Summary
세포 스페로이드는 생물학적 응용 분야에서 하나의 잠재적 모델로 간주되어 왔습니다. 이 기사에서는 균일한 세포 스페로이드를 견고하고 신속하게 제조할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 3D 음향 조립 장치를 사용하여 세포 스페로이드를 확장 가능하게 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
세포 스페로이드는 많은 생물학 분야에서 광범위하게 응용되고 있는 유망한 3차원(3D) 모델입니다. 이 프로토콜은 기동성 있는 절차를 통해 3D 음향 조립 장치를 사용하여 고품질 및 고처리량 세포 스페로이드를 제조하는 방법을 제시합니다. 음향 조립 장치는 3개의 PZT(납 지르콘산염 티타네이트) 변환기로 구성되며, 각 변환기는 정사각형 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 챔버의 X/Y/Z 평면에 배열됩니다. 이 구성을 사용하면 3개의 신호가 적용될 때 부상 음향 노드(LAN)의 3D 도트 어레이 패턴을 생성할 수 있습니다. 그 결과, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 용액의 세포를 LAN으로 유도하여 3차원에서 균일한 세포 응집체를 형성할 수 있습니다. 그런 다음 GelMA 용액을 UV 광경화 및 가교 결합하여 세포 응집체의 성장을 지원하는 스캐폴드 역할을 합니다. 마지막으로, 성숙된 스페로이드 덩어리를 얻어 온화한 조건에서 GelMA 스캐폴드를 용해시켜 회수합니다. 제안된 새로운 3D 음향 세포 조립 장치는 세포 스페로이드 및 오가노이드의 스케일업 제조를 가능하게 하여 생물학 분야에서 큰 잠재력을 가진 기술을 제공할 것입니다.
Introduction
기존의 2D 배양 모델에 비해 in vivo와 유사한 구조적 및 형태학적 특성을 더 많이 제공하는 3D in vitro 배양 모델은 조직 공학, 질병 모델링 및 약물 스크리닝과 같은 다양한 생물의학 응용 분야에서 유망한 시스템으로 인정받고 있습니다 1,2,3. 3D 배양 모델의 한 유형인 세포 스페로이드는 일반적으로 세포 응집을 의미하며, 향상된 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 특징으로 하는 3D 구상체 구조를 생성합니다 4,5,6. 따라서 세포 스페로이드 제조는 다양한 생물학적 연구를 가능하게 하는 강력한 도구가 되었습니다.
스페로이드를 얻기 위해 행잉 드롭(hanging drop)7, 비접착 플레이트(non-adhesive plate)8 또는 마이크로웰 장치(microwell device)9를 포함한 다양한 기술들이 개발되었다. 원칙적으로, 이러한 방법은 일반적으로 세포와 기판 사이의 상호 작용을 최소화하면서 중력과 같은 물리적 힘을 이용하여 세포 조립을 용이하게 합니다. 그러나 종종 노동 집약적인 공정이 포함되고 생산성이 낮으며 스페로이드 크기10,11을 제어하는 데 어려움이 있습니다. 중요한 것은 원하는 크기와 균일성을 가진 스페로이드를 충분한 양으로 생산하는 것이 특정 생물학적 응용 분야를 충족하는 데 가장 중요하다는 것입니다. 상술한 방법들과는 대조적으로, 음파는, 외력-구동 기술(12,13,14)의 한 유형으로서, 외력(15,16,17,18)을 통해 세포 응집을 강화하는 원리에 기초하여, 높은 품질과 처리량을 갖는 세포 스페로이드의 대량 제조에 대한 가능성을 보여주었다 . 전자기 또는 자기력과 달리 음향 기반 세포 조작 기술은 비침습적이고 표지가 없어 우수한 생체 적합성으로 스페로이드 형성을 가능하게 합니다19,20.
