सेल एकत्रीकरण का उल्लेख करते हैं. इसलिए, सेल spheroids fabricating विविध जैविक अध्ययन सक्षम करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है.

स्फेरॉइड प्राप्त करने के लिए हैंगिंग ड्रॉप7, नॉन-चिपकने वाली प्लेट्स8, या माइक्रोवेल डिवाइस9 सहित विभिन्न तकनीकों का विकास किया गया है। सिद्धांत रूप में, ये विधियां आमतौर पर कोशिकाओं और सब्सट्रेट के बीच बातचीत को कम करते हुए गुरुत्वाकर्षण बल जैसे भौतिक बलों का उपयोग करके सेल असेंबली की सुविधा प्रदान करती हैं। हालांकि, वे अक्सर श्रम-गहन प्रक्रियाओं को शामिल करते हैं, कम उत्पादकता रखते हैं, और अंडाकार आकार10,11 को नियंत्रित करने के लिए चुनौतियों का सामना करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, विशिष्ट जैविक अनुप्रयोगों को पूरा करने के लिए वांछित आकार और पर्याप्त मात्रा में एकरूपता के साथ स्फेरॉइड का उत्पादन अत्यंत महत्वपूर्ण है। उपर्युक्त तरीकों के विपरीत, ध्वनिक तरंगों, बाहरी बल संचालित तकनीक 12,13,14 के एक प्रकार के रूप में, उच्च गुणवत्ता और थ्रूपुट के साथ सेल spheroids के बड़े पैमाने पर विनिर्माण के लिए क्षमता से पता चला है, बाहरी बलों 15,16,17,18 के माध्यम से सेल एकत्रीकरण को बढ़ाने के सिद्धांत पर आधारित. विद्युत चुम्बकीय या चुंबकीय बलों के विपरीत, ध्वनिक आधारित सेल हेरफेर तकनीक गैर इनवेसिव और लेबल मुक्त हैं, उत्कृष्ट biocompatibility19,20 के साथ अंडाकार आकृति गठन को सक्षम करने.

आमतौर पर, खड़ी सतह ध्वनिक तरंगों (एसएडब्ल्यू) और थोक ध्वनिक तरंगों (बीएडब्ल्यू) आधारित उपकरणों को स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है, इसी खड़े ध्वनिक क्षेत्रों 21,22,23द्वारा उत्पादित ध्वनिक नोड्स (एएन) का उपयोग किया गया है। विशेष रूप से, सुविधाजनक निर्माण, आसान संचालन, और उत्कृष्ट मापनीयता के गुणों के साथ, BAWs पर आधारित ध्वनिक विधानसभा उपकरणों ने सेल स्फेरॉइड24,25 बनाने के लिए ध्यान आकर्षित किया है। हम हाल ही में उच्च throughput26 के साथ spheroids उत्पन्न करने की क्षमता के साथ एक आसान BAWs आधारित ध्वनिक विधानसभा डिवाइस विकसित किया है. प्रस्तावित उपकरण में एक वर्ग पॉलीमेथिल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) कक्ष होता है जिसमें तीन लीड जिरकोनेट टाइटेनेट (पीजेडटी) ट्रांसड्यूसर होते हैं जो क्रमशः एक्स/वाई/जेड विमान में व्यवस्थित होते हैं। यह व्यवस्था ड्राइविंग सेल असेंबली के लिए लेविटेड ध्वनिक नोड्स (एलएएन) के 3 डी डॉट-सरणी पैटर्न के निर्माण को सक्षम बनाती है। पहले रिपोर्ट किए गए बीएडब्ल्यू- या एसएडब्ल्यू-आधारित उपकरणों की तुलना में, जो केवल एएनएस 27,28,29 की 1 डी या 2 डी सरणी बना सकते हैं, वर्तमान डिवाइस जिलेटिन मेथैक्रिलॉयल (जेलएमए) समाधान के भीतर तेजी से सेल कुल गठन के लिए लैन के 3 डी डॉट-सरणी को सक्षम बनाता है। इसके बाद, सेल समुच्चय खेती के तीन दिनों के बाद photocure GelMA मचानों के भीतर उच्च व्यवहार्यता के साथ spheroids में परिपक्व. अंत में, समान आकार के साथ spheroids की एक बड़ी संख्या आसानी से बहाव अनुप्रयोगों के लिए GelMA मचान से प्राप्त किया गया.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 3 डी ध्वनिक विधानसभा उपकरण का निर्माण

