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Summary
在这里，我们介绍了有效的大鼠限制和锁骨下静脉穿刺方法的组合，可以在没有麻醉的情况下在大鼠中快速、安全和重复采血。
Abstract
有几种既定的方法可以从大鼠身上获取重复的血液样本，最常用的方法是无麻醉的侧尾静脉取样和麻醉的颈静脉取样。然而，这些方法大多需要辅助和麻醉设备，有时在采血或血液样本质量差方面造成困难。此外，当需要对大量大鼠进行重复采血时，这些采血方法会消耗大量的时间和人力资源。本研究提出了一种由单个熟练个体对非麻醉大鼠进行重复采血的技术。通过刺穿锁骨下静脉可以获得非常令人满意的血液样本。该方法显示出令人印象深刻的 95% 的总体成功率，从大鼠约束到完成采血的中位时间仅为 2 分钟。此外，在指定范围内进行连续采血不会对大鼠造成任何伤害。这种方法值得推广用于血液采集，特别是在大规模的药代动力学研究中。
Introduction
大鼠是最常见的实验动物之一，获取血液样本的方法有很多种。对于在结束阶段涉及单次采血的实验，可以通过心脏穿刺或腹主动脉采血获得足够量的血液1。然而，一些研究需要从大鼠身上重复采血以进行常规血液或生化分析，特别是在药代动力学和毒理学研究中，需要重复采血以确定药物的吸收、分布和代谢2。
目前，虽然尾静脉采血是大鼠采血最常见的方法，尽管不需要麻醉，但这种方法对于重复采集可能具有挑战性，并且采集的血液量相对较小3,4。此外，虽然可以从隐静脉和静脉收集血液，但获得的血液量有限，并且需要麻醉1,5。此外，从下颌下静脉丛以及舌下、颈静脉和锁骨下静脉采集的血液样本可提供更高质量的样本，但通常需要麻醉或多人的协助 1,6,7,8,9。最后，眶后窦/耳道采血不仅需要麻醉，还可能对大鼠造成伤害和压力9.
通常从主要静脉获得的血液样本的质量通常达到最高标准1。目前，一些研究发现，通过颈静脉连续显微取样是一种非常适合大鼠毒理学研究的方法，尽管这种方法通常需要颈静脉导管插入术10,11,12。因此，如何在不进行手术干预的情况下，按照动物研究的3R原则获得高质量的血液样本，是值得探索的。本研究的目的是提出一种有效从大鼠锁骨下静脉中提取血液的方法。该技术无需麻醉即可通过单人手术快速收集令人满意的样本。
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Protocol
本研究遵循了《实验动物护理和使用指南》第 8 版中概述的指南13。该研究获得了兰州大学第二医院伦理委员会的批准，并按照ARRIVE指南2.014进行了记录。12-16周龄的12只健康Wistar大鼠（6只雄性体重290-330 g，6只雌性体重250-280 g）在兰州大学GLP动物实验室进行3天实际实验。使用的鼠笼为R5型，尺寸为545 mm x 395 mm x 200 mm，并配备了高压灭菌垫料。所有大鼠都可以不受限制地获得食物和水。实验室保持平均湿度为25%，平均温度为24°C，昼夜交替（上午7：00/晚上7：00）。在研究结束时，所有动物都使用过量的异氟烷被人道地安乐死。有关本研究中使用的材料和仪器的全面信息，请参阅 材料表。
1. 样本量计算和动物选择
- 选择资源方程方法15 ，使用方程（1）估计动物样本量。
E = 动物总数 − 组总数 （1）
其中 E 是方差分析的自由度 （ANOVA），范围为 10 到 20。