일반적으로, 스탠딩 표면 음향파(SAW) 및 벌크 음파(BOW) 기반 장치는 대응하는 스탠딩 음향장(21,22,23)에 의해 생성된 음향 노드(AN)를 활용하여 스페로이드를 생성하기 위해 개발되었다. 특히, BAW를 기반으로 하는 음향 조립 장치는 제조가 편리하고, 조작이 용이하며, 확장성이 우수하다는 장점이 있어 셀 스페로이드24,25 제조에 주목받고 있다. 우리는 최근에 높은 처리량을 가진 스페로이드를 생성할 수 있는 손쉬운 BAW 기반 음향 조립 장치를 개발했습니다26. 제안된 장치는 X/Y/Z 평면에 각각 배열된 3개의 지르콘산 납 티타네이트(PZT) 변환기가 있는 정사각형 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 챔버로 구성됩니다. 이러한 배열은 구동 셀 조립을 위한 공중 부양 음향 노드(LAN)의 3D 도트 어레이 패턴을 생성할 수 있습니다. ANs 27,28,29의 1D 또는 2D 어레이만을 생성할 수 있는 이전에 보고된 BAW 또는 SAW 기반 디바이스와 비교하여, 본 디바이스는 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 용액 내에서 신속한 세포 응집체 형성을 위한 LAN의 3D 도트 어레이를 가능하게 합니다. 그 후, 세포 응집체는 배양 3일 후 광경화된 GelMA 스캐폴드 내에서 생존력이 높은 스페로이드로 성숙되었습니다. 마지막으로, 균일한 크기의 많은 스페로이드를 다운스트림 응용 분야를 위해 GelMA 스캐폴드에서 쉽게 얻을 수 있었습니다.
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Protocol
1. 3D 음향 조립 장치 제작
- 레이저 절단(30)을 통해 1mm 두께의 PMMA 시트 4장을 제조하는 것으로 시작한 후, 이들을 함께 접착하여 내부 폭 21mm, 높이 10mm의 정사각형 챔버를 형성한다.
- 다음으로, 챔버 바닥에 1mm 두께의 PMMA 시트를 부착하여 바이오잉크 홀더 역할을 합니다.
- 3개의 PZT(납 지르콘산염 티타네이트) 트랜스듀서(각각 길이 20mm, 너비 10mm, 두께 0.7mm, 1차 공진 주파수 3MHz, 재료 표 참조)를 챔버의 3개 직교 벽 외부에 각각 조심스럽게 부착합니다. 하단 PZT 변환기가 챔버 아래 중앙에 있는지 확인합니다.
- 각 PZT 변환기의 두 전도성 영역에 와이어를 납땜합니다.
- 마지막으로 하단 PZT가 다른 조리대와 접촉하지 않도록 속이 빈 바닥에 장치를 고정합니다.
2. 음향 조립 시스템 설정
- 음향 장치를 현미경 스테이지에 장착하여 챔버 내부를 위에서 관찰할 수 있도록 합니다.
- PZT 변환기가 없는 장치 측면에 디지털 현미경을 배치하여 챔버 내부를 측면으로 관찰할 수 있습니다.
- 직렬로 연결된 3개의 PZT 트랜스듀서에서 3개의 전력 증폭기 및 함수 발생기의 3개 출력 채널에 와이어를 독립적으로 연결합니다( 재료 표 참조).
- 각 PZT 변환기에 대한 함수 발생기의 설정을 프로그래밍하여 정현파 파형, 주파수 및 진폭과 같은 파라미터를 지정합니다.
- 멸균을 위해 음향 장치의 챔버를 75% 알코올로 5분 동안 채운 다음 멸균 PBS 용액으로 철저히 세척합니다. 그런 다음 깨끗한 벤치에서 최소 1시간 동안 챔버에 UV 광선을 조사합니다.
3. 세포 배양 및 수확 절차
- 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)를 사용하여 T25 세포 배양 플라스크에서 인간 간세포 암종 세포주인 C3A 세포를 배양하는 것으로 시작합니다( 재료 표 참조).
- C3A 세포가 약 80% 합류에 도달하면 다음과 같이 세포 통과를 수행합니다: 먼저 배양 플라스크 바닥을 PBS로 두 번 세척합니다. 그런 다음 0.05% 트립신-EDTA 2mL를 세포 배양 플라스크에 넣고 세포 분리를 촉진하기 위해 37°C에서 배양합니다. 2mL의 완전 배양 배지를 추가하여 트립신화 과정을 중지합니다.
- 세포 용액을 15mL 튜브로 옮기고 실온에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
4. 바이오잉크의 제조
- 0.5g(w/v) 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)를 함유한 6%(w/v) GelMA 용액 5mL에 0.3g의 LAP( 재료 표 참조)를 5mL의 인산염 완충 용액(PBS)에 용해시켜 준비합니다. 혼합물을 47°C 수조에 1시간 동안 그대로 둡니다.
- 세포와 혼합하기 전에 멸균을 위해 GelMA 용액을 0.22μm 필터( 재료 표 참조)에 통과시킵니다.
