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Summary
Qui presentiamo una combinazione di efficaci metodi di restrizione dei ratti e puntura della vena succlavia che consentono una raccolta di sangue rapida, sicura e ripetuta nei ratti senza anestesia.
Abstract
Esistono diversi metodi consolidati per ottenere campioni di sangue ripetuti dai ratti, con i metodi più comunemente impiegati che sono il campionamento della vena caudale laterale senza anestesia e il campionamento della vena giugulare con anestesia. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiede assistenza e attrezzature anestetiche e talvolta pone difficoltà in termini di raccolta del sangue o di scarsa qualità dei campioni di sangue. Inoltre, questi metodi di raccolta del sangue consumano molto tempo e risorse umane quando è necessario un campionamento ripetuto del sangue per un gran numero di ratti. Questo studio presenta una tecnica per il campionamento ripetitivo del sangue in ratti non anestetizzati da parte di un singolo individuo esperto. Campioni di sangue altamente soddisfacenti possono essere ottenuti perforando la vena succlavia. Il metodo ha dimostrato un impressionante tasso di successo complessivo del 95%, con un tempo mediano di soli 2 minuti dalla contenzione del ratto al completamento della raccolta del sangue. Inoltre, l'esecuzione di prelievi di sangue consecutivi all'interno dell'intervallo designato non infligge alcun danno ai ratti. Questo metodo merita di essere promosso per la raccolta del sangue, soprattutto negli studi di farmacocinetica su larga scala.
Introduction
I ratti sono uno degli animali da esperimento più comuni e ci sono molti modi per ottenere campioni di sangue. Per gli esperimenti che prevedono un singolo prelievo di sangue nella fase conclusiva, è possibile ottenere una quantità sufficiente di sangue mediante puntura cardiaca o prelievo di sangue dell'aorta addominale1. Tuttavia, alcuni studi richiedono la raccolta ripetuta di sangue dai ratti per analisi del sangue o biochimiche di routine, specialmente negli studi di farmacocinetica e tossicologia, in cui è necessaria una raccolta ripetuta di sangue per determinare l'assorbimento, la distribuzione e il metabolismo dei farmaci2.
Attualmente, sebbene la raccolta del sangue della vena caudale sia il metodo più comune per il prelievo di sangue dai ratti, nonostante non richieda l'anestesia, questo metodo può essere impegnativo per raccolte ripetute e il volume di sangue raccolto è relativamente piccolo 3,4. Inoltre, sebbene il sangue possa essere raccolto dalle vene safene e del pene, la quantità di sangue ottenuta è limitata ed è necessaria l'anestesia 1,5. Inoltre, i campioni di sangue prelevati dal plesso venoso sottomandibolare, così come dalle vene sublinguali, giugulari e succlavia forniscono campioni di qualità superiore, ma in genere richiedono l'anestesia o l'assistenza di più individui 1,6,7,8,9. Infine, la raccolta di sangue del seno/canale retro-orbitale non solo richiede l'anestesia, ma può anche potenzialmente causare lesioni e stress ai ratti9.
La qualità dei campioni di sangue tipicamente ottenuti dalle vene principali è generalmente di altissimo livello1. Attualmente, alcuni studi hanno scoperto che il microcampionamento continuo attraverso la vena giugulare è un metodo molto adatto per la ricerca tossicologica nei ratti, sebbene questo metodo di solito richieda il cateterismo della vena giugulare 10,11,12. Pertanto, vale la pena esplorare come ottenere campioni di sangue di alta qualità secondo il principio delle 3R della ricerca sugli animali senza intervento chirurgico. L'obiettivo di questo studio era quello di presentare un metodo per estrarre in modo efficiente il sangue dalla vena succlavia nei ratti. Questa tecnica consente la rapida raccolta di campioni soddisfacenti attraverso una procedura da parte di una sola persona senza la necessità di anestesia.