注意：在这项研究中，将12只动物分为 A 组和 B 组（每组三只雄性和三只雌性）。 - 将本研究的主要结果定义为单个人重复采血的成功率和时间消耗。
- 将次要结果指标定义为大鼠体重、食物和水摄入量的变化，以及不良事件的发生率（如锁骨骨折、皮下血肿、气胸和死亡率）。
- 将成功的采血定义为满足以下标准：i） 单次采血少于三次;ii） 总时间（从大鼠约束到完成采血）不超过 5 分钟;iii）在获得透明血浆的同时达到目标血容量。将任何偏离这些标准的行为视为抽样失败。
2. 动物约束和采血
注意： A 组和 B 组大鼠的血液样本由两名经验丰富的研究人员收集，他们都抽取了至少100份血液样本。在4天内从两组大鼠中收集血液样本共96次。这种采血方法不需要对大鼠进行麻醉或额外的约束装置。然而，它需要熟练的处理技术。
- 在采血前一天（第1天）上午8：00，将每只大鼠分配到其单独的笼子中，同时称量其食物和水。然后，让另一位研究人员对测量结果视而不见，从第 1 天开始每天上午 8：00 记录大鼠的体重、食物消耗量和饮水量。
- 要遵循此方案，首先在每天上午 10：00 抽血，然后在晚上 10：00 抽血，从两侧锁骨下静脉交替采集 0.15 mL 血液。
注意：要收集的血液量由体重最低的大鼠在一周内可以忍受的最大体积决定。 - 用肝素钠（25 U / mL）冲洗注射器，并用酒精对注射部位进行消毒。
- 轻轻抚摸大鼠的背部皮肤并反复捏住它的脖子，以帮助大鼠放松（视频1）。
- 使用非惯用手的拇指和食指，牢牢抓住并抬起大鼠的颈部皮肤（图1A 和 视频1）。
- 在惯用手的协调下，用剩下的三个手指和非惯用手的手掌固定大鼠的背部皮肤并固定其前肢（图1B，C和视频2）。
注意：如果老鼠反抗或挣扎，可以重复几次此过程，以帮助老鼠习惯处理。以下步骤是成功采血的关键。 - 使用非惯用手的食指，轻轻向下推大鼠的头部皮肤，而其他手指和手掌则帮助向外旋转肩关节。在此过程中，用惯用手完全伸展大鼠的肩关节（图1D-F和视频2）。
- 用非惯用手牢牢抓住大鼠，使大鼠的头部和身体对齐成一条直线（图1G，H）。然后，用惯用手定位锁骨的位置并确认穿刺部位（图1I，视频2和视频3）。
注意：没有必要给老鼠剃毛。在 图 1 中，剃须只是为了在更大程度上显示锁骨和穿刺位置。当约束大鼠，尤其是大鼠>350克时，让大鼠将脚放在坚实的表面上将有助于支撑它们的体重。此外，约束器在采血时应监测每只大鼠的呼吸频率，以确保约束装置不会太紧，这可能会导致呼吸窘迫。 - 用惯用手握住与大鼠身体平行的注射器，针尖朝上，注射器秤朝向实验者，与大鼠身体中线保持约15°角。将针插入锁骨切迹下方0.5厘米处（锁骨近端三分之一和胸骨的交界处），确保针头与大鼠的身体保持平行（图1J 和 视频3）。
注意： 应特别注意针头插入的角度和深度，以免刺穿血管或对相邻血管造成意外损伤。 - 轻轻抽出注射器以产生负压，通常伴有进入血管时可触及的突破感（在初始采血期间尤为明显）。保持这个姿势，并根据需要以恒定速度收集0.1-1.0mL血液（遵循IACUC指南，每周约4-5.3mL / kg血液1）（图1K 和 视频3）。
- 如果穿刺时没有血，请尝试轻轻调整针头的角度和深度或轻轻旋转注射器（视频 3）。如果在同一侧连续三次尝试均不成功，请停止所有出血，然后切换到另一侧进行穿刺。
注意：建议快速刺穿皮肤，以防止大鼠因不适而挣扎。 - 用棉签止血，然后将大鼠放回笼子里（视频4）。