- 위에서 언급한 세포 펠릿을 세포 배양 배지에 재현탁시키십시오(단계 3.3). 0.4% 트리판 블루 용액으로 소량의 세포를 염색한 다음 세포 계수를 위해 깨끗한 혈구계를 사용합니다.
- 위에서 얻은 세포 밀도를 기준으로 계산된 적절한 양의 C3A 세포를 멸균된 GelMA 용액과 혼합하여 세포 밀도가 2 × 106 cells/mL인 바이오잉크를 준비합니다.
- 조립된 세포 스페로이드를 시각화하기 위해 C3A 세포를 37°C에서 20분 동안 2μM 세포 추적기(DiO 염료, 재료 표 참조)로 배양하여 사전 염색합니다. 그 후, 사용하기 전에 표지된 세포를 신선한 세포 배양 배지로 3회 세척하십시오.
5. 음향 장치를 이용한 세포 스페로이드 조립
- 1mL 이상의 바이오잉크를 멸균된 챔버에 피펫팅합니다. 액체 표면과 챔버 바닥 사이의 대면 거리가 음향 파장의 절반의 정수 배수인지 확인하십시오.
알림: 추가된 바이오잉크의 양을 조절하여 이 거리를 제어할 수 있습니다. 음향 파장(λ)은 공식 λ = c/f를 사용하여 추정할 수 있으며, 여기서 c는 매체의 음속을 나타내고 f는 PZT 변환기의 주파수를 나타냅니다. - 함수 발생기 및 전원 켜기ampliifier를 사용하여 각 PZT 변환기의 작동을 시작합니다.
알림: 최적의 평행선 셀룰러 패턴을 얻기 위해 먼저 각 PZT 변환기를 개별적으로 작동하는 것이 좋습니다. 이는 각 PZT 변환기의 1차 공진 주파수 근처에서 0.001MHz의 단계 크기로 주파수 스위프를 수행하여 달성할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 최적의 신호를 3개의 PZT 트랜스듀서 모두에 동시에 적용하여 예상되는 3D 도트 셀룰러 패턴을 얻습니다. 각 입력 신호를 적용하기 전에 세포가 부드럽게 교반하여 바이오잉크에 고르게 분산되어 있는지 확인하십시오. - 청색광(405nm, 60mW/cm2, 30초)을 사용하여 바이오잉크를 가교하여 음향적으로 조립된 세포 응집체를 캡슐화하는 3D 하이드로겔 스캐폴드를 만듭니다. 그런 다음 함수 발생기와 전력 증폭기를 끕니다.
- 챔버에서 페트리 접시로 3D 하이드로겔 스캐폴드를 조심스럽게 옮기고 깨끗한 면도기를 사용하여 작은 조각(예: 2mm × 2mm × 2mm)으로 자릅니다.
- 배양을 위해 세포 배양 배지를 추가합니다.
참고: 매일 배양 매체를 변경하는 것을 잊지 마십시오.
6. 세포 스페로이드 회수
- 도립 현미경을 사용하여 지지체의 여러 층에서 스페로이드 형성을 관찰하는 것으로 시작합니다.
- 배양 3일 후 배양액을 제거하고 하이드로겔 스캐폴드를 PBS로 두 번 철저히 세척합니다.
- 세포 배양 배지로 1:200 희석하여 세포 배양 배지에서 30분 동안 2mL 이상의 GelMA 용해 완충액으로 스캐폴드를 배양합니다. 이 단계는 하이드로겔 스캐폴드를 용해하는 것을 목표로 합니다.
- 이전 단계의 용액을 튜브에 옮긴 다음 실온에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리하여 셀 스페로이드 펠릿을 얻습니다.
- 상층액을 버리고 다운스트림 적용을 위해 펠릿을 신선한 배양 배지에 재현탁시킵니다.
7. 스페로이드 생존력 분석
- 하이드로겔 스캐폴드 내 또는 살아있는/죽은 염색 키트를 사용하여 회수된 스페로이드에서 세포 스페로이드의 생존력을 평가합니다( 재료 표 참조).
- 1 μL의 Calcein-AM과 2 μL의 Propidium Iodide (PI)를 함유 한 PBS 용액 1 mL를 사용하여 37 °C에서 15 분 동안 다른 배양 시점에서 샘플을 배양합니다.
- 하이드로겔 스캐폴드 내 샘플의 경우 PBS로 직접 두 번 세척합니다. 회수된 스페로이드의 경우 실온에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리하여 스페로이드 펠릿을 얻고 관찰 전에 두 번 세척합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 샘플을 관찰하고 형광 이미지를 캡처합니다.