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Protocol
Questo studio ha aderito alle linee guida delineate nell'ottava edizione della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio13. La ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico del Secondo Ospedale dell'Università di Lanzhou ed è stata documentata in aderenza alle linee guida ARRIVE 2.014. Dodici ratti Wistar sani (sei maschi del peso di 290-330 g e sei femmine del peso di 250-280 g) di età compresa tra 12 e 16 settimane sono stati ospitati nel GLP Animal Laboratory dell'Università di Lanzhou per 3 giorni prima dell'esperimento vero e proprio. Le gabbie per topi utilizzate erano del tipo R5, misuravano 545 mm x 395 mm x 200 mm ed erano dotate di materiale di lettiera autoclavato. A tutti i ratti è stato fornito libero accesso sia al cibo che all'acqua. Il laboratorio ha mantenuto un'umidità media del 25%, una temperatura media di 24 °C e un ciclo di luce alternato tra giorno e notte (7:00/19:00). Al termine dello studio, tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando una dose eccessiva di isoflurano. Per informazioni complete sui materiali e gli strumenti utilizzati in questo studio, fare riferimento alla Tabella dei materiali.
1. Calcolo della dimensione del campione e selezione degli animali
- Scegliere il metodo15 dell'equazione delle risorse per stimare la dimensione del campione animale utilizzando l'equazione (1).
E = Numero totale di animali − Numero totale di gruppi (1)
Dove E è il grado di libertà di analisi della varianza (ANOVA) e varia da 10 a 20.
NOTA: In questo studio, 12 animali sono stati divisi in due gruppi A e B (tre maschi e tre femmine per gruppo). - Definire l'esito primario di questo studio come il tasso di successo e il consumo di tempo di ripetuti prelievi di sangue da parte di un singolo individuo.
- Definire le misure di esito secondarie come variazioni del peso corporeo del ratto, dell'assunzione di cibo e acqua, nonché dell'incidenza di eventi avversi (come fratture della clavicola, ematomi sottocutanei, pneumotorace e mortalità).
- Definire il successo del prelievo di sangue come rispondente ai seguenti criteri: i) meno di tre punture per un singolo prelievo di sangue; ii) un tempo totale (dalla contenzione dei ratti al completamento del prelievo di sangue) non superiore a 5 minuti; e iii) raggiungere il volume sanguigno desiderato ottenendo plasma chiaro. Considerare qualsiasi deviazione da questi criteri un errore di campionamento.
2. Contenzione degli animali e raccolta del sangue
NOTA: I campioni di sangue dei ratti di gruppo A e B sono stati raccolti da due ricercatori esperti, entrambi i quali avevano prelevato almeno 100 campioni di sangue. I campioni di sangue sono stati raccolti da entrambi i gruppi di ratti per un totale di 96 volte nel corso di 4 giorni. Questo metodo di raccolta del sangue non richiede anestesia o dispositivi di contenzione aggiuntivi per i ratti. Tuttavia, richiede tecniche di manipolazione esperte.
- Alle 8:00 del giorno prima del prelievo di sangue (giorno 1), assegnare ogni ratto alla sua gabbia individuale mentre vengono pesati il cibo e l'acqua. Quindi, chiedi a un altro ricercatore, cieco alle misurazioni, di registrare il peso dei ratti, il consumo di cibo e l'assunzione di acqua ogni giorno alle 8:00 dal giorno 1 in poi.
- Per seguire questo protocollo, prelevare il sangue prima alle 10:00 e poi alle 22:00 ogni giorno, raccogliendo 0,15 ml di sangue alternativamente dalle vene succlavia su entrambi i lati.
NOTA: La quantità di sangue da raccogliere è stata determinata dal volume massimo che il ratto di peso più basso poteva tollerare entro una settimana. - Sciacquare una siringa con eparina di sodio (25 U/mL) e disinfettare il sito di iniezione con alcol.
- Accarezza delicatamente la pelle della schiena del ratto e pizzica ripetutamente il collo per aiutarlo a rilassarsi (Video 1).