  1. लेजर काटने30 के माध्यम से चार 1 मिमी मोटी पीएमएमए शीट तैयार करके शुरू करें, और फिर 21 मिमी की आंतरिक चौड़ाई और 10 मिमी की ऊंचाई के साथ एक वर्ग कक्ष बनाने के लिए उन्हें एक साथ गोंद करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. इसके बाद, बायोइंक के लिए धारक के रूप में सेवा करने के लिए कक्ष के नीचे एक और 1 मिमी मोटी पीएमएमए शीट संलग्न करें।
  3. ध्यान से तीन लीड जिरकोनेट टाइटेनेट (पीजेडटी) ट्रांसड्यूसर (प्रत्येक लंबाई में 20 मिमी, चौड़ाई में 10 मिमी, मोटाई में 0.7 मिमी, और 3 मेगाहर्ट्ज की प्राथमिक गुंजयमान आवृत्ति के साथ, सामग्री की तालिकादेखें) को क्रमशः कक्ष की तीन ऑर्थोगोनल दीवारों के बाहरी हिस्से में चिपकाएं। सुनिश्चित करें कि नीचे PZT ट्रांसड्यूसर कक्ष के नीचे केंद्रित है।
  4. प्रत्येक PZT ट्रांसड्यूसर के दो प्रवाहकीय क्षेत्रों में मिलाप तार।
  5. अंत में, नीचे के PZT को अन्य काउंटरटॉप्स के संपर्क में आने से रोकने के लिए डिवाइस को खोखले आधार पर सुरक्षित करें।

2. ध्वनिक विधानसभा प्रणाली की स्थापना

  1. एक खुर्दबीन मंच पर ध्वनिक डिवाइस बढ़ते से शुरू करें, कक्ष के इंटीरियर के शीर्ष-दृश्य अवलोकन के लिए अनुमति देता है।
  2. डिवाइस के किनारे पर एक डिजिटल माइक्रोस्कोप रखें जो पीजेडटी ट्रांसड्यूसर से मुक्त है, जिससे कक्ष के इंटीरियर का साइड-व्यू अवलोकन सक्षम हो सके।
  3. स्वतंत्र रूप से तीन PZT ट्रांसड्यूसर से श्रृंखला में तारों को तीन पावर एम्पलीफायरों और फ़ंक्शन जनरेटर के तीन आउटपुट चैनलों से कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  4. प्रत्येक PZT ट्रांसड्यूसर के लिए फ़ंक्शन जनरेटर पर सेटिंग्स प्रोग्राम करें, साइनसोइडल तरंग, आवृत्ति और आयाम जैसे मापदंडों को निर्दिष्ट करें।
  5. नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए, 5 मिनट के लिए 75% शराब के साथ ध्वनिक डिवाइस के कक्ष को भरें, इसके बाद बाँझ पीबीएस समाधान के साथ पूरी तरह से सफाई करें। इसके बाद, कम से कम 1 घंटे के लिए एक साफ बेंच में यूवी प्रकाश के साथ कक्ष विकिरणित करें।

3. सेल संस्कृति और फसल प्रक्रिया

  1. C3A कोशिकाओं संवर्धन से शुरू, एक मानव hepatocellular कार्सिनोमा सेल लाइन, Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम का उपयोग कर एक टी 25 सेल संस्कृति फ्लास्क में (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन streptomycin के साथ पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. जब C3A कोशिकाएं लगभग 80% संगम तक पहुंचती हैं, तो सेल मार्ग निम्नानुसार करें: सबसे पहले, पीबीएस के साथ दो बार संस्कृति फ्लास्क के नीचे धो लें। फिर, सेल संस्कृति फ्लास्क में 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें और सेल डिटेचमेंट की सुविधा के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पूर्ण संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिनाइजेशन प्रक्रिया को रोकें।
  3. सेल समाधान को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और सेल गोली प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।