- ImageJ를 사용하여 Calcein-AM 및 PI로 염색된 전체 면적에 대한 Calcein-AM 염색 면적의 비율을 계산하여 스페로이드 생존율을 결정합니다.
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Representative Results
이 연구는 세포 스페로이드의 대량 제조를 위한 3D 음향 조립 장치를 설계했습니다. 음향 장치는 챔버 외부 표면의 X-평면과 Y-평면에 부착된 2개의 PZT 변환기와 챔버 바닥에 1개의 PZT 변환기가 부착된 정사각형 챔버로 구성되었습니다(그림 1A,B). 2개의 함수 발생기에서 3개의 출력 채널을 3개의 전력 증폭기에 연결하여 PZT 트랜스듀서를 작동시키기 위한 3개의 독립적인 정현파 신호를 생성했습니다(그림 1C).
챔버의 X/Y/Z 평면에 부착된 3개의 PZT 변환기를 작동시키는 데 사용된 최적의 공진 주파수는 각각 3.209MHz, 3.283MHz 및 3.215MHz였습니다. 세 가지 PZT 트랜스듀서 모두에 대한 최적의 진폭은 오실로스코프로 측정한 10 피크 대 피크 출력 전압(Vpp)이었습니다. 그림 2A 는 3D 음향 조립 장치를 사용하여 생성된 세포 응집체의 작동 메커니즘을 보여줍니다. 신호가 가해지면 셀은 음향 방사력(ARF)의 영향을 받아 음향 노드로 구동됩니다. 세포 스페로이드를 시각화하기 위해 세포를 2μM DiO(녹색 형광)로 사전 염색했습니다. 음향 세포 조립 후 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 음향 조립된 세포 응집체를 관찰했습니다. 이러한 세포 응집체는 균일한 녹색 형광 신호와 함께 규칙적인 3D 도트 어레이 패턴으로 배열되는 것으로 관찰되었습니다(그림 2B). 명시야 이미지의 다양한 평면도는 각 층에 형성된 응집체가 2D 도트 어레이 패턴으로 배열되어 있음을 보여주었습니다(그림 2C).
서로 다른 시점에서 하이드로겔 내에서 세포 응집체의 성장이 관찰되었습니다. 결과는 조립된 응집체가 점차적으로 통합되어 3일째까지 단단한 스페로이드를 형성하고 스페로이드 직경의 증가를 동반하는 것을 보여주었습니다(그림 3A,B). 세포 스페로이드의 생존력을 평가하기 위해 살아있는/죽은 염색을 수행했습니다. 양호한 세포 생존율(>90%)은 3일째 이전에 달성된 반면, 생존율은 배양 일주일 후에 약간 감소했습니다(그림 3C,D).
스페로이드 회수를 위해 GelMA 용해 완충액을 사용하여 하이드로겔 스캐폴드를 해리하여 캡슐화된 세포 스페로이드를 방출했습니다(그림 4A). 결과적으로, 3일간의 배양 후, 하이드로겔 스캐폴드의 작은 조각들을 37°C에서 30분 동안 GelMA 용해 완충액으로 처리하였다. 방출된 스페로이드는 알부민의 발현 및 바람직한 생존력과 함께 좁은 크기 분포로 양호한 구형 형태를 유지했습니다(그림 4B-D).