- Usando il pollice e l'indice della mano non dominante, afferrare e sollevare saldamente la pelle del collo del ratto (Figura 1A e Video 1).
- Con la coordinazione della mano dominante, utilizzare le restanti tre dita e il palmo della mano non dominante per fissare la pelle posteriore del ratto e immobilizzare gli arti anteriori (Figura 1B, C e Video 2).
NOTA: Se il ratto resiste o lotta, questa procedura può essere ripetuta più volte per aiutare il ratto ad abituarsi alla manipolazione. I seguenti passaggi sono fondamentali per il successo della raccolta del sangue. - Usando il dito indice della mano non dominante, spingi delicatamente verso il basso sulla pelle della testa del ratto mentre le altre dita, insieme al palmo, aiutano a ruotare verso l'esterno l'articolazione della spalla. Durante questo processo, utilizzare la mano dominante per estendere completamente l'articolazione della spalla del ratto (Figura 1D-F e Video 2).
- Afferrare saldamente il ratto con la mano non dominante per allineare la testa e il corpo del ratto in linea retta (Figura 1G,H). Quindi, utilizzare la mano dominante per individuare la posizione della clavicola e confermare il sito di puntura (Figura 1I, Video 2 e Video 3).
NOTA: La rasatura del ratto non è necessaria. Nella Figura 1, la rasatura è stata eseguita solo per mostrare la clavicola e la posizione della puntura in misura maggiore. Quando si trattengono i ratti, in particolare i ratti > 350 g, consentire al ratto di appoggiare le zampe su una superficie solida aiuterà a sostenere il loro peso corporeo. Inoltre, il dispositivo di ritenuta deve monitorare la frequenza respiratoria di ciascun ratto durante la raccolta del sangue per garantire che il sistema di ritenuta non sia troppo stretto, il che potrebbe causare difficoltà respiratorie. - Tenendo la siringa parallela al corpo del ratto nella mano dominante, con la punta dell'ago rivolta verso l'alto e la bilancia della siringa rivolta verso lo sperimentatore, mantenere un angolo di circa 15° con la linea mediana del corpo del ratto. Inserire l'ago 0,5 cm sotto la tacca della clavicola (alla giunzione del terzo prossimale della clavicola e dello sterno), assicurandosi che l'ago rimanga parallelo al corpo del ratto (Figura 1J e Video 3).
NOTA: Prestare particolare attenzione all'angolo e alla profondità di inserimento dell'ago per evitare di perforare il vaso sanguigno o causare danni involontari ai vasi adiacenti. - Estrarre delicatamente la siringa per creare una pressione negativa, spesso accompagnata da una sensazione palpabile di rottura all'ingresso nel vaso sanguigno (particolarmente pronunciata durante il prelievo di sangue iniziale). Mantenere questa posizione e raccogliere 0,1-1,0 mL di sangue a velocità costante secondo necessità (seguendo le linee guida IACUC di circa 4-5,3 mL/kg di sangue a settimana1) (Figura 1K e Video 3).
- Se non c'è sangue durante la puntura, provare a regolare delicatamente l'angolazione e la profondità dell'ago o ruotare delicatamente la siringa (Video 3). Se tre tentativi consecutivi sullo stesso lato non hanno successo, interrompere tutte le emorragie e poi passare al lato opposto per la puntura.
NOTA: Si consiglia una rapida puntura attraverso la pelle per evitare che il ratto si dibatta a causa del disagio. - Applicare un batuffolo di cotone per l'emostasi e riportare il ratto nella sua gabbia (Video 4).
- Elaborare i campioni di sangue in base ai requisiti sperimentali.
3. Elaborazione del campione di sangue
- Smaltire l'ago della siringa in un contenitore per oggetti taglienti. Trasferire il sangue raccolto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL precedentemente risciacquata con eparina. Mettere la provetta in una centrifuga, impostandola a 4 °C e 1.200 x g, e centrifugare per 10 minuti per separare il plasma. Trasferire il siero utilizzando una pipetta Pasteur da 1,0 mL in una provetta per microcentrifuga pulita e conservarlo a -80 °C.