4. बायोइंक की तैयारी

  1. फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के 5 एमएल में 0.3 ग्राम जेलएमए और 0.025 ग्राम एलएपी ( सामग्री की तालिकादेखें) को भंग करके 0.5% (डब्ल्यू / वी) लिथियम फिनाइल-2,4,6-ट्राइमिथाइलबेनज़ोयलफॉस्फिनेट (एलएपी) युक्त 6% (डब्ल्यू / वी) जेलएमए समाधान तैयार करें। मिश्रण को 1 घंटे के लिए 47 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बैठने की अनुमति दें।
  2. कोशिकाओं के साथ मिश्रण से पहले, नसबंदी के लिए एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) के माध्यम से GelMA समाधान पास.
  3. सेल संस्कृति माध्यम में ऊपर उल्लेख (3.3 कदम 3.3) सेल गोली resuspension. एक 0.4% trypan नीले समाधान के साथ कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा दाग और फिर सेल गिनती के लिए एक साफ hemocytometer का उपयोग करें.
  4. C3A कोशिकाओं की एक उचित मात्रा मिलाएं, ऊपर प्राप्त सेल घनत्व के आधार पर गणना की जाती है, निष्फल GelMA समाधान के साथ 2 × 106 कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व के साथ बायोइंक तैयार करने के लिए।
  5. इकट्ठे सेल spheroids के दृश्य के लिए, पूर्व दाग C3A कोशिकाओं 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 माइक्रोन सेल ट्रैकर (DiO डाई, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इनक्यूबेट द्वारा. इसके बाद, उपयोग करने से पहले तीन बार ताजा सेल संस्कृति माध्यम के साथ लेबल कोशिकाओं धो लें.

5. ध्वनिक उपकरण का उपयोग सेल spheroids कोडांतरण

  1. निष्फल कक्ष में बायोइंक के 1 एमएल से अधिक पिपेट। सुनिश्चित करें कि तरल सतह और कक्ष तल के बीच आमने-सामने की दूरी आधे ध्वनिक तरंग दैर्ध्य का पूर्णांक गुणक है।
    नोट: जोड़े गए बायोइंक की मात्रा को समायोजित करके कोई भी इस दूरी को नियंत्रित कर सकता है। ध्वनिक तरंग दैर्ध्य (λ) का अनुमान सूत्र λ = c/f का उपयोग करके लगाया जा सकता है, जहां c माध्यम में ध्वनि की गति का प्रतिनिधित्व करता है, और f PZT ट्रांसड्यूसर की आवृत्ति है।
  2. प्रत्येक PZT ट्रांसड्यूसर के सक्रियण को आरंभ करने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर और पावर एम्पलीफायर चालू करें।
    नोट: इष्टतम समानांतर-रेखा सेलुलर पैटर्न को प्राप्त करने के लिए पहले प्रत्येक पीजेडटी ट्रांसड्यूसर को व्यक्तिगत रूप से सक्रिय करने की सिफारिश की जाती है। यह प्रत्येक PZT ट्रांसड्यूसर के लिए प्राथमिक गुंजयमान आवृत्ति के पास 0.001 मेगाहर्ट्ज के एक कदम आकार के साथ एक आवृत्ति स्वीप आयोजित करके प्राप्त किया जा सकता है। बाद में, एक साथ अपेक्षित 3 डी-डॉट सेलुलर पैटर्न प्राप्त करने के लिए सभी तीन पीजेडटी ट्रांसड्यूसर पर इन इष्टतम संकेतों को लागू करें। प्रत्येक इनपुट सिग्नल को लागू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को धीरे-धीरे उत्तेजित करके बायोइंक में समान रूप से फैलाया जाता है।
  3. एक 3D हाइड्रोगेल मचान बनाने के लिए नीली रोशनी (405 एनएम, 60 मेगावाट/सेमी2, 30 एस) का उपयोग करके बायोइंक को क्रॉसलिंक करें जो ध्वनिक रूप से इकट्ठे सेल समुच्चय को समाहित करता है। बाद में, फ़ंक्शन जनरेटर और पावर एम्पलीफायर को बंद कर दें।
  4. ध्यान से एक पेट्री डिश में चैम्बर से 3 डी hydrogel मचान हस्तांतरण और एक साफ रेजर का उपयोग कर (जैसे, 2 मिमी × 2 मिमी × 2 मिमी) छोटे टुकड़े में कटौती.
  5. खेती के लिए सेल कल्चर माध्यम जोड़ें।
    नोट: हर दिन संस्कृति माध्यम को बदलने के लिए याद रखें।

