Summary
تعتبر كرويات الخلايا نموذجا محتملا في مجال التطبيقات البيولوجية. توضح هذه المقالة بروتوكولات لتوليد كرويات الخلايا بشكل متطور باستخدام جهاز تجميع صوتي 3D ، والذي يوفر طريقة فعالة للتصنيع القوي والسريع للكرويات الخلوية الموحدة.
Abstract
كرويات الخلية واعدة ثلاثية الأبعاد (3D) النماذج التي اكتسبت تطبيقات واسعة في العديد من المجالات البيولوجية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصنيع كرويات الخلايا عالية الجودة وعالية الإنتاجية باستخدام جهاز تجميع صوتي 3D من خلال إجراءات قابلة للمناورة. يتكون جهاز التجميع الصوتي من ثلاثة محولات طاقة تيتانات الزركونات الرصاص (PZT) ، كل منها مرتب في المستوى X / Y / Z لغرفة بولي ميثيل ميثاكريلات مربعة (PMMA). يتيح هذا التكوين إنشاء نمط صفيف نقطي 3D للعقد الصوتية المرفوعة (LANs) عند تطبيق ثلاث إشارات. نتيجة لذلك ، يمكن دفع الخلايا الموجودة في محلول الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) إلى الشبكات المحلية ، لتشكيل مجاميع خلايا موحدة في ثلاثة أبعاد. ثم يتم معالجة محلول GelMA بالأشعة فوق البنفسجية وتشابكه ليكون بمثابة سقالة تدعم نمو مجاميع الخلايا. أخيرا ، يتم الحصول على كتل من الكرويات الناضجة واسترجاعها عن طريق إذابة سقالات GelMA لاحقا في ظل ظروف معتدلة. سيمكن جهاز تجميع الخلايا الصوتية 3D الجديد المقترح من تصنيع كرويات الخلايا ، وحتى المواد العضوية ، مما يوفر تقنية محتملة كبيرة في المجال البيولوجي.
Introduction
تم التعرف على نماذج الزراعة ثلاثية الأبعاد في المختبر ، والتي توفر المزيد من الخصائص الهيكلية والمورفولوجية الشبيهة بالجسم الحي مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد التقليدية ، كأنظمة واعدة في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية مثل هندسة الأنسجة ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية1،2،3. كنوع واحد من نموذج الثقافة ثلاثية الأبعاد ، تشير كرويات الخلايا عادة إلى تجميع الخلايا ، مما يخلق هياكل كروية ثلاثية الأبعاد تتميز بتفاعلات خلية خلية ومصفوفة خليةمحسنة 4،5،6. لذلك ، أصبح تصنيع كرويات الخلايا أداة قوية لتمكين الدراسات البيولوجية المتنوعة.
تم تطوير تقنيات مختلفة ، بما في ذلك القطرة المعلقة7 ، أو الألواح غير اللاصقة8 ، أو أجهزة microwell9 ، للحصول على كرويات. من حيث المبدأ ، تسهل هذه الطرق عادة تجميع الخلايا من خلال استخدام القوى الفيزيائية مثل قوة الجاذبية مع تقليل التفاعلات بين الخلايا والركيزة. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تنطوي على عمليات كثيفة العمالة ، وذات إنتاجية منخفضة ، وتشكل تحديات للتحكم في حجم كروي10,11. الأهم من ذلك ، أن إنتاج كرويات بالحجم المطلوب والتوحيد بكمية كافية له أهمية قصوى لتلبية تطبيقات بيولوجية محددة. على عكس الطرق المذكورة أعلاه ، أظهرت الموجات الصوتية ، كنوع واحد من التقنيات التي تحركها القوة الخارجية12،13،14 ، إمكانية التصنيع الشامل للكرويات الخلوية بجودة عالية وإنتاجية عالية ، بناء على مبدأ تعزيز تجميع الخلايا من خلال القوى الخارجية15،16،17،18. على عكس القوى الكهرومغناطيسية أو المغناطيسية ، فإن تقنيات معالجة الخلايا القائمة على الصوت غير جراحية وخالية من الملصقات ، مما يتيح تكوين كروي مع توافق حيوي ممتاز19,20.