NOTA: Per prevenire l'emolisi dovuta alla pressione, rimuovere la punta dell'ago quando necessario. Durante l'aspirazione del plasma, evitare di prelevare le cellule del sangue dal fondo della provetta. Occasionalmente, la superficie della siringa potrebbe raccogliere pelo di ratto; Fare attenzione a non far entrare il pelo nel tubo, poiché può portare alla coagulazione.
4. Analisi statistica
- Presentare tutti i dati come media ± deviazione standard e testarli per l'omogeneità della varianza.
- Usa il test esatto di Fisher per confrontare le percentuali di successo tra i gruppi.
- Utilizzare un test t indipendente a due campioni per confrontare le medie complessive tra i due gruppi.
- Utilizzare l'analisi della varianza (ANOVA) per misurazioni continue come il tempo di prelievo del sangue, il peso corporeo, l'assunzione di cibo e il consumo di acqua. Si consideri statisticamente significativo P < 0,05.
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Representative Results
I campioni di plasma di alta qualità mostrano una tonalità giallo pallido, chiarezza e trasparenza, privi di qualsiasi sfumatura rossa o coagulazione, come illustrato nella Figura 2A. La Figura 2B mostra rispettivamente l'emolisi (lato sinistro) o la coagulazione (lato destro) a causa di procedure improprie. Nel corso di 96 sessioni di raccolta del sangue in 4 giorni, i tempi medi di prelievo di sangue singolo per i gruppi A e B sono stati rispettivamente di 119,87 ± 33,62 s e di 123,28 ± 30,96 s. Non c'è stata alcuna differenza significativa nei tempi di raccolta del sangue tra i due gruppi su base giornaliera (t = 0,66, P = 0,54, Tabella 1). I tempi di prelievo del sangue individuale più brevi sono stati rispettivamente di 78 s e 89 s.
Il numero medio di tentativi necessari per il successo di un singolo prelievo di sangue è stato di 1,21 e 1,17 rispettivamente per i gruppi A e B. Non c'è stata alcuna differenza significativa nel numero di tentativi tra i due gruppi (t = 0,58, P = 0,60, Tabella 2). Le percentuali di successo complessive sono state del 93,8% (45/48) e del 95,8% (46/48) rispettivamente per i gruppi A e B, senza differenze significative nelle percentuali di successo complessive tra i due gruppi (P > 0,05, Tabella 1). Non c'è stata alcuna differenza significativa nel tempo di raccolta del sangue nel gruppo B in ogni momento. Nel gruppo A, il tempo di raccolta del sangue il secondo giorno è stato inferiore a quello del quarto giorno (105,75 ± 14,22 s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabella 1) A questo punto, Inoltre, un maggior numero di tentativi e tempi di foratura più lunghi spesso indicano tassi di guasto più elevati (Figura 3A-C). Il terzo giorno, il gruppo B ha riscontrato un fallimento attribuito all'emolisi. Il quarto giorno, il gruppo A ha riscontrato tre fallimenti: uno a causa dell'emolisi e gli altri due a causa dell'impossibilità di ottenere campioni di sangue. Anche il gruppo B ha avuto un fallimento a causa dell'impossibilità di ottenere un campione di sangue.
Nel corso di 4 giorni consecutivi di osservazione, entrambi i gruppi di ratti hanno mostrato un aumento di peso costante. L'assunzione di acqua e cibo è rimasta relativamente costante tra i ratti dello stesso sesso. Durante l'intero processo di raccolta del sangue, non ci sono stati casi di mortalità nei ratti, né sono state osservate complicanze significative, come fratture della clavicola, pneumotorace o ematomi nel sito di puntura (Figura 3D-F e Tabella 3).