6. सेल spheroids पुनः प्राप्त

  1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग मचान के विभिन्न परतों पर अंडाकार गठन का अवलोकन करके शुरू करो.
  2. संस्कृति के 3 दिनों के बाद, संस्कृति माध्यम को हटा दें और पीबीएस के साथ दो बार हाइड्रोजेल मचानों को अच्छी तरह से धो लें।
  3. एक सेल इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेल संस्कृति माध्यम के साथ 2 एमएल से अधिक गेल्मा लाइसिस बफर के साथ मचानों को इनक्यूबेट करें: 200 कमजोर पड़ने। इस कदम का उद्देश्य हाइड्रोजेल मचानों को भंग करना है।
  4. एक ट्यूब में पिछले कदम से समाधान स्थानांतरण और फिर सेल अंडाकार गोली प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर यह अपकेंद्रित्र.
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बहाव अनुप्रयोगों के लिए ताजा संस्कृति माध्यम में गोली resuspension.

7. गोलाकार व्यवहार्यता विश्लेषण

  1. सेल spheroids की व्यवहार्यता या तो hydrogel मचान के भीतर या एक जीवित / मृत धुंधला किट का उपयोग कर पुनर्प्राप्त spheroids में ( सामग्री की तालिकादेखें) का आकलन.
  2. पीबीएस समाधान के 1 एमएल के साथ विभिन्न संस्कृति समय बिंदुओं पर नमूनों को इनक्यूबेट करें जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए कैल्सिन-एएम के 1 माइक्रोन और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के 2 माइक्रोन होते हैं।
  3. हाइड्रोजेल मचानों के भीतर नमूने के लिए, उन्हें दो बार पीबीएस के साथ सीधे धो लें। प्राप्त spheroids के लिए, एक अंडाकार गोली प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और अवलोकन से पहले इसे दो बार धो लें.
  4. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूने का निरीक्षण करें और प्रतिदीप्ति छवियों पर कब्जा.
  5. अंडाकार व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए ImageJ का उपयोग करके Calcein-AM और PI दोनों के साथ दाग वाले कुल क्षेत्र में Calcein-AM के साथ दाग वाले क्षेत्र के अनुपात की गणना करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस अध्ययन ने सेल स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर निर्माण के लिए एक 3 डी ध्वनिक असेंबली डिवाइस तैयार किया। ध्वनिक डिवाइस में कक्ष की बाहरी सतह पर एक्स-प्लेन और वाई-प्लेन से जुड़े दो पीजेडटी ट्रांसड्यूसर के साथ एक वर्ग कक्ष और कक्ष के तल पर एक पीजेडटी ट्रांसड्यूसर शामिल था (चित्र 1ए, बी)। दो फ़ंक्शन जनरेटर से तीन आउटपुट चैनल तीन पावर एम्पलीफायरों से जुड़े थे ताकि पीजेडटी ट्रांसड्यूसर(चित्रा 1सी)को सक्रिय करने के लिए तीन स्वतंत्र रूप से साइनसोइडल सिग्नल उत्पन्न किए जा सकें।