그림 1: 3D 음향 조립 장치. (A) 3개의 PZT 변환기가 부착된 PMMA 챔버로 구성된 3D 음향 조립 장치의 평면도를 보여주는 개략도. (B) 실제 3D 음향 조립 장치를 보여주는 사진. (C) 2개의 함수 발생기와 3개의 전력 증폭기로 연결된 3D 음향 조립 장치를 보여주는 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 음향적으로 조립된 세포 응집체. (A) 세포가 음향 복사력에 의해 음향 노드로 구동되는 3D 음향 조립 장치에 의해 생성된 세포 응집체의 작동 메커니즘을 보여주는 개략도. (B) 다양한 관점에서 3D 음향적으로 조립된 세포 응집체를 보여주는 컨포칼 이미지. (C) 하이드로겔 스캐폴드 내의 다양한 층에서 형성된 세포 응집체를 보여주는 명시야 이미지. 눈금 막대는 250μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: GelMA 스캐폴드 내에서 세포 응집체가 스페로이드로 성장하는 모습. (A) 3일간의 배양 기간 후 조밀한 세포 스페로이드의 형성을 보여주는 명시야 이미지. (B) 스페로이드 크기의 정량화. (C) 배양 1주일 후 하이드로겔 스캐폴드 내 스페로이드의 살아있는/죽은 염색. (D) 세포 스페로이드 생존율의 정량화. 눈금 막대는 250μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 음향적으로 조작된 세포 스페로이드의 회수. (A) 음향적으로 조작된 세포 스페로이드를 회수하는 단계를 묘사한 그림. (B) 검색된 스페로이드를 다른 배율로 표시하는 명시야 이미지. 눈금 막대는 250μm를 나타냅니다. (C) 회수된 스페로이드의 생존력 및 기능 분석. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. (D) 회수 후 스페로이드의 크기 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
3D 음향 조립 장치와 같은 기술을 사용하여 높은 처리량으로 세포 스페로이드를 효율적이고 안정적으로 제조하는 것은 생물 의학 공학 및 약물 스크리닝을 발전시키는 데 큰 가능성을 가지고있습니다 1,2,3. 이 접근법은 간단한 절차를 통해 세포 스페로이드의 대량 생산을 단순화합니다.
그러나 이 음향 장치를 사용할 때 고려해야 할 중요한 요소가 있습니다. 정상파의 생성은 3D 도트 어레이 음향장을 구성하는 데 필수적입니다. 이 장치에서는 각 차원에 하나의 PZT 변환기만 존재하며 사운드 여기 소스 역할을 합니다. 따라서 각 차원에 대해 PMMA 챔버 또는 PMMA 수면 표면의 반대쪽 벽 사이의 대면 거리가 파장의 절반의 정수 배수가 되는 것이 중요합니다. 우리가 사용한 PZT 트랜스듀서의 기본 주파수는 1MHz이며, 그 결과 물 또는 바이오잉크의 파장은 약 500μm입니다. 결과적으로, 수평 치수의 경우, 음향 장치에서 PMMA 챔버의 두 대향 벽 사이의 대면 거리는 PZT 변환기의 크기를 고려하여 21mm로 설정되었습니다. 수직 치수의 경우 하단 PMMA 벽과 수면 사이의 대면 거리는 정재파 형성 조건을 충족하도록 바이오잉크 부피를 변경하여 조정할 수 있습니다. 실험 작동 중에는 거리 편차를 보상하기 위해 약간의 주파수 조정이 필요할 수 있습니다. 또한 바이오잉크를 가열하고 잠재적으로 세포를 손상시킬 수 있는 PZT 변환기 과열을 방지하기 위해 입력 전압을 적당한 수준으로 유지하는 것이 중요합니다. 실험에서는 10Vpp의 피크 대 피크 전압을 사용하여 바이오잉크 온도를 30°C 미만으로 유지하면서 30초 이내에 셀 응집체 조립을 완료했습니다.
이 접근법의 한 가지 한계는 GelMA 스캐폴드(26)에 의존한다는 것인데, 이는 음향장이 제거될 때 세포 스페로이드로 성숙할 때 음향적으로 조립된 세포 응집체의 구조적 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나, 스페로이드 회수를 위한 하이드로겔 스캐폴드의 용해를 수반하는 단계는 세포 생존율 감소 및 잠재적인 스페로이드 손실을 초래할 수 있다. 또한 GelMA 스캐폴드의 부피는 캡슐화된 세포에 대한 영양소 침투 및 교환을 허용하기 위해 수 밀리미터 범위 내에 있어야 합니다. 밀리미터 범위의 제한된 스캐폴드 크기는 더 큰 스캐폴드가 처음에 생산된 다음 더 작은 조각으로 절단되더라도 셀 스페로이드의 생산 수율을 제한할 수 있습니다. 앞으로의 노력은 음향적으로 조립된 세포 응집체를 배양 배지에 현탁된 상태로 유지하여 외부 스캐폴드 없이 스페로이드로 성장할 수 있도록 하는 데 중점을 둘 수 있습니다.
요약하면, 이 프로토콜에 설명된 음향 조립 장치는 비교적 간단한 단계로 쉽게 조립 및 작동할 수 있어 셀 스페로이드를 효율적으로 제작할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한 이 음향 조립 장치는 오가노이드 제조를 포함한 다양한 세포 유형과 호환되어 광범위한 생물 의학 응용 분야에 대한 상당한 잠재력을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(2022YFA1104600)과 중국 저장성 자연과학 재단(LQ23H160011)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
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