Figura 1: Metodi di fissazione e raccolta del sangue della vena succlavia nei ratti. (A-H) Manipolazione della fissazione; (I) ubicazione della clavicola e del sito di raccolta del sangue; (J-L) il processo di raccolta del sangue e l'emostasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Campioni di sangue raccolti con successo e senza successo. (A) Campioni di sangue tipici e plasma isolato; (B) campioni di sangue emolizzato (a sinistra) e coagulato (a destra) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione dell'efficacia e della sicurezza del prelievo di sangue. (A) Tempo medio di raccolta del sangue al giorno; (B) numero medio di forature al giorno; (C) le percentuali di successo e fallimento della raccolta di sangue in entrambi i gruppi; (D-F) cambiamenti nel peso corporeo, nell'assunzione di cibo e nell'assunzione di acqua durante la raccolta del sangue in entrambi i gruppi di ratti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Anatomia dei vasi del collo di ratto. (A) Strutture anatomiche superficiali; (B) strutture anatomiche profonde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppo | Ore | Tempo medio di raccolta del sangue (s) | |||
| Giorno 1 | Giorno 2* | Giorno 3 | Giorno 4 | ||
| Un | Ore 10:00 | 92,83 ± 7,38 | 100.5 ± 17.36 | 117.83 ± 12.02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 108.67 ± 10.86 | 111.00 ± 6.95 | 158.33 ± 60.47 | 142.40 ± 25.96 | |
| Tempo medio | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Tasso di successo | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Percentuale di successo complessiva | 93.8% (45/48) | ||||
| Tempo medio complessivo | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | Ore 10:00 | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Tempo medio | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157.27 ± 39.63 | |
| Tasso di successo | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Percentuale di successo complessiva | 95.8% (46/48) | ||||
| Tempo medio complessivo | 123.28 ± 30.96 | ||||
Tabella 1: Tempi di prelievo del sangue e tassi di successo dei due gruppi di ratti. *Il tempo di raccolta del sangue del secondo giorno è stato inferiore a quello del quarto giorno nel gruppo A (t = 12,39 P < 0,01).
| Gruppo | Ore | Numero medio di forature | |||
| Giorno 1 | Giorno 2 | Giorno 3 | Giorno 4 | ||
| Un | Ore 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Nella media | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Media complessiva | 1.21 | ||||
| B | Ore 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Nella media | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Media complessiva | 1.17 | ||||
Tabella 2: Numero medio di punture per il prelievo di sangue nei ratti.
| Genere | Gruppo | Peso (g) | Assunzione di cibo (g) | Assunzione d'acqua (g) | |||||||||
| Giorno 1 | Giorno 2 | Giorno 3 | Giorno 4 | Giorno 1 | Giorno 2 | Giorno 3 | Giorno 4 | Giorno 1 | Giorno 2 | Giorno 3 | Giorno 4 | ||
| ♀ | Un | 260 ± 7.5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5,4 | 278 ± 6.5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7.0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| T/Q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Valore P rettificato | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | Un | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14,2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26.9 ± 1.0 | 25,3 ± 1,1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Valore P rettificato | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabella 3: Cambiamenti nel peso corporeo giornaliero, nell'assunzione di cibo e nell'assunzione di acqua dei ratti.
Video 1: Calmare e gestire i ratti. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Procedure di contenzione per i ratti. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: La procedura di prelievo del sangue per i ratti. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 4: Compressione emostatica nel sito di puntura. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Sebbene la raccolta del sangue della vena caudale sia il metodo più comune per il prelievo ripetuto di sangue nei ratti, potrebbe essere influenzata dai farmaci anestetici e, a causa delle piccole dimensioni della vena caudale, la quantità di sangue che può essere raccolta in un singolo caso è limitata, portando a una maggiore durata della raccolta del sangue 4,5. Sebbene i sistemi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa tandem (MS/MS) combinati con il microcampionamento capillare (CMS) delle vene caudali dei ratti possano ridurre la quantità di sangue utilizzata nei ratti11, non tutti gli istituti sono dotati di queste costose apparecchiature. Il prelievo di sangue dal plesso/seno retrobulbare spesso provoca ansia e dolore nei ratti e un funzionamento improprio può persino danneggiare la vista e la salute dei ratti. Pertanto, questo metodo non è raccomandato per il prelievo di sangue nei ratti9.