कक्ष के X/Y/Z विमानों से जुड़े तीन PZT ट्रांसड्यूसर को सक्रिय करने के लिए उपयोग की जाने वाली इष्टतम गुंजयमान आवृत्तियाँ क्रमशः 3.209 MHz, 3.283 MHz और 3.215 MHz थीं। सभी तीन PZT ट्रांसड्यूसर के लिए इष्टतम आयाम 10 पीक-टू-पीक आउटपुट वोल्टेज (Vpp) था, जिसे एक आस्टसीलस्कप द्वारा मापा गया था। चित्रा 2 ए 3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस का उपयोग कर उत्पन्न सेल समुच्चय के काम कर तंत्र को दिखाता है. जब संकेत लागू किया जाता है, तो कोशिकाओं को ध्वनिक विकिरण बल (एआरएफ) के प्रभाव में ध्वनिक नोड्स में ले जाया जाता है। सेल spheroids कल्पना करने के लिए, कोशिकाओं 2 माइक्रोन DiO (हरी प्रतिदीप्ति) के साथ पूर्व दाग रहे थे. ध्वनिक सेल असेंबली के बाद, 3 डी ध्वनिक रूप से इकट्ठे सेल समुच्चय का निरीक्षण करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। इन सेल समुच्चय को एक नियमित रूप से 3 डी-डॉट सरणी पैटर्न में समान हरे फ्लोरोसेंट संकेतों(चित्रा 2बी)के साथ व्यवस्थित किया जाना देखा गया। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के विभिन्न शीर्ष दृश्यों ने यह भी प्रदर्शित किया कि प्रत्येक परत में गठित समुच्चय को 2 डी-डॉट सरणी पैटर्न(चित्रा 2सी)में व्यवस्थित किया गया था।

अलग-अलग समय बिंदुओं पर हाइड्रोजेल के भीतर सेल समुच्चय की वृद्धि देखी गई। परिणामों से पता चला है कि इकट्ठे समुच्चय धीरे-धीरे एकीकृत और 3 दिन तक तंग स्फेरॉइड का गठन किया, अंडाकार व्यास (चित्रा 3 ए, बी) में वृद्धि के साथ। सेल स्फेरॉइड की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक जीवित / मृत धुंधला हो जाना आयोजित किया गया था। अच्छा सेल व्यवहार्यता (>90%) 3 दिन से पहले हासिल की गई, जबकि व्यवहार्यता संस्कृति के एक सप्ताह (चित्रा 3 सी, डी) के बाद थोड़ा कम हो गई.

स्फेरॉइड की पुनर्प्राप्ति के लिए, एक GelMA lysis बफर का उपयोग हाइड्रोजेल मचानों को अलग करने के लिए किया गया था, जो समझाया सेल स्फेरॉइड(चित्रा 4ए)जारी करता है। नतीजतन, खेती के तीन दिनों के बाद, हाइड्रोजेल मचानों के छोटे टुकड़ों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जेलमा लाइसिस बफर के साथ इलाज किया गया था। जारी किए गए स्फेरॉइड ने एल्ब्यूमिन और वांछनीय व्यवहार्यता(चित्रा 4बी-डी)की अभिव्यक्ति के साथ-साथ एक संकीर्ण आकार वितरण के साथ एक अच्छा गोलाकार आकारिकी बनाए रखा।