- 根据实验要求处理血液样本。
3. 血样处理
- 将注射器针头倒入锐器容器中。将收集的血液转移到先前用肝素冲洗的 1.5 mL 微量离心管中。将管放入离心机中，将其设置为4°C和1,200× g，并离心10分钟以分离血浆。使用1.0mL巴斯德移液管将血清转移到干净的微量离心管中，并将其储存在-80°C。
注意： 为防止因压力而溶血，必要时请取下针尖。在血浆抽吸过程中，避免从试管底部抽取血细胞。有时，注射器的表面可能会收集老鼠的皮毛;注意不要让任何毛皮进入管子，因为它会导致凝血。
4. 统计分析
- 将所有数据呈现为均值±标准差，并检验它们的方差均匀性。
- 使用 Fisher 精确检验来比较组间的成功率。
- 使用双样本独立 t 检验来比较两组之间的总体均值。
- 使用方差分析 （ANOVA） 进行连续测量，例如血液采样时间、体重、食物摄入量和饮水量。考虑 P < 0.05 具有统计学意义。
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Representative Results
如图2A所示，高质量的等离子体标本呈现淡黄色调、清晰度和透明度，没有任何红色调或凝血。图2B分别显示了由于程序不当导致的溶血（左侧）或凝血（右侧）。在4天内的96次采血过程中，A组和B组的平均单次采血时间分别为119.87±33.62 s和123.28±30.96 s。两组每日采血时间无显著差异（t = 0.66，P = 0.54，表1）。 最短的个体采血时间分别为78 s和89 s。
A组和B组成功单次采血所需的平均尝试次数分别为1.21次和1.17次。两组之间的尝试次数没有显著差异（t = 0.58，P = 0.60 ，表2）。A组和B组的总体成功率分别为93.8%（45/48）和95.8%（46/48），两组之间的总体成功率无显著差异（P > 0.05，表1）。B组各时间点采血时间无显著差异。A组第2天采血时间小于第4天（105.75 ± 14.22s vs 144.5 ± 25.45 s，t = 12.39，P < 0.01; 表1）。 此外，更多的尝试和更长的穿刺时间通常表明更高的失败率（图3A-C）。第三天，B组遭遇了一次因溶血而失败的失败。第四天，A组遭遇了三次失败：一次是溶血，两次是无法获取血样。B组还因无法获得血液样本而经历了一次失败。
在连续4天的观察过程中，两组大鼠都表现出稳定的体重增加。同性大鼠的水和食物摄入量保持相对稳定。在整个采血过程中，没有发现大鼠死亡的情况，也没有观察到任何明显的并发症，如锁骨骨折、气胸或穿刺伤部位血肿（图3D-F和表3）。
图1：大鼠锁骨下静脉的固定和采血方法。 （A-H） 固定的操作;（一）锁骨和采血部位的位置;（J-L）采血和止血的过程。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：成功和不成功采集的血液样本。 （A） 典型血样和分离血浆;（B）溶血（左）和凝血（右）血样 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：采血有效性和安全性的评估。 （A） 每天平均采血时间;（二）日均穿刺次数;（三）两组采血成功率和失败率;（D-F） 两组大鼠采血过程中体重、食物摄入量和水摄入量的变化。请点击这里查看此图的较大版本.