بشكل عام ، تم تطوير الموجات الصوتية السطحية الدائمة (SAWs) والأجهزة القائمة على الموجات الصوتية السائبة (BAWs) لتوليد كرويات ، باستخدام العقد الصوتية (ANs) التي تنتجها الحقول الصوتية الدائمةالمقابلة 21،22،23. على وجه الخصوص ، اكتسبت أجهزة التجميع الصوتية القائمة على BAWs ، مع مزايا التصنيع المريح والتشغيل السهل وقابلية التوسع الممتازة ، الانتباه لتصنيع كرويات الخلية24,25. لقد قمنا مؤخرا بتطوير جهاز تجميع صوتي سهل قائم على BAWs مع القدرة على توليد كرويات ذات إنتاجية عالية26. يتكون الجهاز المقترح من غرفة مربعة متعددة الميثيل ميثاكريلات (PMMA) مع ثلاثة محولات تيتانات الزركونات الرصاص (PZT) مرتبة على التوالي في المستوى X / Y / Z. يتيح هذا الترتيب إنشاء نمط صفيف نقطي 3D للعقد الصوتية المرفوعة (LANs) لتجميع خلايا القيادة. بالمقارنة مع الأجهزة المستندة إلى BAWs أو SAWs التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، والتي يمكنها فقط إنشاء مجموعة 1D أو 2D من ANs27،28،29 ، يتيح الجهاز الحالي مجموعة نقطية ثلاثية الأبعاد من شبكات LAN لتشكيل إجمالي الخلايا السريع داخل محلول الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA). بعد ذلك ، نضجت مجاميع الخلايا إلى كرويات ذات قابلية عالية للبقاء داخل سقالات GelMA المعالجة ضوئيا بعد ثلاثة أيام من الزراعة. أخيرا ، تم الحصول بسهولة على عدد كبير من الأجسام الكروية ذات الحجم الموحد من سقالات GelMA للتطبيقات النهائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع جهاز التجميع الصوتي 3D
- ابدأ بإعداد أربع صفائح PMMA بسمك 1 مم من خلال القطعبالليزر 30 ، ثم تابع لصقها معا لتشكيل غرفة مربعة بعرض داخلي 21 مم وارتفاع 10 مم.
- بعد ذلك ، قم بتوصيل ورقة PMMA أخرى بسمك 1 مم في أسفل الغرفة لتكون بمثابة حامل للحبر الحيوي.
- قم بتثبيت ثلاثة محولات طاقة من تيتانات الرصاص (PZT) بعناية (يبلغ طول كل منها 20 مم ، وعرضها 10 مم ، وسمكها 0.7 مم ، وبتردد رنين أولي يبلغ 3 ميجاهرتز ، انظر جدول المواد) على السطح الخارجي للجدران المتعامدة الثلاثة للغرفة ، على التوالي. تأكد من توسيط محول الطاقة PZT السفلي أسفل الحجرة.
- أسلاك اللحام إلى المنطقتين الموصلتين لكل محول طاقة PZT.
- أخيرا ، قم بتثبيت الجهاز على قاعدة مجوفة لمنع PZT السفلي من ملامسة أسطح العمل الأخرى.
2. إعداد نظام التجميع الصوتي
- ابدأ بتركيب الجهاز الصوتي على منصة المجهر ، مما يسمح بمراقبة الرؤية العلوية لداخل الغرفة.
- ضع مجهرا رقميا على جانب الجهاز خاليا من محولات الطاقة PZT ، مما يتيح مراقبة الرؤية الجانبية للغرفة من الداخل.
- قم بتوصيل الأسلاك بشكل مستقل من محولات الطاقة PZT الثلاثة في سلسلة بثلاثة مضخمات طاقة وثلاث قنوات إخراج لمولدات الوظائف (انظر جدول المواد).