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस। (ए) योजनाबद्ध आरेख 3 डी ध्वनिक असेंबली डिवाइस के शीर्ष दृश्य को दर्शाता है, जिसमें तीन पीजेडटी ट्रांसड्यूसर से जुड़े पीएमएमए कक्ष शामिल हैं। (बी) वास्तविक 3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस प्रदर्शित फोटोग्राफ। (सी) दो फ़ंक्शन जनरेटर और तीन पावर एम्पलीफायरों से जुड़े 3 डी ध्वनिक असेंबली डिवाइस को दिखाने वाली तस्वीर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ध्वनिक रूप से इकट्ठे सेल समुच्चय। (ए) योजनाबद्ध 3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस, जहां कोशिकाओं ध्वनिक विकिरण बल द्वारा ध्वनिक नोड्स के लिए संचालित कर रहे हैं द्वारा उत्पन्न सेल समुच्चय के काम तंत्र चित्रांकन. (बी)विभिन्न दृष्टिकोणों से 3 डी ध्वनिक रूप से इकट्ठे सेल समुच्चय को प्रदर्शित करने वाली फोकल छवियां। (सी)हाइड्रोजेल मचान के भीतर विभिन्न परतों पर गठित सेल समुच्चय प्रदर्शित करने वाली उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। स्केल बार 250 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: GelMA मचान के भीतर spheroids में सेल समुच्चय की वृद्धि. (ए) उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एक 3 दिन संस्कृति अवधि के बाद कॉम्पैक्ट सेल spheroids के गठन दिखा रहा है. (बी) अंडाकार आकार की मात्रा का ठहराव. (सी) संस्कृति के एक सप्ताह के बाद हाइड्रोजेल मचान के भीतर स्फेरॉइड के जीवित / (डी) सेल अंडाकार आकृति व्यवहार्यता की मात्रा का ठहराव. स्केल बार 250 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ध्वनिक रूप से गढ़े सेल स्फेरॉइड की पुनर्प्राप्ति। (ए) ध्वनिक रूप से गढ़े सेल spheroids पुनः प्राप्त करने के लिए कदम चित्रण चित्रण. (बी) विभिन्न आवर्धन पर पुनर्प्राप्त स्फेरॉइड प्रदर्शित करने वाली उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। स्केल बार 250 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) व्यवहार्यता और पुनर्प्राप्त अंडाकार कारों की कार्यक्षमता का विश्लेषण. स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) पुनर्प्राप्ति के बाद अंडाकार कारों का आकार वितरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3 डी ध्वनिक विधानसभा डिवाइस की तरह प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर उच्च throughput के साथ सेल spheroids के कुशल और स्थिर निर्माण जैव चिकित्सा इंजीनियरिंग और दवा स्क्रीनिंग 1,2,3 को आगे बढ़ाने के लिए महान वादा रखती है. यह दृष्टिकोण सीधी प्रक्रियाओं के माध्यम से सेल स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को सरल करता है।

हालांकि, इस ध्वनिक उपकरण का उपयोग करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। 3 डी-डॉट सरणी ध्वनिक क्षेत्र के निर्माण के लिए खड़ी तरंगों का निर्माण आवश्यक है। इस उपकरण में, प्रत्येक आयाम में केवल एक PZT ट्रांसड्यूसर मौजूद होता है, जो ध्वनि उत्तेजना स्रोत के रूप में कार्य करता है। इसलिए, प्रत्येक आयाम के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पीएमएमए कक्ष या पीएमएमए-पानी की सतह की विपरीत दीवारों के बीच आमने-सामने की दूरी आधे तरंग दैर्ध्य का पूर्णांक गुणक हो। हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले PZT ट्रांसड्यूसर की प्राथमिक आवृत्ति 1 मेगाहर्ट्ज है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 500 माइक्रोन के पानी या बायोइंक में तरंग दैर्ध्य होता है। नतीजतन, क्षैतिज आयाम के लिए, ध्वनिक उपकरण में पीएमएमए कक्ष की दो विपरीत दीवारों के बीच आमने-सामने की दूरी 21 मिमी पर सेट की गई थी, जो पीजेडटी ट्रांसड्यूसर के आकार के लिए जिम्मेदार थी। ऊर्ध्वाधर आयाम के लिए, नीचे पीएमएमए दीवार और पानी की सतह के बीच आमने-सामने की दूरी को बायोइंक वॉल्यूम को अलग-अलग करके समायोजित किया जा सकता है ताकि स्थायी लहर गठन की शर्तों को पूरा किया जा सके। प्रयोगात्मक ऑपरेशन के दौरान, दूरी विचलन की भरपाई के लिए मामूली आवृत्ति समायोजन आवश्यक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, PZT ट्रांसड्यूसर को ओवरहीटिंग से बचाने के लिए इनपुट वोल्टेज को मध्यम स्तर पर रखना महत्वपूर्ण है, जो बायोइंक को गर्म कर सकता है और संभावित रूप से कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है। प्रयोगों में, 10 वीपीपी के पीक-टू-पीक वोल्टेज का उपयोग किया गया था, 30 डिग्री सेल्सियस से नीचे बायोइंक तापमान को बनाए रखते हुए 30 एस के भीतर सेल कुल असेंबली को पूरा करना।