图4：大鼠颈部血管的解剖结构。 （A） 浅表解剖结构;（二）深层解剖结构。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 群 | 时间 | 平均采血时间 | |||
| 第1天 | 第2天* | 第3天 | 第4天 | ||
| 一个 | 上午10：00 | 92.83 ± 7.38 | 100.5 ± 17.36 | 117.83 ± 12.02 | 146.6 ± 24.76 |
| 下午10：00 | 108.67 ± 10.86 | 111.00 ± 6.95 | 158.33 ± 60.47 | 142.40 ± 25.96 | |
| 平均时间 | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144.5 ± 25.45 | |
| 成功率 | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| 总体成功率 | 93.8% (45/48) | ||||
| 总体平均时间 | 119.87 ± 33.62 | ||||
| B | 上午10：00 | 98.17 ± 7.24 | 110,17 ± 14,33 | 123.67 ± 30.99 | 147.2 ± 17.47 |
| 下午10：00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165.67 ± 49.70 | |
| 平均时间 | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157.27 ± 39.63 | |
| 成功率 | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| 总体成功率 | 95.8% (46/48) | ||||
| 总体平均时间 | 123.28 ± 30.96 | ||||
表1：两组大鼠的采血次数和成功率。 * A 组第2天采血时间小于第4天（t = 12.39 P < 0.01）。
| 群 | 时间 | 平均穿刺次数 | |||
| 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | ||
| 一个 | 上午10：00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 下午10：00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| 平均 | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| 总体平均 | 1.21 | ||||
| B | 上午10：00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 下午10：00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| 平均 | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| 总体平均 | 1.17 | ||||
表2：大鼠采血的平均穿刺次数。
| 性 | 群 | 重量 （g） | 食物摄入量 （g） | 饮水量 （g） | |||||||||
| 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | ||
| ♀ | 一个 | 260 ± 7.5 | 267.7 ± 6.3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13.3 ± 0.79 | 13.5 ± 0.93 | 14.0 ± 0.29 | 14.0 ± 0.77 | 23.9 ± 0.36 | 23.1 ± 0.77 | 24.4 ± 0.70 | 24.6 ± 0.12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268.3 ± 14.0 | 272.7 ± 9.4 | 279 ± 7.0 | 14.4 ± 0.45 | 13.9 ± 0.52 | 14.7 ± 0.26 | 14.3 ± 0.56 | 23.6 ± 0.73 | 23.7 ± 0.65 | 24.4 ± 0.91 | 24.1 ± 1.79 | |
| 电汇 | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| 调整后的 P 值 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | |
| ♂ | 一个 | 313.7 ± 12.0 | 325.7 ± 9.1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15.6 | 15.9 ± 0.64 | 16.2 ± 0.08 | 15.7 ± 0.70 | 15.9 ± 0.73 | 26.2 ± 0.62 | 27.2 ± 0.9 | 26.9 ± 1.0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16.4 | 322.3 ± 18.0 | 330.7 ± 17.6 | 342 ± 16.9 | 15.3 ± 0.74 | 15.7 ± 0.85 | 15.1 ± 0.33 | 15.3 ± 0.86 | 27.1 ± 0.37 | 25.6 ± 1.27 | 27.5 ± 0.76 | 26.2 ± 0.99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| 调整后的 P 值 | 0.94 | 0.86 | >0.99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
表3：大鼠日体重、食物摄入量和水分摄入量的变化。
视频1：大鼠的镇静和处理。请按此下载此影片。
视频2：大鼠的约束程序。请按此下载此影片。
视频3：大鼠的采血程序。请按此下载此影片。
视频 4：穿刺部位的止血压迫。请按此下载此影片。
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Discussion
虽然尾静脉采血是大鼠重复采血的最常见方法，但可能会受到麻醉药物的影响，并且由于尾静脉体积小，单次可采集的血液量有限，导致采血时间较长4,5。尽管高效液相色谱 （HPLC） 串联质谱 （MS/MS） 系统与大鼠尾静脉的毛细管显微采样 （CMS） 相结合可以减少大鼠的血液使用量11，但并非所有机构都配备了这种昂贵的设备。从球后丛/鼻窦取血经常引起大鼠的焦虑和疼痛，操作不当甚至会损害大鼠的视力和健康。因此，不推荐将该方法用于大鼠的血液采样9。
锁骨下静脉位于大鼠的胸大肌和三角肌之间，并在锁骨内三分之一处流入颈静脉（图4）。在Yang等人的研究中，熟练的操作者在麻醉下从大鼠锁骨下静脉采集血液的成功率约为90%，从穿刺开始到结束的最短时间为65 s7。在Wang等人的研究中，使用垂直方法从大鼠锁骨下静脉收集血液样本。虽然他们的方法不涉及麻醉，但它确实需要两个人的合作来安全地限制大鼠6。该研究方案显示了采血的良好优势。该协议不需要任何特殊的约束装置或麻醉设施。如果处理得当，大鼠通常表现出最小的抵抗力。从大鼠约束到完成采血的中位时间仅为2分钟，总体成功率高达95%。这种方法大大节省了人力资源，减少了采血所需的时间。此外，获得的血浆样品是透明透明的，溶血和凝血事件的发生率极低，从而最大限度地减少了实验重复。熟练掌握该技术对于管理需要重复采血的大规模大鼠药代动力学和毒理学实验特别有价值。
在我们的研究中，抽血失败的主要发生发生在第 4 天，这可能与反复穿刺造成的静脉损伤有关。反复穿刺可导致血管壁损伤并引起炎症反应，导致血管壁增厚硬化，甚至诱发血管狭窄。如果穿刺后止血不充分，外渗的血液会进一步引起组织水肿和炎症，从而导致瘢痕组织的形成。这些疤痕组织很难穿透，也会拉扯并导致血管位置移动，所有这些都使血管更难定位和刺穿。在我们的研究中，使用26G注射器（0.45mm）进行采血，相对于人体静脉来说，这很好，但仍然对大鼠静脉造成相当大的损害。在第一次抽血期间，当针头穿过血管时，有明显的穿透感，随着抽血次数的增加，这种穿透感会减少，采血时间更长，失败率更高。因此，我们建议使用较细的胰岛素针头进行采血，采血后应施加足够的压力以防止血肿形成，并应进行交替抽血以充分修复静脉。根据我们的经验，训练有素的抽血师可以在24小时内使用26G针头从同一只大鼠的双侧锁骨下静脉交替抽血8-10次，每次抽血之间平均间隔2-3小时。然而，大鼠可以忍受的最大抽血次数、恢复期和抽血周期可能会受到所用针规、不同实验所需的抽血间隔以及抽血师的熟练程度的影响。这些因素需要在未来的研究中进一步探讨。对于药代动力学实验所需的密集血液采样，最好交替从左右锁骨下静脉采集血液。在确实不可用的情况下，可以补充其他采血方法。
体重、饮水量和食物摄入量是评估大鼠健康状况的最基本和最直接的指标16.一项早期研究表明，每天通过颈静脉采集的血液少于0.9毫升不会影响大鼠的血流动力学，也不会导致任何显着的体重减轻。然而，当血液收集量超过 1.5 毫升时，它会导致体重减轻17。在Yokoya等人的研究中，从颈静脉重复显微取样（每次50μL，24小时内6-7次）不影响大鼠体重或食物摄入量10。此外，采血方式可能会影响大鼠的体重和食物摄入量。在之前使用舌下静脉采血的研究中，第一天 24 小时采集 0.5-1.0 mL 血液导致大鼠体重减轻并减少食物摄入量，尽管体重减轻并不显着18.本研究显示，采血期间大鼠体重仍稳步增加，大鼠食水摄入量、采血相关并发症、死亡均无明显变化，表明该方法安全可靠。
需要强调的是，在进行采血之前让大鼠适应约束过程可能会减少大鼠的压力并提高采血的成功率。固定不足和静脉暴露不足会导致采血失败，甚至由于大鼠在疼痛中挣扎而导致局部静脉破裂。在较轻的情况下，这可能会导致明显的皮下血肿，而在严重的情况下，可能会导致大鼠死亡。此外，固定不良可能导致老鼠逃跑并对个体造成伤害。因此，我们强烈建议在进行采血程序之前彻底掌握处理技术。此外，重要的是要谨慎地向外旋转肩关节施加的力，因为压力过大可能导致大鼠锁骨骨折。
本研究的一个局限性是，我们没有通过测量皮质酮水平的变化或笼边监测来系统地评估这种采血方法在大鼠中引起的应激变化，这需要在未来的研究中进行探索。本文的另一个局限性是缺乏替代的采血方法作为对照。在未来的研究中，将与其他采血方法的优缺点进行比较。总而言之，这项研究引入了一种无需麻醉即可从大鼠身上采集单人血液的方法。这种方法提供了一种直接、快速和安全的方法来获取大鼠的血液样本。
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Disclosures
作者没有相关的财务或非财务利益需要披露。
Acknowledgments
本研究得到了兰州大学第二医院翠英计划项目（批准号：The Cuiying Plan Project）的支持。PR0121015）和甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室（批准号：0412D2）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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本月在JoVE，第201期，大鼠，锁骨下静脉，血液采样Erratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