- قم ببرمجة الإعدادات على مولدات الوظائف لكل محول طاقة PZT ، مع تحديد المعلمات مثل شكل الموجة الجيبية والتردد والسعة.
- لضمان التعقيم ، املأ حجرة الجهاز الصوتي بنسبة 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، متبوعا بتنظيف شامل بمحلول PBS معقم. بعد ذلك ، قم بإشعاع الغرفة بضوء الأشعة فوق البنفسجية في مقعد نظيف لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
3. زراعة الخلايا وإجراءات الحصاد
- ابدأ بزراعة خلايا C3A ، وهي خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية ، في دورق زراعة الخلايا T25 باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (انظر جدول المواد).
- عندما تصل خلايا C3A إلى التقاء 80٪ تقريبا ، قم بإجراء مرور الخلية على النحو التالي: أولا ، اغسل الجزء السفلي من قارورة الثقافة مرتين باستخدام PBS. ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA إلى دورق زراعة الخلايا واحتضانه عند 37 درجة مئوية لتسهيل انفصال الخلايا. أوقف عملية التربسين بإضافة 2 مل من وسط الاستزراع الكامل.
- انقل محلول الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل ، وقم بطرده مركزيا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات خلوية.
4. إعداد الحبر الحيوي
- تحضير محلول GelMA 6٪ (وزن / حجم) يحتوي على 0.5٪ (وزن / حجم) ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) عن طريق إذابة 0.3 جم من GelMA و 0.025 جم من LAP (انظر جدول المواد) في 5 مل من محلول الفوسفات العازل (PBS). اترك الخليط في حمام مائي 47 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- قبل الاختلاط مع الخلايا ، مرر محلول GelMA من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) للتعقيم.
- أعد تعليق حبيبات الخلية المذكورة أعلاه (الخطوة 3.3) في وسط زراعة الخلايا. قم بتلطيخ كمية صغيرة من الخلايا بمحلول أزرق تريبان بنسبة 0.4٪ ثم استخدم مقياس دم نظيف لعد الخلايا.
- امزج كمية مناسبة من خلايا C3A ، محسوبة بناء على كثافة الخلية التي تم الحصول عليها أعلاه ، مع محلول GelMA المعقم لتحضير الحبر الحيوي بكثافة خلية تبلغ 2 × 106 خلايا / مل.
- لتصور كرويات الخلايا المجمعة ، قم بتلطيخ خلايا C3A مسبقا عن طريق احتضانها بجهاز تعقب خلايا 2 ميكرومتر (صبغة DiO ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا المصنفة بوسط زراعة الخلايا الطازجة ثلاث مرات قبل الاستخدام.
5. تجميع كرويات الخلية باستخدام الجهاز الصوتي
- ماصة أكثر من 1 مل من الحبر الحيوي في الغرفة المعقمة. تأكد من أن المسافة وجها لوجه بين سطح السائل وقاع الغرفة هي مضاعف عدد صحيح لنصف الطول الموجي الصوتي.
ملاحظة: يمكن للمرء التحكم في هذه المسافة عن طريق ضبط حجم الحبر الحيوي المضاف. يمكن تقدير الطول الموجي الصوتي (λ) باستخدام الصيغة λ = c / f ، حيث يمثل c سرعة الصوت في الوسط ، و f هو تردد محول الطاقة PZT. - قم بتشغيل مولد الوظائف ومضخم الطاقة لبدء تشغيل كل محول طاقة PZT.
ملاحظة: يوصى بتشغيل كل محول طاقة PZT بشكل فردي أولا لتحقيق النمط الخلوي الأمثل للخط المتوازي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء مسح تردد بحجم خطوة 0.001 ميجاهرتز بالقرب من تردد الرنين الأساسي لكل محول طاقة PZT. بعد ذلك ، قم بتطبيق هذه الإشارات المثلى في وقت واحد على جميع محولات الطاقة PZT الثلاثة للحصول على النمط الخلوي 3D-dot المتوقع. قبل تطبيق كل إشارة دخل ، تأكد من تشتيت الخلايا بالتساوي في الحبر الحيوي عن طريق التقليب برفق. - قم بربط الحبر الحيوي باستخدام الضوء الأزرق (405 نانومتر ، 60 ميجاوات / سم2 ، 30 ثانية) لإنشاء سقالة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد تغلف مجاميع الخلايا المجمعة صوتيا. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل مولد الوظائف ومضخم الطاقة.
- انقل سقالة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد بعناية من الحجرة إلى طبق بتري وقطعها إلى قطع صغيرة (على سبيل المثال ، 2 مم × 2 مم × 2 مم) باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة.
- إضافة وسط زراعة الخلايا للزراعة.
ملاحظة: تذكر تغيير وسيلة الثقافة كل يوم.
6. استرجاع كرويات الخلية
- ابدأ بمراقبة تكوين كروي في طبقات مختلفة من السقالات باستخدام مجهر مقلوب.
- بعد 3 أيام من الثقافة ، قم بإزالة وسط الثقافة واغسل سقالات الهيدروجيل جيدا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
- احتضان السقالات بأكثر من 2 مل من محلول تحلل GelMA بتخفيف 1: 200 مع وسط زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة الخلايا. تهدف هذه الخطوة إلى إذابة سقالات الهيدروجيل.
- انقل المحلول من الخطوة السابقة إلى أنبوب ثم قم بطرده مركزيا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات كروية الخلية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط استزراع جديد للتطبيقات النهائية.
7. تحليل الجدوى الكروية
- تقييم صلاحية كرويات الخلية إما داخل سقالات هيدروجيل أو في الكرويات المسترجعة باستخدام مجموعة تلطيخ حية / ميتة (انظر جدول المواد).
- احتضان العينات في نقاط زمنية مختلفة مع 1 مل من محلول PBS يحتوي على 1 ميكرولتر من Calcein-AM و 2 ميكرولتر من Propidium Iodide (PI) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بالنسبة للعينات داخل سقالات الهيدروجيل ، اغسلها مباشرة باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين. بالنسبة للكرويات المسترجعة ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات كروية ، وغسلها مرتين قبل المراقبة.
- راقب العينات باستخدام مجهر مضان والتقط صور مضان.
- احسب نسبة المساحة الملطخة ب Calcein-AM إلى المساحة الإجمالية الملطخة بكل من Calcein-AM و PI باستخدام ImageJ لتحديد صلاحية الكروية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
صممت هذه الدراسة جهاز تجميع صوتي 3D للتصنيع الشامل للكرويات الخلوية. يتألف الجهاز الصوتي من غرفة مربعة مع محولي طاقة PZT متصلين بالمستوى X والمستوى Y على السطح الخارجي للغرفة ومحول طاقة PZT واحد في قاع الغرفة (الشكل 1A ، B). تم توصيل ثلاث قنوات إخراج من مولدين وظيفيين بثلاثة مضخمات طاقة لتوليد ثلاث إشارات جيبية مستقلة لتشغيل محولات الطاقة PZT (الشكل 1C).
كانت ترددات الرنين المثلى المستخدمة لتشغيل محولات الطاقة الثلاثة PZT المتصلة بمستويات X / Y / Z للغرفة هي 3.209 ميجاهرتز و 3.283 ميجاهرتز و 3.215 ميجاهرتز على التوالي. كانت السعة المثلى لجميع محولات الطاقة الثلاثة PZT هي 10 جهد خرج من الذروة إلى الذروة (Vpp) ، تم قياسه بواسطة راسم الذبذبات. يوضح الشكل 2 أ آلية عمل مجاميع الخلايا المتولدة باستخدام جهاز التجميع الصوتي ثلاثي الأبعاد. عندما يتم تطبيق الإشارة ، يتم دفع الخلايا إلى العقد الصوتية تحت تأثير قوة الإشعاع الصوتي (ARF). لتصور كرويات الخلية ، تم تلطيخ الخلايا مسبقا ب 2 ميكرومتر DiO (مضان أخضر). بعد تجميع الخلايا الصوتية ، تم استخدام مجهر متحد البؤر لمراقبة مجاميع الخلايا المجمعة صوتيا 3D. وقد لوحظ أن مجاميع الخلايا هذه مرتبة في نمط صفيف 3D نقطة منتظم مع إشارات فلورسنت خضراء موحدة (الشكل 2B). أظهرت المناظر العلوية المختلفة لصور المجال الساطع أيضا أن الركام المشكل في كل طبقة تم ترتيبها في نمط صفيف ثنائي النقطة (الشكل 2C).
لوحظ نمو مجاميع الخلايا داخل الهيدروجيل في نقاط زمنية مختلفة. أظهرت النتائج أن الركام المجمع اندمج تدريجيا وشكل كرويات ضيقة بحلول اليوم 3 ، مصحوبة بزيادة في قطر الكرة (الشكل 3 أ ، ب). تم إجراء تلطيخ حي / ميت لتقييم صلاحية كرويات الخلية. تم تحقيق قابلية جيدة للخلايا (>90٪) قبل اليوم 3 ، بينما انخفضت الصلاحية قليلا بعد أسبوع من المزرعة (الشكل 3C ، D).
لاسترجاع التكويات ، تم استخدام مخزن مؤقت تحلل GelMA لفصل سقالات الهيدروجيل ، وإطلاق كرويات الخلية المغلفة (الشكل 4 أ). وبالتالي ، بعد ثلاثة أيام من الزراعة ، تمت معالجة القطع الصغيرة من سقالات الهيدروجيل بمحلول تحلل GelMA عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حافظت الأجسام الكروية التي تم إطلاقها على مورفولوجيا كروية جيدة مع توزيع ضيق الحجم ، جنبا إلى جنب مع التعبير عن الألبومين والجدوى المرغوبة (الشكل 4B-D).
الشكل 1: جهاز التجميع الصوتي ثلاثي الأبعاد. (أ) رسم تخطيطي يصور المنظر العلوي لجهاز التجميع الصوتي ثلاثي الأبعاد ، ويتكون من غرفة PMMA متصلة بثلاثة محولات طاقة PZT. (ب) صورة تعرض جهاز التجميع الصوتي 3D الفعلي. (C) صورة تظهر جهاز التجميع الصوتي 3D المتصل بمولدين وظيفيين وثلاثة مضخمات طاقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مجاميع الخلايا المجمعة صوتيا. (أ) رسم تخطيطي يوضح آلية عمل مجاميع الخلايا الناتجة عن جهاز التجميع الصوتي 3D ، حيث يتم دفع الخلايا إلى العقد الصوتية بواسطة قوة الإشعاع الصوتي. (ب) صور متحدة البؤر تعرض مجاميع الخلايا المجمعة صوتيا 3D من وجهات نظر مختلفة. (ج) صور المجال الساطع التي تعرض مجاميع الخلايا المشكلة في طبقات مختلفة داخل سقالة الهيدروجيل. يمثل شريط المقياس 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: نمو مجاميع الخلايا إلى كرويات داخل سقالة GelMA. (أ) صور المجال الساطع توضح تكوين كرويات الخلايا المدمجة بعد فترة استزراع مدتها 3 أيام. (ب) التحديد الكمي لأحجام الأجسام الكروية. (ج) تلطيخ كروي حي / ميت داخل سقالة هيدروجيل بعد أسبوع واحد من الثقافة. د: القياس الكمي لصلاحية كروية الخلية. يمثل شريط المقياس 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: استرجاع كرويات الخلايا المصنعة صوتيا. (أ) رسم توضيحي يوضح خطوات استرجاع كرويات الخلايا المصنعة صوتيا. (ب) صور المجال الساطع التي تعرض الأجسام الكروية المسترجعة بتكبيرات مختلفة. يمثل شريط المقياس 250 ميكرومتر. (ج) تحليل صلاحية ووظائف الأجسام الكروية المسترجعة. يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. (د) توزيع حجم الأجسام الكروية بعد الاسترجاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن التصنيع الفعال والمستقر للكرويات الخلوية ذات الإنتاجية العالية باستخدام تقنيات مثل جهاز التجميع الصوتي ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا لتطوير الهندسة الطبية الحيوية وفحص الأدوية1،2،3. يبسط هذا النهج الإنتاج الضخم للكرويات الخلوية من خلال إجراءات مباشرة.
ومع ذلك ، هناك عوامل حاسمة يجب مراعاتها عند استخدام هذا الجهاز الصوتي. يعد إنشاء الموجات الدائمة أمرا ضروريا لبناء مجال صوتي لمصفوفة 3D dot. في هذا الجهاز ، يوجد محول طاقة PZT واحد فقط في كل بعد ، ويعمل كمصدر لإثارة الصوت. لذلك ، لكل بعد ، من الأهمية بمكان أن تكون المسافة وجها لوجه بين الجدران المقابلة لغرفة PMMA أو سطح الماء PMMA مضاعفا صحيحا لنصف الطول الموجي. التردد الأساسي لمحولات الطاقة PZT التي استخدمناها هو 1 ميجاهرتز ، مما ينتج عنه طول موجي في الماء أو الحبر الحيوي يبلغ حوالي 500 ميكرومتر. وبالتالي ، بالنسبة للبعد الأفقي ، تم ضبط المسافة وجها لوجه بين الجدارين المتقابلين لغرفة PMMA في الجهاز الصوتي على 21 مم ، وهو ما يمثل حجم محولات الطاقة PZT. بالنسبة للبعد الرأسي ، يمكن تعديل المسافة وجها لوجه بين جدار PMMA السفلي وسطح الماء عن طريق تغيير حجم الحبر الحيوي لتلبية شروط تكوين الموجة الدائمة. أثناء التشغيل التجريبي ، قد يكون من الضروري إجراء تعديلات طفيفة على التردد للتعويض عن انحرافات المسافة. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم الحفاظ على جهد الدخل عند مستوى معتدل لمنع ارتفاع درجة حرارة محول الطاقة PZT ، مما قد يؤدي إلى تسخين الحبر الحيوي ويحتمل أن يتلف الخلايا. في التجارب ، تم استخدام جهد من الذروة إلى الذروة يبلغ 10 Vpp ، لاستكمال تجميع مجموع الخلايا في غضون 30 ثانية مع الحفاظ على درجة حرارة الحبر الحيوي أقل من 30 درجة مئوية.
أحد قيود هذا النهج هو الاعتماد على سقالة GelMA26 ، والتي تلعب دورا حاسما في الحفاظ على السلامة الهيكلية لمجاميع الخلايا المجمعة صوتيا أثناء نضجها إلى كرويات الخلية عند إزالة المجال الصوتي. ومع ذلك ، فإن الخطوة التي تنطوي على حل سقالات هيدروجيل لاسترجاع الكرة قد تؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلية وفقدان كروي محتمل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون حجم سقالة GelMA في حدود عدة ملليمترات للسماح باختراق المغذيات واستبدالها بالخلايا المغلفة. يمكن أن يقيد حجم السقالة المحدود في نطاق المليمتر إنتاجية كرويات الخلايا ، حتى لو تم إنتاج سقالات أكبر في البداية ثم تقطيعها إلى قطع أصغر. قد تركز الجهود المستقبلية على الحفاظ على مجاميع الخلايا المجمعة صوتيا في الموقع ، معلقة في وسط الاستزراع ، لتمكينها من النمو لتصبح كروية دون الحاجة إلى سقالة خارجية.
باختصار ، يمكن تجميع جهاز التجميع الصوتي الموصوف في هذا البروتوكول وتشغيله بسهولة بخطوات بسيطة نسبيا ، مما يوفر ميزة تصنيع كرويات الخلايا بكفاءة. علاوة على ذلك ، يتوافق جهاز التجميع الصوتي هذا مع أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك تصنيع المواد العضوية ، مما يعرض إمكاناته الكبيرة لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم عمل Tis من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1104600) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ في الصين (LQ23H160011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