La vena succlavia si trova tra il grande pettorale e il muscolo deltoide del ratto e drena nella vena giugulare a un terzo della clavicola interna (Figura 4). Nello studio di Yang et al., il tasso di successo della raccolta di sangue dalla vena succlavia nei ratti in anestesia è stato di circa il 90% da parte di un operatore esperto, il cui tempo minimo dall'inizio alla fine della puntura è stato di 65 s7. Nello studio di Wang et al., sono stati raccolti campioni di sangue dalla vena succlavia del ratto utilizzando un approccio verticale. Sebbene il loro metodo non prevedesse l'anestesia, richiedeva la collaborazione di due individui per limitare in modo sicuro il ratto6. Questo protocollo di studio mostra un buon vantaggio della raccolta del sangue. Questo protocollo non richiede dispositivi di contenzione speciali o strutture per l'anestesia. Con una corretta manipolazione, i ratti generalmente mostrano una resistenza minima. Il tempo mediano dalla contenzione del ratto al completamento della raccolta del sangue è stato di soli 2 minuti, raggiungendo un impressionante tasso di successo complessivo del 95%. Questo metodo consente di risparmiare notevolmente le risorse umane e riduce il tempo necessario per la raccolta del sangue. Inoltre, i campioni di plasma ottenuti sono chiari e trasparenti, con un'incidenza minima di emolisi ed eventi di coagulazione, riducendo così al minimo la ripetizione dell'esperimento. La competenza in questa tecnica è particolarmente preziosa per la gestione di esperimenti di farmacocinetica e tossicologia su larga scala che richiedono una raccolta ripetitiva del sangue.
Nel nostro studio, l'evento principale di fallimento del prelievo di sangue è stato il giorno 4, che potrebbe essere correlato al danno venoso causato da punture ripetute. Punture ripetute possono portare a danni della parete vascolare e provocare una risposta infiammatoria, causando l'ispessimento e l'indurimento della parete vascolare e persino indurre il restringimento vascolare. Se l'emostasi è inadeguata dopo la puntura, il sangue stravasato può causare ulteriore edema e infiammazione dei tessuti, portando successivamente alla formazione di tessuto cicatriziale. Questi tessuti cicatriziali sono difficili da penetrare e possono anche tirare e causare lo spostamento della posizione dei vasi sanguigni, il che rende i vasi sanguigni più difficili da individuare e perforare. Nel nostro studio, è stata utilizzata una siringa da 26 G (0,45 mm) per la raccolta del sangue, che va bene rispetto alle vene umane ma provoca comunque danni considerevoli alle vene dei ratti. Ciò è evidenziato dalla chiara sensazione di penetrazione quando l'ago passa attraverso il vaso durante il primo prelievo di sangue, che diminuisce all'aumentare del numero di prelievi di sangue, con tempi di raccolta del sangue più lunghi e tassi di fallimento più elevati. Pertanto, si consiglia di utilizzare un ago da insulina più fine per la raccolta del sangue e di applicare una pressione adeguata dopo la raccolta del sangue per prevenire la formazione di ematomi e di eseguire prelievi di sangue alternati per consentire una riparazione venosa sufficiente. Nella nostra esperienza, un flebotomo ben addestrato può utilizzare un ago 26G per prelevare alternativamente il sangue dalle vene succlavia bilaterali dello stesso ratto 8-10 volte nell'arco di 24 ore, con un intervallo medio di 2-3 ore tra ogni prelievo di sangue. Tuttavia, il numero massimo di prelievi di sangue che un ratto può tollerare, il periodo di recupero e il ciclo di prelievo di sangue possono essere influenzati dal calibro dell'ago utilizzato, dagli intervalli di prelievo di sangue richiesti da diversi esperimenti e dalla competenza del flebotomo. Questi fattori devono essere ulteriormente esplorati nella ricerca futura. Per il prelievo intensivo di sangue necessario per gli esperimenti di farmacocinetica, è meglio raccogliere alternativamente il sangue dalle vene succlavia sinistra e destra. Nei casi in cui non sia veramente disponibile, possono essere integrati altri metodi di raccolta del sangue.
Il peso corporeo, il consumo di acqua e l'assunzione di cibo sono gli indicatori più basilari e diretti per valutare lo stato di salute dei ratti16. Un primo studio aveva dimostrato che la raccolta di sangue attraverso la vena giugulare inferiore a 0,9 ml al giorno non influenzava l'emodinamica dei ratti e non comportava alcuna perdita di peso significativa. Tuttavia, quando la raccolta di sangue supera 1,5 ml, può portare alla perdita di peso17. Nello studio di Yokoya et al., il microcampionamento ripetuto dalla vena giugulare (50 μL ogni volta, 6-7 volte entro 24 ore) non ha influenzato il peso corporeo del ratto o l'assunzione di cibo10. Inoltre, il modo in cui viene raccolta il sangue può influenzare il peso corporeo e l'assunzione di cibo dei ratti. In uno studio precedente che utilizzava la raccolta di sangue venoso sublinguale, una raccolta di 24 ore di 0,5-1,0 mL di sangue il primo giorno ha portato a una riduzione del peso corporeo del ratto e a una diminuzione dell'assunzione di cibo, sebbene la perdita di peso non fosse significativa18. In questo studio, il peso corporeo dei ratti è aumentato costantemente durante il periodo di raccolta del sangue e non ci sono stati cambiamenti significativi nell'assunzione di cibo e acqua, complicazioni legate alla raccolta del sangue e morte dei ratti, indicando che questo metodo è sicuro e affidabile.
È fondamentale sottolineare che l'acclimatazione dei ratti al processo di contenzione prima di eseguire la raccolta del sangue probabilmente ridurrà lo stress nel ratto e migliorerà il tasso di successo della raccolta del sangue. Una fissazione inadeguata e un'esposizione insufficiente delle vene possono portare a fallimenti della raccolta del sangue e persino causare la rottura locale della vena a causa del dolore dei ratti. Nei casi più lievi, ciò potrebbe causare evidenti ematomi sottocutanei, mentre nei casi più gravi potrebbe portare alla morte dei ratti. Inoltre, una scarsa fissazione potrebbe portare alla fuga dei ratti e causare danni alle persone. Pertanto, si consiglia vivamente di padroneggiare a fondo la tecnica di manipolazione prima di procedere con la procedura di raccolta del sangue. Inoltre, è importante essere cauti con la forza applicata per ruotare verso l'esterno l'articolazione della spalla, poiché una pressione eccessiva potrebbe portare a fratture della clavicola nel ratto.
Un limite di questo studio è che non abbiamo valutato sistematicamente i cambiamenti nello stress indotto da questo metodo di raccolta del sangue nei ratti misurando i cambiamenti nel livello di corticosterone o monitorando a bordo gabbia, che deve essere esplorato nella ricerca futura. Un'altra limitazione di questo articolo è l'assenza di metodi alternativi di raccolta del sangue come controllo. I confronti con altri metodi di raccolta del sangue per i loro vantaggi e svantaggi saranno affrontati nella ricerca futura. Nel complesso, questo studio introduce un metodo per la raccolta di sangue da una sola persona dai ratti senza la necessità di anestesia. Questo approccio offre un mezzo semplice, rapido e sicuro per ottenere campioni di sangue dai ratti.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari o non finanziari rilevanti da divulgare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Cuiying Plan Project del Secondo Ospedale dell'Università di Lanzhou (Grant No. PR0121015) e il Laboratorio Chiave Provinciale del Gansu per la Ricerca sulle Malattie del Sistema Urinario (Grant No. 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
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In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