इस दृष्टिकोण की एक सीमा GelMA मचान26 पर निर्भरता है, जो ध्वनिक इकट्ठे सेल समुच्चय की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के रूप में वे सेल spheroids में परिपक्व जब ध्वनिक क्षेत्र हटा दिया जाता है. हालांकि, स्फेरॉइड पुनर्प्राप्ति के लिए हाइड्रोजेल मचानों के विघटन से जुड़े कदम से सेल व्यवहार्यता और संभावित गोलाकार हानि कम हो सकती है। इसके अतिरिक्त, GelMA मचान की मात्रा पोषक तत्वों के प्रवेश और encapsulated कोशिकाओं के लिए विनिमय के लिए अनुमति देने के लिए कई मिलीमीटर की सीमा के भीतर होना चाहिए. मिलीमीटर रेंज में सीमित मचान आकार सेल स्फेरॉइड की उत्पादन उपज को बाधित कर सकता है, भले ही बड़े मचान शुरू में उत्पादित होते हैं और फिर छोटे टुकड़ों में कट जाते हैं। भविष्य के प्रयासों को संस्कृति माध्यम में निलंबित स्वस्थानी में ध्वनिक रूप से इकट्ठे सेल समुच्चय को बनाए रखने पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है, ताकि उन्हें बाहरी मचान की आवश्यकता के बिना गोलाकार में विकसित करने में सक्षम बनाया जा सके।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित ध्वनिक विधानसभा डिवाइस को आसानी से इकट्ठा किया जा सकता है और अपेक्षाकृत सरल चरणों के साथ संचालित किया जा सकता है, जो सेल स्फेरॉइड को कुशलतापूर्वक बनाने का लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, यह ध्वनिक असेंबली डिवाइस विभिन्न सेल प्रकारों के साथ संगत है, जिसमें ऑर्गेनोइड का निर्माण शामिल है, जो बायोमेडिकल अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपनी महत्वपूर्ण क्षमता का प्रदर्शन करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2022YFA1104600), और चीन के झेजियांग प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (LQ23H160011) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-μm filter Merck SLGSM33SS Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish Corning 430165 Used for culturing cells
Confocal microscope Nikon A1RHD25 Fluorescent cell observation
DiO dye Beyotime C1038 Dye used to stain cells
DMEM Gibco 12430054 Cell culture media
FBS Gibco 10099141C Cell culture media supplement
Function generator Rigol DG5352 For RF signal generation
GelMA Regenovo none Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer EFL EFL-GM-LS-001 Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope Nikon Ti-U Cell observation
LAP Sigma-Aldrich 900889 Used as photoinitiator
Live-Dead kit Beyotime C2015M Cell vability analysis
PBS Gibco 10010002 Used as buffer
Penicillin-streptomycin Gibco 15070063 Prevent cell culture contamination
Power amplifer Minicircuit LCY-22+ Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. PZT-41 Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask Corning 430639 Used for culturing cells
Trypan blue  Gibco 15250061 Cell counting
Trypsin-EDTA  Gibco 25200056 Cell dissociation enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
  4. Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
  5. Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
  6. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
  7. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
  8. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  9. Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
  10. Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
  11. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
  12. Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
  13. Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
  14. Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
  15. Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
  16. Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
  17. Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
  18. Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
  19. Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
  20. Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
  21. Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
  22. Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
  23. Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
  24. Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
  25. Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
  26. Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
  27. Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
  28. Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
  29. Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
  30. Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 200 मास मैन्युफैक्चरिंग जैविक क्षेत्र उच्च गुणवत्ता उच्च थ्रूपुट लीड जिरकोनेट टाइटेनेट ट्रांसड्यूसर स्क्वायर पॉलीमेथिल मेथैक्रिलेट चैंबर लेविटेड ध्वनिक नोड्स जेलएमए समाधान यूवी-फोटोक्योर क्रॉसलिंक मचान सेल एग्रीगेट्स का विकास परिपक्व स्फेरॉइड स्केल-अप फैब्रिकेशन ऑर्गेनोइड्स संभावित प्रौद्योगिकी
सेल स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर विनिर्माण के लिए तीन आयामी ध्वनिक विधानसभा उपकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M.… More

Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids. J. Vis. Exp. (200), e66078, doi:10.3791/66078 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter